Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseum Binding Assay die de penetratie van drugs in tuberculose-lesingen voorspelt

Samenvatting

Hier beschrijven we een werkwijze snel evenwicht dialyse (RED) drug binding aan ca- seum longtuberculose laesies en holtes meten. Het protocol wordt ook gebruikt met een schuimige-macrofaag afgeleide matrix met een effectieve surrogaat voor ca- seum.

Samenvatting

De uitroeiing van de ziekte van tuberculose vereist geneesmiddelenregimes die de veelvoudige lagen van complexe pulmonale letsels kunnen binnendringen. Drugsverdeling in de caseous kernen van holtes en laesies is vooral cruciaal omdat ze subpopulaties van drugstolerante bacteriën bezitten, ook vaak aangeduid als persisters. Bestaande methoden voor de meting van drugspenetratie bij tuberculose-laesies zijn kostbare en tijdrovende in vivo farmacokinetische studies gekoppeld aan bioanalytische of imaging technieken. De in vitro meting van drug binding aan caseum macromoleculen werd voorgesteld als een alternatief voor dergelijke technieken, aangezien deze binding de passieve diffusie van geneesmiddelmoleculen door caseum verhindert. Snelle evenwichtsdialyse is een snel en betrouwbaar systeem voor het uitvoeren van plasma-eiwit- en weefselbindingstudies. In dit protocol gebruikten we een snelle equilibrium dialysis (RED) -apparaat om bindend te zijn aan homogenaten van caseum dat excis isUit de laesies en holtes van tuberculose-geïnfecteerde konijnen. Het protocol beschrijft ook hoe u een surrogaatmatrix wilt genereren uit lipide geladen THP-1 macrofagen om in plaats van caseum te gebruiken. Deze caseum / surrogaatbindingstest is een belangrijk hulpmiddel bij het ontdekken van tuberculose-geneesmiddelen en kan aangepast worden om de verspreiding van geneesmiddelen bij letsels of abscesses die door andere aandoeningen worden veroorzaakt, te helpen bestuderen.

Inleiding

De behandeling van pulmonale tuberculose ziekte vereist effectieve verdeling van geneesmiddelen in verschillende soorten laesies. Necrotische laesies en holtes bevatten caseous centra die subpopulaties van drugstolerante of 'aanhoudende' bacteriën bezitten. ^{1 , 2} De cavitusziekte is geassocieerd met minderwaardige geneeskracht en een slechte prognose. ^{3 , 4} Vorige studies hebben aangetoond dat met behulp van kwantitatieve en beeldvormende technieken de mogelijkheid om caseum te penetreren significant verschilt van de ene geneesmiddelklasse naar de andere. ^{5 , 6} Deze methoden vereisen echter het gebruik van dierlijke infectiemodellen die traag en vervelend zijn. Een in vitro test die geneesmiddelen bindt aan ex vivo caseum is ontworpen. Deze binding bleek omgekeerd te correleeren met drugpenetratie in caseous granulomas en is derhalveGebruikt als voorspellend hulpmiddel. ⁷

Evenwichtsdialyse wordt beschouwd als de gouden standaardbenadering voor plasma-eiwitbindende studies. De snelle equilibrium dialysis (RED) -inrichting biedt een snel, makkelijk te gebruiken en betrouwbaar systeem voor het uitvoeren van dergelijke analyses. ⁸ Het apparaat bestaat uit twee componenten: eenmalig gebruik, wegwerpinzetten bestaande uit 2 kamers gescheiden door een verticale cilinder van semi-doorlatend membraan; En herbruikbare basisplaten die maximaal 48 inzetstukken tegelijk kunnen bevatten. Het dialysemembraan heeft een afscheiding van 8 kDa molecuulgewicht (MWCO) dat ideaal is voor drug-macromolecule bindingsstudies. De hoge oppervlakte-volume verhouding van het membraancompartiment zorgt voor snelle dialyse en evenwicht. Zowel de inzetstukken als de basisplaat zijn gevalideerd voor minimale niet-specifieke binding. De combinatie van het RED-apparaat met bioanalytische technieken zorgt voor nauwkeurige schattingen van de ongebonden fracties van geneesmiddelen in pLasma. ^{8 , 9}

Hoewel oorspronkelijk ontworpen om plasma-eiwitbinding te meten, is het RED-apparaat gebruikt in verschillende weefselbindende studies waarbij gebruik wordt gemaakt van homogenaten. ^{10 , 11} In dit protocol, we meten bindmiddel aan caseum, de necrotische vuilnis uitgesneden uit de necrotische laesies en holtes van tuberculose-geïnfecteerde konijnen. De acellulaire en non-vasculaire aard van caseous materiaal maakt het gemakkelijk homogeniseren in een homogene suspensie die compatibel is met de test.

