Methodenartikel

Multi-layer Cortical Ca

31.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55579

⸱

13 juni 2017

 ,  , 
1Inscopix Inc.

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een procedure voor het uitvoeren van grootschalig Ca 2+ beeldvorming met cellulaire resolutie over meerdere corticale lagen in vrij bewegende muizen. Honderden actieve cellen kunnen tegelijkertijd worden waargenomen met behulp van een miniatuur kop microscoop gekoppeld met een geïmplanteerde prisma sonde.

Samenvatting

In vivo circuit en cellulaire niveau functionele beeldvorming is een kritisch instrument om de hersenen in actie te begrijpen. Hoge resolutie beeldvorming van muiscorticale neuronen met twee-foton microscopie heeft unieke inzichten gegeven in corticale structuur, functie en plasticiteit. Echter, deze studies zijn beperkt tot hoofd vaste dieren, waardoor de gedragscomplexiteit die beschikbaar is voor studie sterk vermindert. In dit document beschrijven we een procedure voor het uitvoeren van chronische fluorescentiemicroscopie met cellulaire resolutie over meerdere corticale lagen in vrijgedragen muizen. We gebruikten een geïntegreerde miniaturiseerde fluorescentiemicroscoop die gepaard was met een geïmplanteerde prisma sonde om de calciumdynamiek van honderden neuronen tegelijkertijd over meerdere lagen van de somatosensaire cortex te visualiseren en op te nemen, aangezien de muis over enkele dagen in een nieuwe object exploratietaak betrokken was. Deze techniek kan worden aangepast aan andere hersenregio's in verschillende diersoorten voor andere gedragspatronenaradigms.

Inleiding

De cortex is een essentiële speler in veel complexe mentale en gedragsfuncties, van aandacht, zintuiglijke waarneming en top-down cognitieve controle 1 , 2 , 3 naar motivatie-, beloning- en verslavingsroutes 4 , 5 . Het begrijpen van de berekeningsprocessen die onder zijn functie staan, is een belangrijk doel om een ​​beter klinisch begrip te krijgen van veel mentale en gedragsstoornissen.

Veel huidige theorieën van de psychiatrische ziekte concentreren zich op het idee dat corticale neurale circuits disfunctie of discoordinatie kan leiden tot cognitieve en gedragsafwijkingen die de kenmerken zijn van aandoeningen zoals schizofrenie 6 , autisme 7 of obsessieve-compulsieve stoornis 8 . Aldus, het verkrijgen van bevolkingsniveau neurale activiteit data van coRticale circuits binnen de juiste context van gelijktijdige gedragsinformatie is van groot belang en ideaal kan worden gericht op specifieke celtypen voor fijnere neurale circuit dissectie.

Miniaturized microscopen in combinatie met implanteerbare gradiëntbrekingsindex (GRIN) microlenses zorgen voor optische toegang tot neuronale ensembles onder vrij bewegende omstandigheden uit een verscheidenheid aan mogelijke hersengebieden 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , inclusief de cortex 14 , 15 , 16 . Het gebruik van een mobiel microscopiesysteem gekoppeld aan genetisch gecodeerde calciumindicatoren zorgt voor consistent beeldvorming van dezelfde cellulaire populatie die honderden neuronen over dagen tot weken in veel hersenregio's 9 omvat en kan zijnGenetisch gericht op specifieke celtypen met behulp van virale vector of transgene technieken.

Aangezien de cortex bekend is om verschillende functies te ondersteunen en te verbinden met verschillende hersengebieden afhankelijk van de locatie van de cellen binnen de corticale lamina 17 , 18 , 19 , zijn we geïnteresseerd in het verkrijgen van gelijktijdige multi-lags neurale activiteit bij wakker gedragen onderwerpen. Hier laten we zien hoe u honderden fluorescente gemerkte neuronen in vrije muizen over dagen kunt opnemen, met behulp van de geminomatiseerde fluorescentiemicroscoop 20 gepaard met een geïmplanteerde prisma sonde, die een multi-layer-weergave van de cortex biedt ( Figuur 1 ).

De hier gebruikte prismodule bestaat uit twee afzonderlijke GRIN-objectieven: een prisma en een cilindrische relaislens ( Figuur 1 ). Het licht van de microscoop stimuleert het fluorescente labelCellen die zich langs het beeldvlak van de prisma sonde bevinden, na af te zien van de hypotenus van het prisma gedeelte van de sonde. Het uitgestraalde licht van de cellen weerspiegelt ook de hypotenuse van het prisma, wordt verzameld door middel van de microscoop en bereikt de sensor in de microscoop. De in deze procedure gebruikte prisma sonde is aangepast voor eenvoudig gebruik met standaard stereotaxische apparatuur.

