Methodenartikel

voorbereiding en In Vitro Karakterisering van Magnetische miR-gemodificeerde endotheelcellen

DOI:

10.3791/55567

⸱

2 mei 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 2Physikalisch-Technische Bundesanstalt, 3Department of Radiology and Neuroradiology, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 4Electron Microscopy Center, University of Rostock

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit manuscript beschrijft de efficiënte, niet-virale aflevering van miR aan endotheelcellen door een PEI / MNP vector en de magnetisatie. Dus behalve genetische modificatie, deze benadering voor magnetische cellen leiding en MRI detecteerbaarheid. De techniek kan worden gebruikt om de kenmerken van de therapeutische cel producten te verbeteren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tot op heden, de beschikbare chirurgische en farmacologische behandelingen voor hart- en vaatziekten (HVZ) zijn beperkt en vaak palliatieve. Tegelijkertijd, gentherapie, celtherapie zijn veelbelovende alternatieve benaderingen voor CVD behandeling. Echter, de brede klinische toepassing van gentherapie sterk beperkt door het gebrek aan geschikte gen-afgiftesystemen. De ontwikkeling van geschikte genafleveringsvectoren kan een oplossing voor de huidige problemen in cel therapie. Met name bestaande nadelen, zoals beperkte efficiëntie en lage retentietijd van cellen in het beschadigde orgaan, kunnen worden overwonnen door geschikte cel techniek (dwz genetische) vóór transplantatie. De gepresenteerde protocol beschrijft een efficiënte en veilige tijdelijke modificatie van endotheelcellen behulp polyethyleenimine superparamagnetische magnetische nanodeeltjes (PEI / MNP) gebaseerde afleverende vector. Ook het algoritme en werkwijzen voor cellulaire karakterisatie gedefinieerd. De succesvolle intracellular levering van microRNA (miR) in humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) is verwezenlijkt zonder dat cellevensvatbaarheid, functionaliteit of intercellulaire communicatie. Bovendien werd deze aanpak blijkt een sterke functionele effect geïntroduceerde exogene miR veroorzaken. Belangrijk is dat de toepassing van deze MNP-gebaseerde vector verzekert cel magnetisatie, met bijbehorende mogelijkheden magnetische targeting en niet-invasieve MRI tracing. Dit kan als basis voor het magnetisch geleid genetisch gemanipuleerde cellen therapeutica die niet-invasief kan worden gevolgd met MRI te verschaffen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gene en celtherapie zijn krachtige instrumenten die de potentie heeft om de huidige uitdagingen in de CVD behandeling op te lossen hebben. Ondanks het feit dat beide benaderingen worden momenteel getest in klinische studies, zijn ze nog niet klaar voor brede klinische toepassing 1. Met name een gemeenschappelijke benadering van de uitdagingen van gen- en celtherapie te pakken is om multifunctionele genafgifte vectoren die geschikt zijn voor klinische toepassing te ontwikkelen. Het gebrek aan veilige en efficiënte genafgifte systemen is de belangrijkste zorg van gentherapie. Tegelijkertijd, de genetische manipulatie van cellulaire producten voorafgaand aan transplantatie de grote uitdagingen van celtherapie, zoals lage efficiëntie (bijvoorbeeld in het cardiale gebied slechts ~ 5% functionele verbetering wordt bereikt na stamceltransplantatie 1 kon overwinnen ) en slechte retentie / implantatie op de plaats van letsel (dat wil zeggen, daalt celretentie dan 5-10% binnen minuten tot uren post-toepassing, ongeacht de toedieningsweg 2, 3, 4).

Tot op heden virale vectoren aanzienlijk overschrijdt niet-virale systemen qua efficiëntie, wat heeft geleid tot bredere toepassing in klinische trials (~ 67%) 5. Echter, virale vehikels dragen ernstige risico's, zoals immunogeniteit (en de daaropvolgende ontstekingsreactie met ernstige complicaties), oncogeniciteit, en beperkingen van de omvang van de uitgevoerde genetisch materiaal 6. Vanwege deze veiligheidsproblemen en de hoge kosten van virale vectorproductie, het gebruik van niet-virale systemen de voorkeur in bepaalde gevallen 7, 8. Het is bijzonder geschikt voor kwalen die transiënte genetische correctie vereisen, zoals de expressie van groeifactoren regelen van angiogenese (bijvoorbeeld voor CVD behandeling) of delivery van vaccins.

In onze groep werd een afgiftesysteem gemaakt door combineren van 25-kDa vertakte polyethyleenimine (PEI) en superparamagnetische ijzeroxide nanopartikels (MNP) gebonden door biotine-streptavidine interactie 9. Deze vector is een potentieel middel voor de genetische manipulatie van cellen, waardoor het gelijktijdig magnetisatie voorafgaand aan transplantatie. Laatstgenoemde vormt een basis voor magnetische geleiding / retentie, die bijzonder veelbelovend tegenwoordig geavanceerde magnetische targeting technieken met succes ontwikkeld 10. Bovendien is de resulterende magnetisch responsieve cellen hebben het potentieel om niet-invasief bewaakt door magnetische resonantie beeldvorming (MRI) of magnetische deeltjes imaging 11, 12.

Bij de PEI / MNP vector, polyamine zorgt nucleïnezuur condensatie en dus bescherming tegen verval factor s, vector internalisatie in cellen en endosomale ontsnappen 5. De MNP aanvulling op de eigenschappen van PEI, niet alleen qua magnetische geleiding, maar ook door het verminderen van de toxiciteit bekende PEI 7, 13, 14. Voorheen werden PEI / MNP vector eigenschappen qua afgifterendement (dwz pDNA en miRNA) en veiligheid bepalen door fibroblasten en menselijke mesenchymale stamcellen 15, 16.

