Structuur-functie studies in muis embryonale stamcellen gebruiken recombinase-gemedieerde cassette uitwisseling

Summary

Eiwitten vaak meerdere domeinen die verschillende cellulaire functies kunnen uitoefenen. Gene knock-outs (KO) beschouw dit niet als functionele diversiteit. Hier melden wij een recombinatie-gemedieerde cassette uitwisseling (RMCE) gebaseerde structuur-functie benadering KO embryonale stamcellen waarmee de moleculaire dissectie van verschillende functionele domeinen of varianten van een eiwit.

Abstract

Genmanipulatie in muizenembryo's of embryonale stamcellen (mESCs) maakt voor de studie van de functie van een bepaald eiwit. Eiwitten zijn de werkpaarden van de cel en vaak uit meerdere functionele domeinen, die kan worden beïnvloed door posttranslationele modificaties. De uitputting van het gehele eiwit in conditionele of constitutief knock-out (KO) muizen geen rekening houden met deze functionele diversiteit en regelgeving. Een mES lijn en een afgeleide muismodel, waarbij een docking site voor FLPe-recombinatie gemedieerde cassette uitwisseling (RMCE) binnen de ROSA26 (R26) locus was ingebracht, werd eerder beschreven. Hier doen we verslag van een structuur-functie benadering die het mogelijk maakt voor de moleculaire dissectie van de verschillende functionaliteiten van een multidomein eiwit. Daartoe moet RMCE compatibele muizen worden gekruist met KO muizen en RMCE-compatibele KO mESCs moeten worden geïsoleerd. Vervolgens kan een panel van vermeende redding constructen worden geïntroduceerd in de R26 locus via RMCE targeting. De kandidaat rescue cDNAs kunnen gemakkelijk ingebracht tussen RMCE plaatsen van de richtende vector door middel van recombinatie klonering. Vervolgens worden KO mESCs getransfecteerd met het richtende vector in combinatie met een FLPe recombinase expressieplasmide. RMCE reactiveert het promoter-loze neomycine-resistentiegen in het ROSA26 aanlegplaatsen en maakt de keuze van de juiste targeting. Daardoor worden hoge targeting efficiëntie bijna 100% verkregen, waardoor het inbrengen van meerdere mogelijke redding constructen in een semi-high throughput manier. Tenslotte kan een veelvoud van R26-aangedreven rescue constructen worden getest op hun vermogen om het fenotype dat waargenomen ouderlijke KO mESCs redden. We presenteren een proof-of-principle structuur-functie studie p120 catenine (p120ctn) KO mESCs behulp endoderm differentiatie embryo lichamen (EB's) als fenotypische uitlezing. Deze benadering maakt de identificatie van belangrijke domeinen vermoedelijke stroomafwaartse routes en ziekte-relevante gegevensmutaties die KO fenotypes voor een bepaald eiwit ten grondslag liggen.

Introduction

Geschat wordt dat zoogdieren genomen bevatten ongeveer 20.000 eiwitcoderende genen. Alternatief splitsen en posttranslationele modificaties verder te verhogen het eiwit repertoire. Eiwitten een modulaire constructie ¹ en bevatten vaak meerdere interactie-domeinen, waardoor hun rekrutering in verschillende eiwitcomplexen en hun deelname aan verschillende celprocessen ² mogelijk. Een voorbeeld is de multifunctionele eiwit genaamd p120ctn. p120ctn wordt gecodeerd door het gen Ctnnd1 en bestaat uit een groot centraal armadillo herhalende domein geflankeerd door een N-terminale en C-terminale gebied. De armadillo do....

Protocol

Alle experimenten met muizen werden uitgevoerd volgens institutioneel, nationaal en Europees dierenpaspoort regelgeving.

1. Isolatie van RMCE-compatibele KO mESCs

1. Ras heterozygote KO muizen met RMCE-compatibele muizen, zoals ROSALUC muizen ¹⁰ of ROSA26-iPSC ²¹ muizen. Beide RMCE-compatibele muizen werden gehouden op een gemengd 129 / C57BL6 / Swiss achtergrond.
   LET OP: De kruising met heterozygote KO muizen wordt geadviseerd om embryonale dodelijkheid overwinnen in homozygote KO muizen.
2. Met PCR heterozygote knock-out muizen die een RMCE cassette in de R26 locus ¹²

Results

De procedure voor RMCE-compatibele KO mES lijnen te isoleren is weergegeven in figuur 2. Twee opeenvolgende dekkingen zijn verplicht om RMCE-compatibele KO blastocysten te verkrijgen. Eerst worden heterozygote KO muizen gekruist met RMCE-compatibele muizen om RMCE-compatibele, heterozygote KO muizen te verkrijgen. Deze muizen worden vervolgens gebruikt voor getimede paringen met andere heterozygote KO muizen 3,5 dpc, RMCE-compatibele homozygote KO blastocysten verkregen........