De geminiaturiseerde fluorescentiemicroscoop 20 detecteert actiepotentiaal-opgewekte Ca 2+ transiënten in neuronale populaties met enkele celresolutie, nadat die cellen specifiek zijn gemerkt met Ca 2+ -gevoelige genetisch gecodeerde fluorescentie-indicatoren. In dit protocol injecteren we Ca 2+ indicator die gecodeerd is in een virale vector (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40), een prisma sonde implanteert, de microscoop installeert, dan meerdere dagen van somatosensorale (S1 achterste ledematen) neurale activiteit gegevens verkrijgen Van een dier blootstellenD tot nieuwe objectoppervlakken tijdens vrije exploratie ( Figuur 2 ).

Protocol

Procedures met betrekking tot diergeneesmiddelen zijn goedgekeurd door het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee (IACUC) bij LifeSource Biomedical Services, NASA Ames Research Center, Californië.

1. Pre-operatieve voorbereiding

  1. Steriliseer de gereedschappen die in chirurgische procedures moeten worden gebruikt in een sterilisator met heet kraal en veeg het operatiegebied met 70% ethanol. Zet het verwarmingspaneel over het stereotaxische stadium aan en houd deze bij 37 ° C vast.
  2. Verdoof het dier met isofluraan (5% voor inductie en 1-2% voor onderhoud, 0,6-0,8 L / min O2). Controleer op het afwezigheid van een tandenreflexreflex om de anesthesie te beoordelen.
  3. Monteer het dier in een stereotaxisch frame met oor- en tandenstangen.
  4. Breng oogheelkundige salf op de ogen van het dier aan en bedek ze met een stuk donker papier om ze te beschermen tegen drogen en intense chirurgische verlichting.
  5. Onderkutan injecteer het dier met ketoprofen (2.5Mg / kg) of carprofen (2,5 mg / kg)

2. Virusinjectie Chirurgie

  1. Trim en scheer de hoofdhuid tussen de ogen en de oren en desinfecteer de huid met 3 alternatieve swabs van 70% ethanol en betadine.
  2. Laat de schedel open door een snede in de hoofdhuid te maken, tussen de ogen en het uitbreiden van 1,5 cm rostrocaudal met een steriel chirurgisch mes. Open de huid om de schedel bloot te stellen, en verwijder het periosteum rond de gewenste injectieplaats met behulp van katoenwatten en een scalpel. Spoel de schedel af met steriele PBS. Maak de schedel schoon met poetsdoekjes.
  3. Niveau de schedel, en markeer met een markering de stereotaxische coördinaten voor virusinjectie. Gebruik een 0,5 mm burr op een high-speed microdrill (ingesteld op ongeveer 7.000-10.000 rpm), maak een klein gat in de schedel. Breng lichte druk aan tijdens het boren en maak het botstof periodiek schoon en maak het gebied schoon met steriele PBS om te voorkomen dat het hersenweefsel oververhit raakt tot het hersenoppervlak weer isdeed pijn. Houd de hersen vochtig waar het gat geboord is.
  4. Gebruik een 26 G-naald om een ​​virus op te halen ( bijv. AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) in de microsprong en vervang deze vervolgens met een 35 G-naald voor injectie. Bevestig de microsiringe geladen met virus aan de manipulatorarm van het stereotaxische apparaat.
  5. Breng de spuit dicht bij het gat van de injectieplaats en pas de hoek van de naald aan, zodat het 90 ° op de hersenoppervlak komt. Laat de naald zakken tot het pia mater raakt en door de dura doorsteekt. Begin met het verlagen van de naald in stappen van 10 μm / s totdat het de gewenste diepte bereikt (z). Bevestig de naaldlocatie daar met behulp van de stereotaxische arm.
  6. Stel de microspuitpomp in om 250 nL virus te injecteren bij 25 nL / min.
    1. Kritische stap: Aangezien het te injecteren virusvolume vooraf afhankelijk is van de titer en verdunning, dient u de verdunning experimenten te laten uitvoeren om optimale volume en concentratiecriteria voor beeldcellen vast te stellen.In het experiment.
  7. Als er sprake is van een virus dat uit de injectie plaatsvindt, pauzeer de injectie en wacht tot het hersenweefsel de virusdaling absorbeert. Wacht 5-7 minuten nadat het totale volume is ingespoten voordat u de naald terugtrekt. Kleurstoffen zoals snelgroen kunnen ook worden toegevoegd aan de virusoplossing om de snelheid van de injectie te helpen bij het voorkomen dat het virus uit het hersenoppervlak ontstaat.
  8. Voor het labelen van meerdere lagen in de cortex, gebruik indien nodig meerdere injecties. Begin eerst op de ventraalste plaats, wacht 5-7 minuten na de injectie en trek de naald naar het volgende meest dorsale punt voor injectie ( bijv. Injecteer bij -1,0 mm AP, 1,5 mm ± ML en 400 en 600 μm DV). Wacht 10 minuten na de laatste injectie voordat u de naald trekt en verwijder het van de stereotaxische instelling.
  9. Meng een kleine hoeveelheid van een in vivo biocompatibele transparante elastomere kleefstof van de dubbele vat spuit (Bijvoorbeeld Kwik-Sil) en bedek het gat in de schedel. Breng cyanoacrylaatlijm aan de bovenzijde van de elastomere laag en laat het genezen.
  10. Zuig de hoofdhuid en laat het dier terug van verdoving in een warme herstelkooi tot het ambulant is. Geef ketoprofen (2,5 mg / kg) of carprofen (2,5 mg / kg) subcutaan voordat u het dier naar zijn thuiskooi terugstuurt. Eenmalig huis post-operatie onderwerpen om de operatieplaats te beschermen en de dosis 24 uur later te herhalen.
  11. Na het verwijderen van de microsprong, spoel beide 26 G en 35 G naalden 7-10 keer met gedestilleerd water af voor de opslag.