In dit manuscript wordt een gedetailleerd protocol over de toepassing van PEI / MNP's voor het genereren van miRNA-gemodificeerde cellen 17 beschreven. Hiertoe worden gebruikt HUVECs en een gevestigd model voor in vitro angiogenese vertegenwoordigen. Ze zijn moeilijk te transfecteren en zijn gevoelig voor toxische invloed 18, 19,ass = "xref"> 20. Bovendien geven we een algoritme voor dergelijke cellen in vitro, waaronder het richten, intercellulaire communicatie en MRI detectie evalueren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Human navelstrengen voor mobiele isolatie werden postpartum verkregen van op de hoogte, gezonde vrouwen die hun schriftelijke toestemming voor het gebruik van dit materiaal voor onderzoek gaf in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. De ethische commissie van de Universiteit van Rostock heeft de gepresenteerde studie (reg. Nr A 2011 06, verlengde 23 september 2013) goedgekeurd.

1. Bereiding van transfectiecomplexen

  1. Biotinylering van polyethyleenimine (PEI).
    1. Dissolve vertakt PEI in ultrazuiver water onder magnetisch roeren bij 300-400 rpm gedurende 24 uur bij kamertemperatuur (RT) en beschermd tegen licht een 0,18 mM oplossing te verkrijgen. Bewaar de oplossing bij 4 ° C.
    2. Meet de concentratie van primaire aminogroepen in de verkregen oplossing 21, 22.
      1. Met 2% ninhydrine reagensoplossing als detectiereagens amine 23 door het mengen van 100 ui prediluted monster (1: 200 met ultrazuiver water) en 75 pi van ninhydrinereagens. Incubeer gedurende 30 minuten bij 80 ° C. Koel het neer en voeg 100 ul van 50% ethanol om te stabiliseren. Meet de absorptie bij 550 nm van de absorptie spectrofotometer.
      2. Een standaardcurve met behulp glycine.
        1. Bereid 0,1 M amino-N voorraadoplossing (0,75 g glycine in 100 ml gedeïoniseerd water) en de verdunningen 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1: 100, 1: 200 en 1: 400, 1: 600. Meet deze oplossingen zoals in stap 1.1.2.1 en een plot van de concentratie en absorptie op de assen.
        2. Op basis van de verkregen grafiek en de gemeten absorptie van de PEI-oplossing, definieert de concentratie van de α-aminogroepen in PEI.
          LET OP: Let op. Ninhydrine reagensoplossing worden uitsluitend onder de motorkap en onder stikstof worden bewaard. Het is niet bruikbaar wanneer de kleur van de oplossing verandert als gevolg van oxidatie.
    3. Los 100 mg biotine linker in ultrazuiver water onmiddellijk voor gebruik om een ​​0,01 mM oplossing te verkrijgen. Bereken de benodigde hoeveelheid biotine PEI te voegen door de concentratie van α-aminogroepen in PEI (gemeten in stap 1.1.2) te vermenigvuldigen met 20 de benodigde hoeveelheid te verkrijgen (in mol) biotinyleringsmiddel reagens.
      1. Voeg het biotine oplossing van het PEI oplossing bij pH 8-9 en incubeer gedurende 16 uur onder magnetisch roeren bij kamertemperatuur.
    4. Verwijder het gereageerde biotine door grootte-uitsluitingschromatografie 23. In de handel verkrijgbare kolommen met een gelfiltratie medium geschikt voor de zuivering van het 25-kDA PEI en de instructies van de fabrikant. Neem porties na zuivering de amineconcentratie meten met een amine detectiereagens (stap 1.1.2) en het biotine conjugatie efficiëntie (stap 1.2.2) te bepalen. Bewaar de verkregen gebiotinyleerd PEI bij 4 ° C.
  2. Karakterisering van gebiotinyleerde PEI.
    1. Het gehalte aan α-aminogroepen in PEI na biotinylering, zoals beschreven in stap 1.1.2.
    2. Bepaal de mate van PEI biotinylering aan de vervoeging procedure te controleren. Voor kwantificering, een in de handel verkrijgbare kit, die is gebaseerd op de toepassing van HABA kleurstof (4'-hydroxyazobenzene-2-carbonzuur), de juiste colorimetrische bepaling van de biotinylering niveaus 24, 25 te waarborgen. Volg de instructies van de fabrikant.
  3. Filtratie van MNP's en hun karakterisering.
    1. Filter de handel verkrijgbaar met streptavidine beklede MNP door een 0,45 urn spuit-aangedreven filter 16 om grotere toxische aggregaten sluiten. Meet de uiteindelijke ijzerconcentratie behulp van een standaard fotometrische bepaling 26.
    2. Onderzoek de kwaliteit van de gefilterde MNP door opnamede magnetisatie kromme en met TEM beeldvorming volgens standaard protocollen 27, 28.
      1. Verdun het MNP suspensie met gedestilleerd water en plaats 3 pl van de verkregen suspensie op een 300-mesh Formvar-koolstof beklede koperen rooster voor TEM analyse. Vervolgens zet dit raster op een glasplaatje op een verwarmingsplaat en laat het drogen.
      2. Analyseer het monster met een transmissie-elektronenmicroscoop bij 120 kV en elementaire inhoud te controleren met behulp van een röntgendetector 27.
  4. 3-color labeling van transfectiecomplexen voor superresolutietechnieken.
    1. Label 0,5% van de gemeten primaire aminogroepen in PEI met NHS-Ester Atto 488 kleurstof volgens de instructies van de fabrikant. Verwijdert de overmaat ongebonden kleurstof door grootte-uitsluitingschromatografie, zoals hierboven beschreven (stap 1.1.4) beschreven. Meten van de resulterende concentratie van aminogroepen met behulp van een ninhydrine assay (stap 1.1.2).
    2. Label commercieel verkrijgbaar gecodeerde miR (SCR-miR) met Cyanine5 kleurstof met een geschikte labeling kit 15 (aangeduid in het Materials List). Meet de resulterende fluorofoor-miR concentratie spectrofotometrisch.
    3. Vers labelen MNP telkens met biotine geconjugeerd kleurstof (bijvoorbeeld atto 565-biotine) bij een 1: 1000 w / w verhouding. Direct op de kleurstof na toevoeging van het MNP de miR / PEI tijdens de vorming van de transfectie complexen volgens de gegevens in Delyangina et al. 16.

