Method Article

Analyse van celsuspensies Geïsoleerd van vaste weefsels door Spectral flowcytometrie

DOI:

10.3791/55578

⸱

May 5th, 2017

 ,  ,  , 
1Flow Cytometry Core Facility, Center for Translational Research-Technical Core, Institut Pasteur, 2Unit for Lymphopoiesis, Immunology Department, INSERM U1223, University Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Institut Pasteur, 3Stem-Cell Microenvironments in Repair/Regeneration Team, Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3s), INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, 4ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto, 5Stem Cells and Regenerative Medicine Team, UMRS 1166, ICAN - Institute of Cardiometabolism And Nutrition, UPMC - Université Pierre et Marie Curie - Paris 6, INSERM

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft spectrale cytometry, een nieuwe benadering flowcytometrie dat de vormen van emissiespectra gebruikt om fluorochromen onderscheiden. Een algoritme vervangt vergoedingen en kan de behandeling van auto-fluorescentie als een onafhankelijke parameter. Deze nieuwe aanpak maakt het mogelijk voor een juiste analyse van de cellen geïsoleerd van vaste organen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Flowcytometrie is gebruikt voor de afgelopen 40 jaar te definiëren en analyseren van het fenotype van lymfe en andere hematopoietische cellen. Aanvankelijk beperkt tot de analyse van enkele fluorochromen, momenteel zijn er tientallen verschillende fluorescente kleurstoffen en tot 14-18 verschillende kleurstoffen kunnen worden gecombineerd tegelijk. Echter, een aantal beperkingen belemmeren nog steeds de analytische mogelijkheden. Door de veelheid van fluorescerende probes is gegevensanalyse steeds complexer geworden vanwege de noodzaak van grote multi-parametrische compensatie matrices. Bovendien hebben mutante muismodellen uitvoering fluorescerende eiwitten op te sporen en sporen specifieke celtypen in verschillende weefsels beschikbaar komen, zodat de analyse (met flowcytometrie) van auto-fluorescentie celsuspensies verkregen vaste organen nodig. Spectraal flowcytometrie, die het vormen van emissiespectra onderscheidt langs een groot aantal continue golflengten, wordt een aantal van deze problemen. De gegevens worden geanalyseerd wMet een algoritme dat compensatiematrices vervangt en automatisch fluorescentie behandelt als een onafhankelijke parameter. Derhalve zou spectrale stromingscytometrie in staat zijn om fluorkromen te onderscheiden met vergelijkbare emissietoppen en kan een multi-parametrische analyse bieden zonder compensatievereisten.

Dit protocol beschrijft de spectrale flowcytometrie analyse, waardoor een 21-parameter (19 fluorescerende probes) karakterisering en het beheer van een auto-fluorescerend signaal, die hoge resolutie bieden bij kleine populatie detectie. De hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat spectraal stromingscytometrie voordelen biedt in de analyse van celpopulaties uit weefsels die moeilijk zijn om te karakteriseren in conventionele stromingscytometrie, zoals het hart en de darm. Spectrale stromingscytometrie demonstreert aldus de multi-parametrische analytische capaciteit van conventionele stromingscytometrie met hoge prestaties zonder de vereiste compensatie en maakt het mogelijk om fluorescentie te beheersen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen decennia, flowcytometrie (FCM) werd op grote schaal beschikbaar analytische methode van essentieel belang voor mobiele phenotyping studies. Er is een aanzienlijke verhoging van de beschikbare fluorescerende kleurstoffen, fluorochromen bijzonder aangeslagen door de violette laser (405 nm) (bijvoorbeeld Brilliant Violet en nieuwe Q-dot kleurstoffen) zijn. Echter, de groei van de beschikbare fluorescerende kleurstoffen verhoogt het risico van overlappende emissies en vergt arbeidsintensieve compensatie matrices. FCM werd op grote schaal gebruikt om celsuspensies van vast weefsel te analyseren, maar de aanwezigheid van auto-fluorescerende cellen ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens het Ethische Handvest van het Pasteur Instituut en de EU-richtlijnen en werden goedgekeurd door het Franse ministerie van Landbouw.