Discussion

Onze mES isolatie methode is gebruiksvriendelijk en vereist geen geavanceerde vaardigheden of apparatuur, zoals microchirurgie van blastocysten. Zo, deze technologie is toegankelijk voor een groot deel van de wetenschappelijke gemeenschap. Iedereen met basic celkweek ervaring kan voortplanten ICM uitwassen en stellen mESCs lijnen. Echter, de spoelen en de behandeling van blastocysten enige oefening vereist. Een mond pipet wordt gebruikt om blastocysten overdracht en bestaat uit een micropipet, een micropipet houder, sla.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ROSALUC Mice	made in house		frozen sperm available upon request
R26-iPSC mice	made in house		frozen sperm available upon request
Vessel probe	Fine Science Tools	10160-13	to check for copulation plugs
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167	make aliquots and store at -20 °C
Fine forceps (Dumont #5 Standard tip Student forceps)	Fine Science Tools	11251-10	spray with 70% EtOH before use (do not autoclave)
23 G needles	Fine-ject	8697
1-mL syringes	Soft-ject	6680
60-mm bacterial grade plates (for flushing)	Gosselin	BB60-01
Mouth pipette	made in house		see discussion
Mouse embryonic fibroblasts (MEFs, TgN (DR4)1 Jae strain)	ATTC	SCRC-1045
TgN (DR4)1 Jae mice	The Jackson Laboratory	3208
Mitomycin C	Sigma-Aldrich	M0503
Phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium	Gibco	14190-094
Tg(DR4)1Jae/J mice	JAX	3208	mice that contain four drug-selectable genes and DR4 MEFS confers resistance to neomycin, puromycin, hygromycin and 6-thioguanine
0.1% Gelatin	Sigma-Aldrich	G1393	Dissolve 0.5 g in 500 mL distilled water, autoclave and store at 4 °C.
Trypsin (0.25%)	Gibco	25200-056
2 μM pluripotin	Cayman Chemical	10009557
pRMCE-DV1	BCCM/LMBP collection	LMBP 08870	public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be)
cre-excised pRMCE-DV1	BCCM/LMBP collection	LMBP 08195	public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be)
pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA	Addgene	20733
heat-shock competent DH5α bacteria	made in house
Gateway pDONR221 vector	Thermo Fisher	12536-017	contains kanamycin-resistance gene
BP clonase II mix	Thermo Fisher	11789-020
LR clonase II mix	Thermo Fisher	11791-020
Luria Broth (LB)
Ampicillin
Applied Biosystems 3730XL DNA Analyzer	Thermo Fisher	3730XL
G418	Thermo Fisher	11811-023
Lipofectamine 2000 transfection reagent	Thermo Fisher	11668027
Lipofectamine LTX transfection reagent	Thermo Fisher	15338100
Effectene transfection reagent	Qiagen	301425
GATEWAY pENTR 1A vector	Thermo Fisher	A10462	recombination-compatible vector
mouse monoclonal anti-p120ctn antibody	BD Transduction Laboratories	610134
mouse monoclonal anti-Ecadherin antibody	BD Transduction Laboratories	610181
General equipment
Sterile dissection tools			fine scissors and forceps for dissecting the uterus
Sterile pipettes: 5 mL, 10 mL and 25 mL
15-mL and 50-mL conical centrifuge tubes
96-well culture plates V-shaped bottom and flat bottom)
Culture dishes: 24 wells, 12 wells and 6 wells
Multichannel pipettes (to pipette 30, 50, 100 and 200 μL)
Sterile multichannel reservoirs
Access to a laminar air flow
Access to an incubator at 37 °C with 5% CO2
Access to an inverted microscope
Access to a bench-top centrifuge
Access to a stereo microscope with transmitted-light
Culture media
MEF Medium			stored at 4 °C; warm 30 min at 37 °C before use
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco	41965-062
10% fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F-7524
L-glutamine (2 mM)	Gibco	25030-024
Sodium pyruvate  (0.4 mM)	Gibco	11360-039
penicillin (100 U/mL)	Gibco	15140-122
streptomycin (100 µg/mL)	Gibco	15140-122
SR-based mESC medium			stored at 4 °C; warm 30 min at 37 °C before use
DMEM/F12	Gibco	31330-038	mixed in a 1:1 ratio
15% knock-out serum replacement (SR)	Gibco	10828–028
L-glutamine (2 mM)	Gibco	25030-024
0.1 mM non-essential amino acids	Gibco	11140-050
penicillin (100 U/mL)	Gibco	15140-122
streptomycin (100 µg/mL)	Gibco	15140-122
β-mercaptoethanol (0.1 mM)	Sigma-Aldrich	M 3148
2,000 U/mL recombinant mouse LIF	(IRC/VIB Protein Service facility)
FBS-based mESC medium (similar to SR-based mESC medium)			stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
15% FBS	Hyclone	SH30070.03E
Differention Medium			stored at 4 °C; warm 30 min at 37 °C before use
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco	21980-032
15% FBS	Hyclone	SH30070.03E
5% CD Hybridoma Medium(1x) liquid	Gibco	11279-023
2 mM L-glutamine	Gibco	25030-024
0.4 mM 1-thioglycerol	Sigma-Aldrich	M-6145
50 μg/mL ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A-4544
penicillin (100 U/mL)	Gibco	15140-122
streptomycin (100 µg/mL)	Gibco	15140-122
2i
1 μM Erk inhibitor PD0325901	Axon Medchem	Axon 1408
3 μM Gsk3 inhibitor CHIR99021	Axon Medchem	Axon 1386