2. Celbereiding

  1. HUVEC isolement.
    1. Isoleer cellen uit de navelstreng direct na het verkrijgen van de koorden via collagenase uit het inwendige van het koord ader; volgt een eerder ontwikkelde protocol 29.
      1. Incubeer elk koord bij -60 eenheden / ml collagenase type IV oplossing in buffer - in t geladenHij navelstrengader - bij 37 ° C gedurende 13 min.
    2. Voor alle experimenten, zwembad de HUVECs van een minimum van 5 patiënten.
      LET OP: De teelt mag niet meer dan 4-5 passages. Niet gebruikte cellen besmet met mycoplasma, omdat dit veroorzaakt een afname in transfectie-efficiëntie. Mycoplasma verontreiniging worden getest voordat het protocol met behulp van een PCR kit voor de zeer gevoelige detectie van mycoplasma.
      1. Test voor mycoplasma aanwezigheid.
        1. Centrifugeer 1 mi van celcultuur supernatant gedurende 10 min (13.000 x g). Suspendeer de pellet in 17 ul van dH 2 O en kookt (93 ° C) gedurende 3 min. Gebruik 2 pi van de suspensie aan het DNA amplificeren die codeert voor sterk geconserveerde ribosomale RNA (16S-rRNA) van verscheidene mycoplasma species.
        2. Voer de PCR met behulp van 10 pmol van elke primer (forward primer: 5'-CTGACGACAACCATGCACCATCTGTC-3 ', reverse primer: 5'-GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3') in combinatie met een commerciële kit PCR onder de volgende omstandigheden: 94 ° C gedurende 3 min; 45 cycli van 94 ° C gedurende 30 s, 50 ° C gedurende 30 s en 72 ° C gedurende 30 s; en een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10 minuten.
        3. Analyse van het PCR product (292 bp) met behulp van agarosegelelektroforese.
    3. Ofwel opslaan van de verkregen cellen op lange termijn in vloeibare stikstof of kweek ze in het endotheel groeimedium aangevuld met 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine bij 37 ° C in een bevochtiger ceerde atmosfeer met 5% CO2.
  2. HUVEC karakterisering.
    1. Karakteriseren geïsoleerd HUVECs wat betreft hun functionele vermogen om buizen in de basaalmembraan matrix (bv Matrigel) bouwen en de expressie van de endotheliale merker CD31 (bloedplaatje endotheliale celadhesiemolecule, PECAM-1) volgens standaardprotocollen 30, 31.

3. Transfectie

  1. Trypsinize de voorraad HUVEC cultuur (zie stap 4.1.2.) En handmatig de cellen met behulp van een hemocytometer tellen. Zaad de HUVECs op plastic celkweek putsplaten geschikte grootte, met een uitgaande celdichtheid van ongeveer 13.000 cellen / cm2 oppervlaktegroei, 48 uur voor transfectie tot 70-80% confluentie wordt bereikt.
  2. Bereid verse miR / PEI / MNP complexen elke keer.
    OPMERKING: Ten eerste moet miR / PEI-complexen worden verkregen (stappen 3.2.1 - 3.2.3); vervolgens MNP's worden op de miR / PEI-oplossing (stap 3.2.4) om de uiteindelijke miR / PEI / MNP samenstelling voor transfectie (stap 3.3) te krijgen toegevoegd.
    1. Bereken de hoeveelheid geschikte commercieel verkrijgbare miR (gebakken, gekoppeld of functionele, stap 4) met de concentratie van de voorraadoplossing van de fabrikant. Gebruik 2,5 pmol miR / cm2 celkweekoppervlak. Verdun de miR in 5% glucoseoplossing voor obtain een uiteindelijke concentratie van 0,125 pmol miR / ul.
    2. Gebaseerd op de miR hoeveelheid uit stap 3.2.1 en de optimale verhouding van 25 NP 32, berekent de benodigde hoeveelheid PEI met behulp van de gemeten concentratie (stap 1.1.2). Verdun de PEI (volgens de berekende vereiste volume) in een gelijk volume van 5% glucoseoplossing. Voeg de verkregen verdunde pre-PEI de miR-oplossing (uit stap 3.2.1) en vortex het verkregen mengsel gedurende 30 s.
    3. Incubeer de verkregen miR / PEI mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Ultrasone trillingen de MNP's op 35 kHz gedurende tenminste 20 minuten in het soniceren waterbad (zie Materials List) bij kamertemperatuur, voeg de juiste hoeveelheid MNP oplossing voor de miR / PEI (5-25 ug ijzer / ml bereid miR / PEI / MNP mengsel 16), vortex gedurende 30 s en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur tot klaar.
  3. Voeg de bereide miR / PEI / MNP mengsel werd druppelsgewijs direct aan het kweekmedium op de cellen. Met het verkregen mengsel cel culture medium met miR / PEI / MNP verdund in glucose als de transfectie-oplossing. Vervang dit mengsel vers kweekmedium 6 h na transfectie.

