Nieuwe test voor Cold Nociceptie in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Heather N. Turner; Christian Landry; Michael J. Galko

doi:10.3791/55568

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Nieuwe test voor Cold Nociceptie in

7.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55568

⸱

3 april 2017

Heather N. Turner¹^,²^,⁵ , Christian Landry³ , Michael J. Galko¹^,²^,⁴

¹Department of Genetics, UT MD Anderson Cancer Center, ²Neuroscience Program, Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, ³ProDev Engineering, ⁴Genes and Development Program, Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, ⁵Section of Neurobiology, University of Southern California

In dit artikel

Samenvatting

Hier laten we zien een nieuwe test om koude nociceptie in Drosophila larven te bestuderen. Deze test maakt gebruik van een op maat gemaakte Peltier probe kunnen toepassen middelpunt schadelijke stimulus koude en resulteert in meetbare koud-specifiek gedrag. Deze techniek zal verder cellulaire en moleculaire dissectie van koude nociceptie mogelijk te maken.

Samenvatting

Hoe organismen voelen en te reageren op schadelijke temperaturen is nog steeds slecht begrepen. Verder zijn de onderliggende mechanismen sensibilisatie van de sensorische machines, zoals bij patiënten met perifere neuropathie of letsel geïnduceerde sensibilisatie, zijn niet goed gekarakteriseerd. De genetisch handelbaar Drosophila model is gebruikt om de cellen en genen die nodig zijn voor schadelijke tochtdetectie bestuderen die meerdere geconserveerde genen van belang heeft opgeleverd. Weinig is echter bekend over de cellen en receptoren belangrijk voor schadelijke koud detectie. Hoewel, Drosophila langdurige blootstelling aan koude temperaturen (≤10 ºC) niet overleeft, en wordt voorkomen dat cool, liever warmere temperaturen in behavioral voorkeur assays, hoe ze aanvoelen en eventueel te voorkomen schadelijke koude stimuli is pas sinds kort onderzocht.

Hier beschrijven wij en karakteriseren de eerste schadelijke koud (≤10 ºC) behavioral test inDrosophila. Met behulp van deze tool en assay tonen we een onderzoeker hoe koud nociceptieve gedrag kwalitatief en kwantitatief te beoordelen. Dit kan gedaan worden onder normale / gezonde kweekomstandigheden, of vermoedelijk in het kader van ziekte, verwonding of sensibilisatie. Verder kan deze bepaling worden toegepast op larven geselecteerd voor gewenste genotypes, wat kan beïnvloeden thermosensation, pijn of nociceptieve sensibilisatie. Aangezien pijn een sterk behouden proces met behulp van deze bepaling voor verdere studie thermische nociceptie waarschijnlijk vergaren belangrijke inzicht pijn processen in andere soorten, waaronder vertebraten.

Inleiding

Drosophila heeft bewezen zeer nuttig voor de identificatie van nieuwe geconserveerde genen en neuronale circuits die complexe gedrag ten grondslag liggen zijn. Vliegen te verfijnde genetische toolkit en een vereenvoudigd zenuwstelsel waarmee nauwkeurige genetische manipulatie en neuronale ^{^1,} ^{^2,} ^{^3,} ⁴ om de cellulaire en moleculaire basis van nociceptie ^{^5,} ^{^6,} ⁷ ontleden. Larven zijn bijzonder bruikbaar voor deze analyses, aangezien behavioral tests voor zachte aanraking ^{^8,} ^{^9,} ^10, schadelijke warmte ^{^11,} ^{^12,} ¹³ en mechanische sensatie van schadelijke stimuli ^{^4,} ¹¹ zijn reeds vastgesteld, en de transparante larvale cuticula maakt levende of vaste beeldvorming van de onderliggende epidermis en sensorische neuronen. Onlangs is een test voor schadelijke koud is ook ontwikkeld ^7, die we in meer detail beschrijven hier.

