Hier laten we zien een nieuwe test om koude nociceptie in Drosophila larven te bestuderen. Deze test maakt gebruik van een op maat gemaakte Peltier probe kunnen toepassen middelpunt schadelijke stimulus koude en resulteert in meetbare koud-specifiek gedrag. Deze techniek zal verder cellulaire en moleculaire dissectie van koude nociceptie mogelijk te maken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hoe organismen voelen en te reageren op schadelijke temperaturen is nog steeds slecht begrepen. Verder zijn de onderliggende mechanismen sensibilisatie van de sensorische machines, zoals bij patiënten met perifere neuropathie of letsel geïnduceerde sensibilisatie, zijn niet goed gekarakteriseerd. De genetisch handelbaar Drosophila model is gebruikt om de cellen en genen die nodig zijn voor schadelijke tochtdetectie bestuderen die meerdere geconserveerde genen van belang heeft opgeleverd. Weinig is echter bekend over de cellen en receptoren belangrijk voor schadelijke koud detectie. Hoewel, Drosophila langdurige blootstelling aan koude temperaturen (≤10 ºC) niet overleeft, en wordt voorkomen dat cool, liever warmere temperaturen in behavioral voorkeur assays, hoe ze aanvoelen en eventueel te voorkomen schadelijke koude stimuli is pas sinds kort onderzocht.
Hier beschrijven wij en karakteriseren de eerste schadelijke koud (≤10 ºC) behavioral test inDrosophila. Met behulp van deze tool en assay tonen we een onderzoeker hoe koud nociceptieve gedrag kwalitatief en kwantitatief te beoordelen. Dit kan gedaan worden onder normale / gezonde kweekomstandigheden, of vermoedelijk in het kader van ziekte, verwonding of sensibilisatie. Verder kan deze bepaling worden toegepast op larven geselecteerd voor gewenste genotypes, wat kan beïnvloeden thermosensation, pijn of nociceptieve sensibilisatie. Aangezien pijn een sterk behouden proces met behulp van deze bepaling voor verdere studie thermische nociceptie waarschijnlijk vergaren belangrijke inzicht pijn processen in andere soorten, waaronder vertebraten.
Inleiding
Drosophila heeft bewezen zeer nuttig voor de identificatie van nieuwe geconserveerde genen en neuronale circuits die complexe gedrag ten grondslag liggen zijn. Vliegen te verfijnde genetische toolkit en een vereenvoudigd zenuwstelsel waarmee nauwkeurige genetische manipulatie en neuronale 1, 2, 3, 4 om de cellulaire en moleculaire basis van nociceptie 5, 6, 7 ontleden. Larven zijn bijzonder bruikbaar voor deze analyses, aangezien behaviora....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van Larven
- Verhogen bestanden of genetisch kruisen in een 25 ° C incubator.
- Als het kweken van een kruis, gebruiken 20-25 maagdelijke vrouwtjes en 15-20 mannen per flacon met regelmatige maïsmeel fly media. Toestaan vrouwtjes eieren gedurende ongeveer 48 uur alvorens hen naar een nieuw buisje voedsel.
- 4-5 dagen na eieren leggen, verzamel 3e instar larven van het gewenste genotype door voorzichtig spuiten van een waterstroom in de slappe eten en larven, en giet de inhoud in een middelgroot, schone petrischaal (60 mm x 15 mm).
- Vervolgens zachtjes larven sorteren op grootte behulp van een tang o....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Drosophila larven bewegen met een peristaltische beweging die incidenteel pauzes, hoofd bochten en richtingsveranderingen 22 omvat. In reactie op focale toepassing van een schadelijke stimulus koude vertonen echter larven een reeks unieke gedrag, in tegenstelling tot de aversieve laterale rol op pijnlijke hitte en mechanische stimuli. Dit gedrag ook verschillend van reacties op zachte aanraking 8, .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier beschreven test kan worden gebruikt om nociceptie of nociceptieve sensibilisatie kwalitatief en kwantitatief beoordelen larven van verschillende genetische achtergronden, omgevingsinvloeden en / of beschadiging geïnduceerde omstandigheden. Aangezien deze test maakt voor focale toepassing van een koude stimulus, dit gereedschap kan men de functie van een subset van perifere sensorische neuronen evalueren specifiek reageren op lage temperaturen. Interessant is dat deze koud opgewekte gedrag lijken verschillende kl.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Een Amerikaanse octrooiaanvrage (CL) wordt in afwachting op het ontwerp van de koude sonde. Bijkomende informatie over de details van de koude sonde onderdeelnummers en de bouw, evenals extra advies over het hulpmiddel ontwerp zal worden verstrekt op aanvraag.
Dankbetuigingen
Wij danken Sarah Wu en Camille Graham voor de ontwikkeling van de vroege stadia van de koude probe assay, de Bloomington Drosophila Stock Center for fly voorraden en Galko lab leden voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door NIH NRSA (NIH F31NS083306) naar HNT, en door het NIH R01NS069828, R21NS087360 en een Universiteit van Texas MD Anderson Clark Fellowship in Basic Research naar MJG.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Cold Probe | Pro-Dev Engineering | Op bestelling speciaal gemaakt | Artikelnummers en bouwdetails kunnen op aanvraag worden verstrekt |
| Thermal Control Unit | TE Technology | Op bestelling gebouwde behuizing | Artikelnummers en bouwdetails kunnen op aanvraag worden verstrekt |
| Zeiss Stemi 2000 microscoop | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Pincet | FST | FS-1670 | Wordt gebruikt om larven te sorteren en te hanteren. Zorg ervoor dat de punten van het pincet enigszins glad en stomp zijn om het risico op het per ongeluk puncteren of verwonden van de larven te verminderen |
| Schilderskwast | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | Wordt gebruikt om larven te sorteren en te hanteren. Het is handig als de schilderskwast tijdens gebruik vochtig is. |
| 35 mm x 10 mm Polystyreen Petri-schaaltje | Falcon | 351008 | |
| 60 mm x 10 mm Polystyreen Petri-schaaltje | Falcon | 351007 | |
| Stuk zwart vinyl (minstens 2 inch x 2 inch) | Wordt gebruikt om contrast te bieden en larven op de koude sonde te oriënteren | ||
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | Wordt gebruikt om voedsel te verplaatsen |
| Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Wordt gebruikt om de larven en de koude sonde te drogen als er overtollig vocht is |
Referenties
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