4. Analyse van Vector Safety

  1. Onderzoek van de levensvatbaarheid van de cellen.
    1. Transfecteren HUVECs gezaaid in een 24-well plaat cultuur (stappen 3.1 en 3.2); Gebruik Cy3-miR de meetpennen en gecodeerde miR (SCR-miR) als controle gating probes voor flowcytometrie. Incubeer bij 37 ° C in een bevochtiger ceerde atmosfeer die 5% CO2 gedurende 24 uur.
    2. Verzamel de supernatant en getransfecteerde cellen door trypsinisatie behulp 1x trypsine-EDTA verdund in PBS aan de cellen toegevoegd gedurende 4 minuten bij 37 ° C. Centrifugeren bij 300 g gedurende 10 min en gebruikt voor de analyse.
    3. Onderzoekt cellevensvatbaarheid en miR opname-efficiëntie 24 uur na transfectie met flowcytometrie door een commercieel beschikbare beits onderscheid te maken tussen levende / dode cellen; gebruik van standaard protocollen 15 . Breng ongetransfecteerde cellen als een positieve controle voor levensvatbaarheid.
  2. Onderzoekt de veiligheid van de miR / PEI / MNP complexen cellen in functionele assays.
    1. Evalueer de proliferatie activiteit van getransfecteerde cellen.
      1. Transfecteren HUVECs uitgezaaid in een 12-putjes kweekplaat (stappen 3.1 en 3.2) met functionele antisense miR (bijvoorbeeld anti-miR92a voor HUVECs 31) en incubeer bij 37 ° C in een bevochtiger ceerde atmosfeer die 5% CO2 gedurende 24 uur.
      2. Een in de handel verkrijgbare kit voor het aantal prolifererende cellen definiëren door kleuring met EDE (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) en scannen met laser gebaseerde confocale microscopie. Gebruik de volgende microscopie instellingen: 40x objectief met olie-immersie; 633-nm excitatie laser (een 647-nm kleurstof); 5 willekeurige velden op te nemen in elk monster. Bereken het percentage prolifererende cellen door het aantal EDU-gekleurde kernen gedeeld door het totaal aantal kernen (Hoechst gekleurd).
    2. Evalueer het vermogen van getransfecteerde cellen tot buisachtige structuren, zoals eerder beschreven 17, 31.
      1. Transfecteren HUVECs uitgezaaid in een 24-putjes kweekplaat (stappen 3.1 en 3.2) met SCR-miR en incubeer gedurende 48 uur bij 37 ° C in een bevochtiger ceerde atmosfeer met 5% CO2. Verzamel de getransfecteerde cellen (zoals in stap 4.1.1).
      2. Zaad 3,5 x 10 4 van gemodificeerde HUVECs in 24-putjesplaten bekleed met 140 pl basaalmembraanmatrix. Incubeer gedurende 18 uur bij 37 ° C in een bevochtiger ceerde atmosfeer met 5% CO2.
      3. Neem beelden van 10 willekeurige velden in elk putje met behulp van laser scanning confocale microscopie (differentieel interferentie contrast) en te analyseren met behulp van ImageJ software met de "Angiogenese Analyzer" plugin. Omvat parameters zoals de totale lengte van takken, het aantal vertakkingen en het aantal junctions in de evaluatie. Vergelijk dit met de onbehandelde controle.
  3. Nagegaan toxische invloed van transfectiecomplexen op gap junction (GJ) gemedieerde intercellulaire communicatie (GJIC) door het testen 3D fluorescentieherstel na fotobleken (FRAP) 33 in 3D.
    1. Zaad de cellen op glazen objectglaasjes gelatine bekleed met een dunne bodem geschikt voor levende cellen beeldvorming (olie onderdompeling). Transfecteren cellen zoals hierboven beschreven in stap 3.2 met niet-gelabeld, niet-functionele miR (SCR-miR) en incubeer gedurende 24 uur.
    2. Bereid de cellen voor de beeldvorming door ze met direct calceïne voor microscopie. Met name Vervang het kweekmedium door vers medium bevattende 5 uM calceïne, incubeer gedurende 20 minuten, wassen met PBS, en voeg vers kweekmedium. Voorverwarmen van de incubator van de microscoop 37 ° C en pas de CO2 concentratie 5%.
      OPMERKING: Alle reagentia moeten warm naar cel contrac vermijdentie voor de meting.
    3. Met een 561-nm excitatie laser voor celvisualisatie en FRAP experiment. Ten eerste, handmatig cellen voor meting als gebieden van belang (ROI) te selecteren; testcellen ten minste 3 aangrenzende cellen. Definieer een referentiecel met heldere, stabiele fluorescentie die niet worden gebleekt. Bepalen de grenzen van een z-stack. Noteer de fluorescentie van de bovenkant van de cellen aan de bodem 10 onder - 15 lagen.
    4. Bleek de testcellen met 100% laservermogen en noteer de daaropvolgende fluorescentieherstel (door GJ-specifieke kleurstofoverdracht van naburige cellen) gedurende de volgende 15 minuten. Noteer de ruwe gegevens in de z-stacks elke 60 s. In totaal Voer de FRAP metingen met ten minste 5-10 testcellen per experiment. Vergelijk de resultaten aan ongetransfecteerde cellen.