1. Cell Suspension Preparatie van volwassen muisorganen

  1. Isolatie van splenocyten
    1. Euthanize volwassen muizen door cervicale dislocatie. Maak een incisie op de buik van de buik en open de huid met een schaar. Oes de milt met pincet.
    2. Kruip de milt tussen 2 glasmicroscoopschuiven om de cellen te dissociëren en verdunnen ze in 5 mL Hank's Balanced Salted Solution (HBSS) die 1% foetaal kalfserum (FCS) bevat.
    3. Cen....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

21-spectrale parameter FCM paneel splenocyten analyseren

Figuur 1 toont de resultaten verkregen met de 19-fluorescerend antilichaampanel aangebracht op miltcellen die verschillende antilichamen die subsets van T, B, NK, dendritisch en myeloïde cellen, terwijl CD45 labels alle hematopoietische cellen met kernen. Het paneel omvat ook een levensvatbaarheidkleurstof (PI), en de grootte (FSC) en de granulariteit (SSC).......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gebruikelijke FCM is gebaseerd op de detectie van fotonen uitgezonden na excitatie van fluorescerende probes. De fluorescentie emissie van één fluorochroom gedetecteerd in een detector ontworpen om het signaal van een andere fluorochroom meten induceert fysische overlap. Dit spillover onder emissiespectra moet worden gecorrigeerd door compensaties.

Spectrale FCM en gegevensverwerking door de ontmenging deconvolutie-algoritme maakt de combinatie van fluorochromen die nauwe emissiepieken zonde.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij erkennen de technische en theoretische bijdragen in spectrale cytometrie van K. Futamura, die ook kritisch het manuscript herzien. We zijn ook dank verschuldigd aan C. Ait-Mansour, P.-H. Commere, A. Bandeira, en P. Pereira voor het kritisch lezen van het manuscript en voor eindeloze technisch advies en ondersteuning. We danken ook P. Pereira voor de gave van de anti Vγ7-APC en Vδ4-biotine gelabelde antilichamen. We aknowledge het Centre d'Enseignements van Pasteur Instituut voor gastvrij en het ondersteunen van het filmen logistiek. Dit werk werd ondersteund door het Instituut Pasteur, het Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); de....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MiceJanvier LabsCD45.2Source of cells
Ethanol 70%VWR83801.36Sterilization
DPBS (Ca2+, Mg2+)GIBCO ThermoFisher14040-174Embryos collection
Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+)GIBCO Life ThermoFisher14025092Dissociation, digestion and staining solutions
Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-)GIBCO Life ThermoFisher14175095Dissociation, digestion and staining solutions
Fetal calf serum (FCS)EUROBIOCVFSVF00-0UDissociation, digestion and staining solutions
CollagenaseSigmaC2139Enzymatic solution
90 x 15 mm,
plastic tissue culture Petri dishes.		TPPT93100Embryos and hearts collection
35 x 15 mm,
plastic tissue culture Petri dishes.		TPPT9340Hearts collection
Fine iris scissorFine Science Tools14090-09Dissection tools
Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm)Fine Science Tools11003-12Dissection tools
Fine forceps (Dumont no. 7 forceps)Fine Science Tools11272-30Dissection tools
Scalpel VWR21909-668Dissection tools
LEICA MZ6 Dissection microscopeLEICAMZ6 10445111Sampling; Occular W-Pl10x/23
Cold lamp sourceSCHOTT VWRKL1500 compactSampling;
Two goose neck fibers adapted
FACS tubesVWR60819-310Digesting cells
96 well plate (round bottom)VWR10861-564Staining cells
Nylon mesh bolting cloth sterilized,
50/50 mm pieces.		SEFAR NITEXSEFAR NITEXCell filtration
UltrasComp eBeads
Fluorescence labeled antibodiesBiolegendCatalogue number see table belowStaining cells

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Futamura, K., et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).
  2. Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spectral Flow CytometryCell Suspension IsolationSolid Tissue AnalysisAutofluorescence ManagementMulti parameter AnalysisCompensation free DetectionHeart Intestine Cell IsolationPropidium Iodide StainingAntibody Panel StainingFlow Cytometry Gating

Related Articles