Met een fijne, conisch getipt koude probe wordt aangetoond dat vertonen Drosophila larven een aantal koude-specifieke reactieve gedrag, verschillend van gedragingen die tijdens normaal voortbewegen, na zachte aanraking, of na zware mechanische of hoge temperatuur stimuli ^{^7,} ^{^8,} ¹¹ . De koude-specifieke gedragingen, zoals een robuust full-body contractie (CT), een 45-90º verhoging van de achterste segmenten (PR) en een gelijktijdige verhoging van de voorste en achterste segmenten in een U-vorm (US). De prevalentie van deze gedragingen toeneemt met afnemende temperatuur, maar elke pieken bij slichtjes verschillende koude temperaturen. Recent onderzoek suggereert dat CT responsen gemedieerd door verschillende perifere sensorische neuronen dan die reageren op schadelijke warmte of agressieve mechanische stimuli ^7.

Net als nociceptoren vertebraat, Drosophila meerdere dendritische (md) perifere sensorische neuronen complexe dendritische structuren die arborize via epidermis ^1. md neuronen aanwezig in alle larvale lichaamssegment, projecteren de axonen op de ventrale zenuwkoord ^14. md sensorische neuronen worden gescheiden in vier verschillende klassen (I-IV) op basis van dendritische morfologie en hebben verschillende gevoelsfuncties ^{^4,} ^{^9,} ^{^10,} ^{^15,} ^{^16,} ^17. En klasse IV neuronen vereist larven zijdelingse rolbewegingen reactieshoge temperaturen of zware mechanische stimuli ^4, klasse III neuronen vereist voor zachte aanraking reacties ^{^9,} ¹⁰ en worden niet alleen geactiveerd door koude, maar ook vereist voor de koude opgewekte gedragsreacties ^7. Zowel klasse III en klasse IV neuronen gebruiken discrete transient receptor potential (TRP) kanalen gedragsreacties aan schadelijke ^{^7,} ^{^11,} ¹⁸ en onschadelijke stimuli ^{^9,} ^{^10,} ^{^17,} ¹⁹ te vergemakkelijken. Verder wordt larvale nociceptie gesensibiliseerd volgende blessure, op het cellulaire ²⁰ en gedragsmatige niveaus ^{^12,} ^21.

De hier beschreven test maakt de quantification hetzij normaal of potentieel veranderd gedragsreacties op koude temperaturen van schadelijke koude (≤ 10 ° C), onschadelijke koel (11-17 ° C), bij omgevingstemperatuur (18-22 ° C). De koude temperaturen die in deze assay die direct activeren III sensorische neuronen, uitlokken robuust, reproduceerbaar calcium verhoogt en koud opgewekte gedragsreacties, die kwalitatief en kwantitatief kan worden geanalyseerd ^7. Deze test kan worden toegepast op larven van vrijwel elke genotype en larven blootgesteld aan verschillende omgevingsomstandigheden (veranderde voeding, verwonding, farmacologische middelen) zowel genetische en omgevingsfactoren die invloed koude nociceptie, nociceptieve sensibilisatie of nociceptieve plasticiteit bepalen. Aangezien thermosensation alomtegenwoordig in vele soorten, deze test een waardevol hulpmiddel voor de studie van nociceptie en kunnen nieuw gen doelen of neuronale interacties verbetert ontdekkenons begrip van gewervelde nociceptie.

De op maat gemaakte koude probe (zie koude sonde, Table of Materials) gebruikt een gesloten lus geïsoleerde Peltier-inrichting, waarbij de aluminium schacht en conische punt met warmtegeleiding afkoelt. Een thermistor is ingebed in het aluminium kegelpunt meldt de real-time temperatuur op de bedieningseenheid. Een koelelement en de ventilator zijn verbonden aan de thermo-module warmtebelasting het Peltier effect is (Qc) zodat het gewenste temperatuurbereik van (22-0 ° C) worden bereikt regelen (zie Thermal regeleenheid, tabel of Materials). De schadelijke stimulus koude van de sondepunt koude wordt handmatig aangebracht op de dorsale middellijn, om segment (en) op gelijke afstand van voorste en achterste einden (ruwweg segment A4, zie Figuur 1A) van de larve. In reactie op koude stimuli, larven produceren in het algemeen een van de drie koude opgewekte gedrag binnen een 10 s cutoff: een full bodycontractie (CT), een 45-90º verhoging van voorste en achterste segmenten in een U-vorm (US) of een verhoging van het achterste segmenten (PR) (Results beschreven). Geen van deze gedragingen worden uitgevoerd tijdens de normale peristaltische beweging of foerageergedrag. Dit gedrag ook verschillend van zachte aanraking reacties en de rollen aversieve respons op hoge temperaturen of schadelijke mechanische stimuli.