5. Het testen van transfectie-efficiëntie

  1. Onderzoek van miR-opname.
    1. Bereid de probes zoals beschreven in step 4.1 en gebruik ze gelijktijdig miR opname te definiëren met flowcytometrie.
  2. Bevestigen en beschrijven intracellulaire lokalisatie van transfectiecomplexen met confocale en superresolutie gestructureerde verlichting microscopie (SIM).
    1. Zaad de HUVECs op met gelatine beklede dekglaasjes geplaatst in de putjes van 24-putjes, zoals eerder beschreven (stap 3.1). Transfecteren cellen met 3 kleuren gemerkte miR / PEI / MNP (stap 1.4) en incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C in een bevochtiger ceerde atmosfeer met 5% CO2.
    2. Was de dekglaasjes eerst met 2% runderserumalbumine (BSA) in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en daarna met alleen PBS. Fix cellen door incubatie in 4% paraformaldehyde (PFA) bij 37 ° C gedurende 15 min en vlek kernen met DAPI na standaardprotocollen 16. Was 3 maal op het schudapparaat (15 minuten elk) om overmaat kleurstof te verwijderen.
      OPMERKING: PFA is kankerverwekkend en moet zorgvuldig worden behandeld.
    3. Plaats de prepared dekglaasjes op objectglaasjes met geschikte fixeermiddel, laten drogen minimaal 1 uur en deze voor microscopie, zoals hieronder beschreven.
    4. Het verwerven van beelden met behulp van een 63x olie-immersie objectief en de volgende SIM instellingen: 405-, 488-, 561- en 633-nm laser lijnen voor excitatie; z-stack mode met een 32-bits diepte hoeken 5, 5 fasen, met middeling van 4; G2 rooster met een 405 laserlijn, G3 met 488, G4 met 561 en G5 met 633.
  3. Evalueer de functionaliteit van de geleverde miR met RT-qPCR in miR / PEI / MNP-HUVECs versus onbehandelde.
    1. Transfecteren HUVECs uitgezaaid in een 12-putjes kweekplaat trappen (3.1 en 3.2) met functionele antisense miR (bijvoorbeeld anti-miR92a voor HUVECs 31) en incubeer gedurende 48 uur bij 37 ° C in een bevochtiger ceerde atmosfeer met 5% CO2.
    2. Evalueer de anti-miR92a levering en behandelen met RT-qPCR behulp van commercieel verkrijgbare kits (zie materialen); volgen thij instructies van de fabrikant, zoals elders 17, 31 beschreven. Tegelijkertijd onderzoekt de expressie van het doelgen (bijvoorbeeld ITGA5 31).
      OPMERKING: AntagomiR afgifte tegen endogeen miR voorkeur boven imiteert aangezien daarmee het meten van de werkelijke uitkomst van de miR en niet alleen de intracellulaire accumulatie.

6. Cel Targeting Evaluatie en Magnetic Cell Separation

  1. Celgericht in statische omstandigheden in vitro.
    1. Transfecteren HUVECs in een plaat met 24 putjes (2,5 pmol / cm2 scr-miR, NP 25 en 15-25 ug / ml MNP), incubeer gedurende 24 uur, wassen en verzamel zoals hierboven beschreven (stap 4) beschreven.
    2. Meng de celpellet verkregen uit 1 goed met 1 ml vers kweekmedium en plaats deze in de putjes van een 12-wells plaat. Bevestig een kleine magneet plaatselijk (aan de zijkant) aan de onderzijde van de plaat met tape.
    3. Incubeer de celsuspensie gedurende 24 uur en observeer de celhechting en groei in de ruimte boven de magneet en in het gebied zonder een magneet. Een kwalitatieve evaluatie Een conventionele omgekeerde microscoop.
  2. Celgericht in gesimuleerde dynamische omstandigheden in vitro.
    1. Transfecteren HUVECs in een 24-wells plaat per stappen 3.1 en 3.2 (2,5 pmol / cm2 Cy3-miR, NP 25 en 15-25 gg / ml MNP), incubeer gedurende 24 uur, wassen en verzamel door trypsinisatie behulp 1x trypsine-EDTA in PBS verdund toegevoegd aan de cellen gedurende 4 minuten bij 37 ° C. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min.
    2. Meng de celpellet verkregen uit 1 goed met 1 ml vers kweekmedium en plaats deze in de put van een 12-wells plaat. Bevestig een kleine magneet plaatselijk (aan de kant van een put) met tape. Plaats de petrischaal op het schudapparaat en incubeer de celsuspensie gedurende 12 uur bij 150 tpm tot 34 dynamische omstandigheden te simuleren.
    3. Was de cellen en reparerenze met behulp van 4% PFA. Vlekken op de kernen met DAPI 16. Noteer de celhechting met behulp van laser scanning confocale microscopie met een 514-nm excitatie laser, z-stack mode (5-12 segmenten) voor ruwe data en maximale intensiteit beeldprojectie bewerking zijn om beelden voor analyse te maken.
  3. Kwantitatieve analyse van magnetisch reagerende en niet-reagerende cellen.
    1. Transfecteren HUVECs in een plaat met 24 putjes (2,5 pmol / cm2 scr-miR, NP 25 en 15-25 ug / ml MNP), incubeer gedurende 24 uur, wassen en verzamel zoals eerder beschreven (stap 6.2.1) . Pre-warm PBS en celsortering buffer (gesteriliseerd door filtratie, zie Materials List) tot 37 ° C. Resuspendeer de celpellet verkregen uit elk putje met 500 ui buffer celsortering.
    2. Gelden deze celsuspensie aan een magnetisch door de toegevoerde vaste magneet sorteren kolommen, was de kolommen op de magneet 3 keer met verse celsortering buffer en verzamel de doorloop als Magnetitisch reagerende fractie (MAG).
    3. Verwijder de kolommen uit de magneet en direct verzamelen van de magnetisch responsieve celfractie (mag +) door op verse celsortering buffer door de kolom met een plunjer.
    4. Centrifugeer zowel mag- en mag + bij 300 xg gedurende 10 min. Resuspendeer de celpellet in PBS, de cellen te tellen en cellevensvatbaarheid geëvalueerd met Trypan blauw exclusie test 35. Met de verkregen celpellet ofwel voor langetermijnanalyse (dwz, re-zaad en evalueren na 24, 48 en 72 h in kweek 17) of rechtstreeks voor flowcytometrie (trap 4.1.).
  4. Definieer de ijzeren laden van de getransfecteerde cellen.
    OPMERKING: Bij de bereiding dient elk contact van de cel probes met ijzeroxide materialen en instrumenten worden vermeden.
    1. Verzamel de getransfecteerde en ongetransfecteerde HUVECs controle (zoals in stap 4.1.1). Was de verzamelde cellen tweemaal in 2% BSA in PBS 36b y zorgvuldig mengen van de cellen met 1 ml van de wasbuffer en centrifugeren bij 300 xg gedurende 10 min. Resuspendeer de verkregen celpellet in 250 ui PBS, 100 ul 4% PFA en incubeer gedurende 20 minuten om cellen te repareren. Was 3 maal met PBS zoals hierboven beschreven.
    2. Resuspendeer de resulterende vaste celpellet in 110 ui PBS en overgebracht naar 100 gl PCR buizen.
      1. Neem 10-ul aliquots voor celtelling en gebruik het resterende monster magnetisch spectroscopie (MPS).
    3. Voer de meting op een in de handel verkrijgbare MPS-apparaat. Tijdens de meting worden de volgende instellingen: magneetveld rijden = 25 mT en frequentie f0 = 25 kHz. Ijzer kwantificering van de monsters, normaliseren de derde harmonische A3 van de MPS-spectrum tot de overeenkomstige A3, ref MNP een referentiemonster met bekende ijzeren hoeveelheid van 2,1 ugxref "> 37. Gebruik onbehandelde cellen als controle.