Aangezien dat caseum vervelend is om te produceren en moeilijk te verkrijgen is, is het protocol ook gevalideerd voor gebruik met een surrogaatmatrix die uit schuimige macrofagen wordt bereid. THP-1 monocyt-afgeleide macrofagen worden geïnduceerd met oliezuur om meerdere lipide lichamen op te halen die hen hun 'schuimige' uitstraling geven. Deze lipide geladen cellen worden geoogst enVerwerkt om een ​​matrix te produceren die we als surrogaat gebruiken voor caseum. Deze studie heeft aangetoond dat drug binding aan deze surrogaatmatrix goed corrigeert met binding aan caseum, effectief nabootsen van het in vivo proces dat de penetratie van drugs in de caseous kern van granulomen en holtes belemmert.

Protocol

Alle dierstudies werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren van de nationale instituten van gezondheid, met goedkeuring van het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee van de NIAID (NIH), Bethesda, MD. Alle studies met betrekking tot M. tuberculose werden uitgevoerd in een laboratorium met bioveiligheidsbeperkingsniveau 3 (BSL-3).

1. Konijn Infectie Model en Caseum Collection

1. Infectie Nieuw- Zeelandse witte konijnen met M. tuberculose met gebruik van een blootstellingssysteem met uitsluitend aerosolbestrijding zoals eerder beschreven. ^{12 , 13} Laat de infectie gedurende 12-16 weken vooruit. Verplaats de konijnen met 35 mg / kg ketamine en 5 mg / kg xylazine intramusculair, euthaniseer de konijnen met 0,2 ml / kg pentobarbitalnatrium en fenytoïne-natrium intraveneus en ga verder met de necropsieën.
2. Met behulp van tweezers en een scalpel, verwijder de longen van de borst ca.viteit. Ontleed afzonderlijke holtes en grote necrotische granulomen met behulp van een scalpel uit elke longlap. Schraap het caseum voorzichtig uit de holte en de granulomuren. Weeg, op te nemen en op te slaan monsters in 2 ml schroefbuisjes bij -20 ° C tot klaar voor gebruik.
3. Gamma-bestraling de infectieuze caseummonsters op 3 MegaRad op droogijs om ze onfectief en veilig te maken voor gebruik in een BSL-2 lab.