7. definiëren MRI detectielimieten

  1. Cell voorbereiding.
    1. Zaad HUVECs in een 6-wells plaat en transfecteren (2,5 pmol / cm2 scr-miR, NP 25 en 15-25 gg / ml MNP) in duplo of drievoud in overeenstemming met de vereiste hoeveelheid cellen (voor phantom voorbereiding). Incubeer de cellen gedurende 24 uur en wassen, te verzamelen en te monteren met 4% PFA, zoals eerder beschreven (stap 4).
    2. Tel de cellen verkregen, bereiden monsters met geschikte aantal cellen (bijvoorbeeld 10 3, 10 4, 10 5, etc.) en hun volume op 50 pl.
  2. Agarose phantom voorbereiding
    1. Bereid verschillende lagen van 2% agarose in 50 ml buizen met verschillende hoeveelheden getransfecteerde cellen ingebed tussen de lagen 38. Tijdens de voorbereiding, ultrasone trillingen en centrifuge de hete agarose 38 totvernietigen luchtbellen die artefacten veroorzaken.
      Opmerking: Het is belangrijk dat fantomen die 5,5 x 10 5 HUVEC behandeld met niet-magnetische miR / PEI-complexen worden bereid op dezelfde wijze te dienen als controles.
  3. Scan de in vitro fantomen met 7,1 T dier MRI-systeem na plaatsing van het fantoom midden van de spoel parallel aan de z-as van het magneetveld.
    1. Gelden de volgende reeks parameters voor een gradiënt-echo sequentie verwerving: TR = 66 ms; TE1 / TE 2/3 TE / TE 4 / TE 5 / TE 6 = 1,44 / 2,88 / 4,51 / 6,11 / 7,60 / 9,01 ms; kantelhoek = 3 °; matrix = 128 x 128 geïnterpoleerde tot 256 x 256; gezichtsveld = 42 mm; 100%; gemiddelde = 1, echotrein lengte = 1; plakdikte = 1,5 mm; en 16 segmenten.
    2. Beoordeelt het verval van het signaal van alle vier echotijden en bereken R2 * kaarten (R2 * = 1 / T2 *) met behulp van geschikte software, zoals elders beschreven 39.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoofddoel van de voorgestelde protocol magnetisch responsieve miR-gemodificeerde cellen en hun nauwkeurige karakterisering (figuur 1) te voeren. Hierdoor efficiënt getransfecteerde cellen, reagerend op magnetische selectie en begeleiding en detecteerbaar met MRI, worden verkregen.

Ten eerste, de identiteit van geïsoleerde HUVEC's werden bevestigd door typische kleuring met endotheliale merker CD31 (PECAM) ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De productie van genetisch gemanipuleerde cellen geladen met superparamagnetische nanopartikels voor de verdere magnetisch gestuurde geleiding heeft in het huidige protocol. De succesvolle toepassing van deze strategie maakt het mogelijk voor de oplossing van een aantal problemen van celtherapie, zoals lage retentie en slechte innesteling in de gewonde gebied 2, 3, 4, door middel van een richtbare cel product voor transplantati...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben geen concurrerende financiële belangen te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen graag G. Fulda (Electron Microscopy Center, Rostock University, Duitsland) bedanken voor de technische ondersteuning bij het verwerven van TEM beelden van gefilterde superparamagnetische nanodeeltjes en in het uitvoeren van hun X-stralen analyse. De werkzaamheden op de RTC Rostock gedragen werd ondersteund door het ministerie van Onderwijs en Onderzoek Duitsland (FKZ 0312138A, FKZ 316159 en VIP + 03VP00241) en de Staat Mecklenburg-Voor-Pommeren met de EU-structuurfondsen (ESF / IV-WM-B34- 0030/10 en ESF / IV-BM-B35-0010 / 12) en de DFG (DA 1296-1), de Damp-Foundation en de Duitse Hartstichting (F / 01/12). Frank Wiekhorst werd gesteund door de EU FP7 onderzoeksprogramma "NanoMag" FP7-NMP-2013-GROOT-7.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PEI 25 kDaSigma Aldrich408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-BiotinThermo Scientific21335
PD-10 Desalting ColumnsGE Healthcare17085101Bevat Sephadex G-25 Medium
Ninhydrin Reagensoplossing 2%Sigma Aldrich7285
GlycineSigma Aldrich410225
Pierce Biotin Quantitation KitThermo Scientific28005
Microplate reader Model 680Bio-Rad
Streptavidin MagneSphere Paramagnetische DeeltjesPromegaZ5481
Millex-HV PVDF FilterMerckSLHV013SL0,45 µm
Libra 120 transmissie-elektronenmicroscoopZeissVersnellingsspanning 120  kV
Sapphire X-ray detectorEDAX-Amatek
Celcultuur plasticTPP
NHS-Esther Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-31
NHS-Esther Atto 488 ATTO-TEC GmbHAD 488-31
Cy5 miRNA Label IT kitMirus BioMIR 9650
Biotin Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-71
Collagense Type IV GibcoThermo Scientific17104019
Endotheel groeimedium, EGM-2LonzaCC-3156 & CC-4176
Penicillin/StreptomycinThermo Scientific15140122100 U/mL, 100 µg/mL
MatrigelBD Biosciences356234
anti-PECAM-1 antilichaamSanta Cruzsc-1506
MS MACS columnsMiltenyi Biotec 130-042-201
Near-IR Live/Dead Cell Stain KitThermo ScientificL10119
Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negatieve ControleThermo ScientificAM17120"Cy3-miR" of "Cyanine-miR3" in het manuscript
Pre-miR miRNA Precursor Moleculen - Negatieve Controle Thermo ScientificAM17110"scr-miR" in het manuscript
Anti-hsa-miR92a-3p synthetisch Inhibitor Thermo ScientificAM10916
LSM 780 ELYRA PS.1 systeemZeiss
ParaformaldehydeSigma Aldrich1581274% oplossing in PBS
DAPI nucleair kleurmiddelThermo ScientificD1306
NucleoSpin RNA isolatie KitMachery-Nagel740955
mirVana miRNA Isolatie KitThermo ScientificAM1560
TaqMan MicroRNA Reverse Transcriptie KitThermo Scientific4366596
StepOnePlus Real-Time PCR SysteemApplied Biosystems
High-Capacity cDNA Reverse Transcriptie KitThermo Scientific4368814
hsa-miR-92a TaqMan testThermo Scientific000431Volwassen miRNA-sequentie: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready MixNippon GeneticsLS27
ITGA5 TaqMan testThermo ScientificHs01547673_m1
RNU6B TaqMan testThermo Scientific001093
18S rRNA Endogenous ControlThermo Scientific4333760F
GelatineSigma AldrichG7041
CellTrace Calcein Red-OrangeThermo ScientificC34851
PBSPan BiotechP04-53500
BSASigma Aldrich
MACS bufferMiltenyi Biotec 130-091-221
AgaroseSigma AldrichA9539
7,1 Tesla dier MRI systeemBruker CorporationA7906
ImageJ softwareNational Institutes of Healthbijgewerkt met een AngiogenesisAnalyzer (NIH)
MPS apparaatBruker Biospin
Matlab softwareMathworks
Ring Neodym Magneet magnets4you GmbHRM-10x04x05-Gø 10 mm; remanentie is ~ 1,3  T, coerciviteit ≥ 955 kA/m
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging KitThermo ScientificC10340
FluorSave ReagensMerck345789
Ultrasoon badBandelin electronicType: RK 100 SH
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Behfar, A., Crespo-Diaz, R., Terzic, A., Gersh, B. J. Cell therapy for cardiac repair-lessons from clinical trials. Nat Rev Cardiol. 11 (4), 232-246 (2014).
  2. Zeng, L., Hu, Q., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
  3. Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 177-181 (2011).
  4. Terrovitis, J., Lautamäki, R., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In Vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. J Am Coll Cardiol. 54 (17), 1619-1626 (2009).
  5. Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. , (2015).
  6. Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Adv Biomed Res. 1, 27(2012).
  7. Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat Rev Genet. 15 (8), 541-555 (2014).
  8. Chira, S., Jackson, C. S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
  9. Li, W., Ma, N., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. J Gene Med. 10 (8), 897-909 (2008).
  10. Muthana, M., Kennerley, A. J., et al. Use of magnetic resonance targeting to direct cell therapy to target sites in vivo. Nat Commun. 6, 1-11 (2013).
  11. Zheng, B., von See, M. P., et al. Quantitative Magnetic Particle Imaging Monitors the Transplantation, Biodistribution, and Clearance of Stem Cells In Vivo. Theranostics. 6 (3), 291-301 (2016).
  12. Almstätter, I., Mykhaylyk, O., et al. Characterization of magnetic viral complexes for targeted delivery in oncology. Theranostics. 5 (7), 667-685 (2015).
  13. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Res. , (2016).
  14. Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16023(2016).
  15. Schade, A., Delyagina, E., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. Int J Mol Sci. 14 (6), 10710-10726 (2013).
  16. Delyagina, E., Schade, A., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), 999-1017 (2014).
  17. Voronina, N., Lemcke, H., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine. 12 (8), 2353-2364 (2016).
  18. Hunt, M. A., Currie, M. J., Robinson, B. A., Dachs, G. U. Optimizing transfection of primary human umbilical vein endothelial cells using commercially available chemical transfection reagents. J Biomol Tech. 21 (2), 66-72 (2010).