2. In Vitro Generatie van Caseum Surrogaat van THP-1 Cells

1. Groei THP-1 monocyten in RPMI 1640 medium (2 mM L-glutamine en 10% foetaal runder serum) in T175 celkweekflessen (80 ml / fles). Incubeer de flessen in een 5% CO ₂ atmosfeer bij 37 ° C gedurende 3-4 dagen.
2. Centrifugeer de cultuur van een T175 fles in twee 50 ml conische buizen bij 150 xg gedurende 5 minuten. Gooi de supernatant weg en schuif de pellet in 10 ml RPMI 1640 media.
3. Pipetteer 5 μl van deze cultuur in een 1,5 ml buis die 45 μl t bevatRypan blauw. Meng grondig door pipettering. Draag 10 μL over naar een hemocytometer en tel het aantal levensvatbare THP-1 monocyten (onbeschadigd) met een lichtmicroscoop (10X vergroting). Bereken het aantal levensvatbare cellen per ml van de cultuur. Verdun het met RPMI media tot de uiteindelijke dichtheid van 1,25 x 106 cellen / ml.
4. Laad 40 ml van de kweek op een grote celcultuurplaat (50 x 106 cellen / plaat). Voeg 40 μl 100 μM PMA (phorbol 12-myristaat13-acetaat bereid in ethanol) toe en laat cellen overnachten in de incubator.
   OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van PMA is 100 nM.
5. Verdun pure oliezuur (OA) (0,89 g / ml) in ethanol tot de concentratie van 0,1 M ( dwz 31,7 μL OA in 968,3 μL ethanol). Verdun deze oplossing in vers voorverwarmd RMPI media tot een concentratie van 10 mM. Verdun deze OA-suspensie naar 0,4 mM (eindwerkende concentratie) in RPMI-medium, vooraf verwarmd tot 37 ° C.
6. Verwijder de bestaande media en niet-adherende cellen uit de celkweekplaten en voeg 40 ml 0,4 mM OA zachtjes toe aan de THP-1 macrofagen (THP-M). Incubeer bij 37 ° C in de incubator overnacht.
7. Gebruik een lichtmicroscoop bij 40x vergroting om de aanwezigheid van talrijke lipide-lichaamsinsluitingen in elke THP-M visueel te bevestigen. Verwijder al het RPMI-medium uit de celkweekplaten en wacht de bijtende cellen tweemaal met fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van een serologische pipet van 50 ml.
   OPMERKING: Lipide lichamen verschijnen als kleine, heldere, bolvormige structuren in het cytoplasma van de THP-M.
8. Voeg 40 ml 5 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) in PBS toe aan elke plaat. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
9. Verwijder de schuimige macrofagen (FM) door herhaaldelijk op en neer op de oppervlakte van de gehele plaat te pipetteren met behulp van een 10 ml serologische pipet. Zet de celsuspensie over in een 50 ml conische buis en draai gedurende 5 minuten op 150 xg.
10. Resuspendeer de celpellet in 10 ml PBS (derde PBS was) aNd overdracht naar een voorgewogen 15 ml kegelbuizen. Spin opnieuw af bij 150 xg gedurende 5 minuten. Zuig de supernatant zorgvuldig door met behulp van een serologische pipet en weggooi.
11. Onderwerp de FM pellets op 3 vries-ontdooi cycli om de cellen te lichten en incubeer hen gedurende 20-30 minuten bij 75 ° C om eiwitten in de matrix te denatureren. Bewaar de pellets bij -20 ° C tot het klaar is voor gebruik.

3. Rapid Equilibration Dialysis (RED) Assay

1. Bereid 10 mM voorraadoplossingen van alle testverbindingen in dimethylsulfoxide (DMSO) op. Verdun op 500 μM werkoplossingen in DMSO voorafgaand aan elke test.
2. Weeg de buis die de caseum surrogaatpellet bevat. Trek het gewicht van de lege buis af om het gewicht van de pellet alleen te kunnen afleiden. Voeg 2-3 metalen kralen per buis toe en gebruik een weefselhomogenisator bij 1,200 stromen / min gedurende 1 minuut, verstoord caseum of de surrogaatmatrix in PBS (1: 9 w / v) om 10x verdunde suspensie van elke matrix te verkrijgen.
3. Spike 6.5 μL van de 500ΜM oplossing van de testverbinding in 643,5 μl van het homogenaat om de uiteindelijke concentratie van 5 μM (≤1% DMSO) en vortex te bereiken.
4. Plaats de RODE inzetstukken in de basisplaat. Voeg 200 μL van de drugspikmatrix in de donorkamer (rode ring) van elk ROOD-inzetstuk en 350 μl PBS in elke ontvangerkamer. Bereid 3 inserts voor elke testverbinding (drievoudige monsters) op. Afdichtingsplaat met een kleefplaatafdichting en incuberen bij 37 ° C op de thermomixer bij 200 rpm (1 xg) gedurende 4 uur.
5. Na de incubatie meng de inhoud van de donor- en ontvangerkamers zachtjes door 2-3 keer op en neer te pipetteren. Pipetteer 20 μl aliquots van homogenaat uit de donorkamers en voeg toe aan 20 μl schone PBS in een 1,5 ml buis (1: 1). Op dezelfde manier pipetteer 20 μl alikvoten PBS-monsters uit de ontvangerkamers en voeg 20 μL schoon homogenaat toe (matrix matching). ⁸
   OPMERKING: Matrix-matching elimineert de neEd voor 2 afzonderlijke kalibratiekrommen (in homogenaat en PBS) voor kwantitatieve analyse. Inhoud van de donorkamer kan in de loop der tijd sedimenten. Meng de inhoud voorzichtig door pipettering voordat u de porties verwijdert.