  19. Zhang, J., Wang, Z., Lin, W., Chen, S. Gene transfection in complex media using PCBMAEE-PCBMA copolymer with both hydrolytic and zwitterionic blocks. Biomaterials. 35 (27), 7909-7918 (2014).
  20. Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
  21. Moore, S., Stein, W. H. A modified ninhydrin reagent for the photometric determination of amino acids and related compounds. J Biol Chem. 211 (2), 907-913 (1954).
  22. Jones, D. L., Owen, A. G., Farrar, J. F. Simple method to enable the high resolution determination of total free amino acids in soil solutions and soil extracts. Soil Biol Biochem. 34 (12), 1893-1902 (2002).
  23. Kircheis, R., Wightman, L., et al. Polyethylenimine/DNA complexes shielded by transferrin target gene expression to tumors after systemic application. Gene Ther. 8 (1), 28-40 (2001).
  24. Green, N. M. A SPECTROPHOTOMETRIC ASSAY FOR AVIDIN AND BIOTIN BASED ON BINDING OF DYES BY AVIDIN. Biochem J. 94, 23(1965).
  25. Haugland, R. P., You, W. W. Coupling of Antibodies with Biotin. Methods Mol Biol. 418, 13-23 (2008).
  26. Braunschweig, J., Bosch, J., Heister, K., Kuebeck, C., Meckenstock, R. U. Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology. J Microbiol Methods. 89 (1), 41-48 (2012).
  27. Andrade, ÂL., Valente, M. A., Ferreira, J. M. F., Fabris, J. D. Preparation of size-controlled nanoparticles of magnetite. J Magn Magn Mater. 324 (10), 1753-1757 (2012).
  28. Barbaro, D., Di Bari, L., et al. Glucose-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles prepared by metal vapour synthesis are electively internalized in a pancreatic adenocarcinoma cell line expressing GLUT1 transporter. PLoS ONE. 10 (4), e0123159(2015).
  29. Gaebel, R., Ma, N., et al. Patterning human stem cells and endothelial cells with laser printing for cardiac regeneration. Biomaterials. 32 (35), 9218-9230 (2011).
  30. Martín de Llano, J. J., Fuertes, G., Torró, I., García Vicent, C., Fayos, J. L., Lurbe, E. Birth weight and characteristics of endothelial and smooth muscle cell cultures from human umbilical cord vessels. J Transl Med. 7, 30(2009).
  31. Bonauer, A., Carmona, G., et al. MicroRNA-92a controls angiogenesis and functional recovery of ischemic tissues in mice. Science. 324 (5935), 1710-1713 (2009).
  32. Wang, W., Li, W., et al. Polyethylenimine-mediated gene delivery into human bone marrow mesenchymal stem cells from patients. J Cell Mol Med. 15 (9), 1989-1998 (2011).
  33. Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 98, 117-127 (2016).
  34. Cheng, K., Li, T. -S., Malliaras, K., Davis, D. R., Zhang, Y., Marbán, E. Magnetic targeting enhances engraftment and functional benefit of iron-labeled cardiosphere-derived cells in myocardial infarction. Circ Res. 106 (10), 1570-1581 (2010).
  35. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. , A.3B.1-A.3B.2 (2001).
  36. Chorny, M., Alferiev, I. S., et al. Formulation and in vitro characterization of composite biodegradable magnetic nanoparticles for magnetically guided cell delivery. Pharm Res. 29 (5), 1232-1241 (2012).
  37. Poller, W., Löwa, N., et al. Magnetic Particle Spectroscopy Reveals Dynamic Changes in the Magnetic Behavior of Very Small Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles During Cellular Uptake and Enables Determination of Cell-Labeling Efficacy. J Biomed Nanotechnol. 12 (2), 337-346 (2016).
  38. Lobsien, D., Dreyer, A. Y., Stroh, A., Boltze, J., Hoffmann, K. T. Imaging of VSOP Labeled Stem Cells in Agarose Phantoms with Susceptibility Weighted and T2* Weighted MR Imaging at 3T: Determination of the Detection Limit. PLoS ONE. 8 (5), 1-10 (2013).
  39. Hernando, D., Kühn, J. -P., et al. R2* estimation using "in-phase" echoes in the presence of fat: the effects of complex spectrum of fat. J Magn Reson Imaging. 37 (3), 717-726 (2013).
  40. Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., De Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6 (5), 446-465 (2011).
  41. Robert, D., Kirkton, N. B. Genetic Engineering and Stem Cells: Combinatorial Approaches for Cardiac Cell Therapy. IEEE Eng Med Biol Mag. 27 (3), 85(2008).
  42. Chen, Y., Wang, W., et al. Development of an MRI-visible nonviral vector for siRNA delivery targeting gastric cancer. Int J Nanomedicine. 7, 359-368 (2012).
  43. Diener, Y., Jurk, M., et al. RNA-based, transient modulation of gene expression in human haematopoietic stem and progenitor cells. Sci Rep. 5, 17184(2015).
  44. Müller, P., Voronina, N., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem Cells Int. 2016, 1-16 (2016).
  45. Yang, H., Vonk, L. A., et al. Cell type and transfection reagent-dependent effects on viability, cell content, cell cycle and inflammation of RNAi in human primary mesenchymal cells. Eur J Pharm Sci. 53, 35-44 (2014).
  46. Chen, C. -H., Sereti, K. -I., Wu, B. M., Ardehali, R. Translational aspects of cardiac cell therapy. J Cell Mol Med. 19 (8), 1757-1772 (2015).
  47. Alaiti, M. A., Ishikawa, M., et al. Up-regulation of miR-210 by vascular endothelial growth factor in ex vivo expanded CD34+ cells enhances cell-mediated angiogenesis. J Cell Mol Med. 16 (10), 2413-2421 (2012).
  48. Landázuri, N., Tong, S., et al. Magnetic targeting of human mesenchymal stem cells with internalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Small. 9 (23), 4017-4026 (2013).
  49. Carenza, E., Barceló, V., et al. In vitro angiogenic performance and in vivo brain targeting of magnetized endothelial progenitor cells for neurorepair therapies. Nanomedicine. 10 (1), 225-234 (2014).
  50. Kyrtatos, P. G., Lehtolainen, P., et al. Magnetic Tagging Increases Delivery of Circulating Progenitors in Vascular Injury. JACC Cardiovasc Interv. 2 (8), 794-802 (2009).
  51. Huang, Z., Shen, Y., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 149(2013).
  52. Wu, X., Tan, Y., Mao, H., Zhang, M. Toxic effects of iron oxide nanoparticles on human umbilical vein endothelial cells. Int J Nanomedicine. 5, 385-399 (2010).
  53. Soenen, S. J. H., Nuytten, N., De Meyer, S. F., De Smedt, S. C., De Cuyper, M. High Intracellular Iron Oxide Nanoparticle Concentrations Affect Cellular Cytoskeleton and Focal Adhesion Kinase-Mediated Signaling. Small. 6 (7), 832-842 (2010).
  54. Cheng, K., Malliaras, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell Transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
  55. Vandergriff, A. C., Hensley, T. M., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

MicroRNA DeliveryMagnetic NanoparticlesCell TransfectionConfocal MicroscopyFlow CytometryCell ViabilityTube FormationGap Junction CommunicationMRI Tracing

Gerelateerde artikelen