4. LC-MS Kwantificering en Data Analysis

1. Voeg 160 μl 1: 1 methanol: acetonitril met 500 ng / ml diclofenac of 10 ng / ml verapamil (interne standaard) toe aan elke buis en vortex om eiwitten te precipiteren. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 5 minuten om het neerslag te sedimenteren en supernatanten over te brengen in 96-putjes diepe putten voor vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LCMS) analyse. ⁷
2. Calibratiekrommen van 1-1.000 nM opbouwen voor elke testverbinding, terwijl dezelfde matrixsamenstelling als bovenstaande monsters wordt gehouden. Kwantificeer de concentratie van de testverbinding in monsters van de donor- en ontvangerkamers met behulp van een LC-MS-methode.
3. Bereken de ongebonden fractie ( f _u ) oF het geneesmiddel in verdunde matrix met behulp van vergelijking 1. Bereken de _fu in onverdunde matrix met behulp van vergelijking 2 ( D = verdunningsfactor van 10). ¹⁴
   
   
4. Controleer het herstel (massasaldo) van elke verbinding met behulp van vergelijking 3 om verbindingen te identificeren met stabiliteit / metabolisme / niet-specifieke bindingsproblemen.
   OPMERKING: Het herstel valt meestal tussen 70% en 130%. ¹⁵
   

Resultaten

Met behulp van dit protocol, hebben we honderden van tuberculose de ontwikkeling van geneesmiddelen verbindingen getest op hun voorspelde efficiëntie op indringende geworden ca- seum. Figuur 1 visualiseert de basisconcepten van de RED assay. Het dialysemembraan van de RED inzetstukken maakt ongebonden kleine moleculen diffunderen van de donor en de ontvanger goed uiteindelijk bereiken van een evenwicht tussen beide compartimenten. Kleine moleculen die zijn gebonden aan m...

Discussie

Pulmonale necrotische letsels en holtes bij tuberculose-geïnfecteerde patiënten bevatten subpopulaties van bacteriën die onaantrekkelijk zijn voor de behandeling van geneesmiddelen. De caseous kernen van deze structuren zijn in het bijzonder verantwoordelijk voor het inhuren van deze persisten in een extracellulaire omgeving. ¹⁶ Gunstige verdeling van antibacteriële middelen in deze afgelegen locaties wordt geacht een belangrijke determinant van de werkzaamheid van tuberculose drugs te zijn. Voor...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
New Zealand White Rabbits	Covance	-
HN878 Mycobacterium tuberculosis	BEI Resources	NR-13647
Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N	Henry Schein Animal Health	56344
Anased (Xylazine) 100 mg/mL	Henry Schein Animal Health	33198
Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution	Virbac	710101
THP-1 monocytic cell line	ATCC	ATCC TIB-202
175 cm² TC-Treated Flask (T175)	Fisher Scientific	T-3400-175
RPMI 1640 media w/o glutamine	Fisher Scientific	MT-15-040-CV
Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated	Fisher Scientific	SH3091003IR
Hyclone L-glutamine, 200 mM	Fisher Scientific	SH3003401
Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, vented	Fisher Scientific	T-2881-1
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Fisher Scientific	BP685-1
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	E6758
Oleic acid	Fisher Scientific	ICN15178101
Pierce RED Device Reusable Base Plate	Fisher Scientific	PI-89811
Pierce RED Device Inserts, 50/box	Fisher Scientific	PI-89809
Pierce RED insert removal tool	Fisher Scientific	89812
Adhesive plate seal	Fisher Scientific	08-408-240
PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco)	Life Technologies	10010-049
DMSO	Sigma	472301
Acetonitrile	Sigma	34998
Methanol	Sigma	34860
Verapamil hydrochloride	Sigma	V4629
Diclofenac sodium salt	Sigma	93484
Trypan Blue Solution, 0.4%	Fisher Scientific	15-250-061
Ethanol, 200 proof	Fisher Scientific	04-355-451
2010 Geno/Grinder	SPEX SamplePrep	2010
Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads	Fisher Scientific	15-340-158
484R Cobalt 60 Irradiator	JL Shepard	7810-484-1
INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers	Fisher Scientific	22-600-100
Upright Light Microscope	Leica	DM1000
Binary Liquid Chromatography system	Agilent	1260	Multi-compenent
Mass spectrometer	AB Sciex	4000