3. Impregnatie Chirurgie van de Prism probe

  1. 1-2 weken na de virusinjectie, bereiden voor de implantatiechirurgie van de prisma sonde. Desinfecteer de prisma sonde in 70% ethanol en maak het schoon met lenspapier. Steek de prisma sonde in het gereedschap van de lenshouder en draai de zeskroef vast met de schroevendraaier. Zet de microscoop in de basishouder (deMagneten houden het op zijn plaats).
  2. Bereid het dier voor zoals beschreven onder het onderdeel Preoperatieve voorbereiding.
  3. Snijd en scheer het hoofd van het dier tussen de ogen en de oren en ontsmett de huid met alternatieve pootjes van 70% ethanol en betadine.
  4. Laat de schedel blootstellen door de huid met een paar steriele scharen aan te vinken en verwijder de huidklep en onderliggende periosteum. Droog en poets de schedel met wattenstaafjes. Zorg voor voldoende verwijdering van het omringende spierweefsel om een ​​schone, droge, brede botstichting te creëren ter voorbereiding van de volgende stappen.
  5. Implantaat schedel schroeven in het contralaterale halfrond om het implantaat stabiel en veilig te maken. Deze kunnen ook handig zijn als u ervoor kiest om een ​​kopstang te implanteren voor wake-up van de kop om het dier voor experimentele beeldvormingsessies in sectie 5 klaar te maken.
  6. Niveau de schedel en met een markering markeer de AP en ML coördinaten voor lensinzetten. Gebruik een 0,5 mm burr op een microdrill om een ​​ronde craniotomie te openenDe diameter van de craniotomie is net groter dan de prisma diameter, dwz 1.0 mm in dit geval. Boor voorzichtig terwijl u de pauze periodiek pauzeert om de schedel met steriele PBS te spoelen en weg te zuigen met katoenwatten. Verwijder het botstof dat wordt gegenereerd.
    1. Kritische stap: Plaats de craniotomie zodanig dat wanneer het prisma in de cortex wordt geplaatst, de vlakke rand (beeldvormingsoppervlak) op de virusinjectieplaats staat en binnen een straal van 150-200 μm ligt.
  7. Stop met boren voordat de schedel helemaal verdund is. Bloedvaten moeten zichtbaar zijn door het verdunde bot. Verwijder de botstop voorzichtig met fijne 45 ° tang.
  8. Verwijder de dura met # 5 tang.
    1. Kritische stap: Zodra het hersenweefsel blootgesteld wordt, houd het weefsel altijd vochtig. Plaats een katoenen zwabber gedood in steriele zoutoplossing over de craniotomie. Dit zal ook druk op het weefsel handhaven.
  9. Om de druk in de hersenweefsel te verlichtenRinginvoeging van de prisma sonde, creëer een inbrengkanaal voor de tijd. Bevestig een rechthoekig dissectiemus aan de elektrodehouderarm van het stereotaxische apparaat en bevestig het op het stereotaxische apparaat met een hoek zodanig dat het mesblad loodrecht staat op de kromming van de schedel (10 ° hoek in dit geval) en in een Vlak parallel aan de virusinjectiekolom.
  10. Zet het mes voorzichtig in de craniotomie langs de voorste mediale rand en ~ 200 μm lateraal op de virusinjectieplaats met de achterkant naar achteren gericht ( Figuur 1 ). Zet de Z-as uit wanneer de mespunt de pia raakt en laat het geleidelijk (in stappen van 10 μm / s) naar een diepte waar de prisma sonde wordt ingevoegd. Vervolgens beweeg het mes 1 mm achteraf om een ​​pad te creëren voor de voorkant van het prisma. Pauze en controle voor eventuele bloeden die kunnen gebeuren tijdens het snijden met een pre-steriele zoutoplossend stuk gelfoam.
  11. Zodra het mes in deze positie staat, spoel de plaats met steriele zoutoplossing en wacht tot er een bloeding verdwijnt. Trek dan langzaam het mes in met behulp van de stereotaxische arm micromanipulator in stappen van 10 μm / s, en plaats een stuk gelfoam spons in de steriele zoutoplossing over de incisie.
  12. Bevestig de lenshouder (met de prisma sonde en microscoop) aan de stereotaxische manipulatorarm in dezelfde hoek als het mes in de vorige stap. Richt het prisma zodanig dat de vlakke kant van het prisma over de incisie is en parallel aan de virusinjectiekolom. Deze stap kan een fijne correctie van de stereotaxische armpositie vereisen. Pas de uitlijning aan door dicht bij de schedel te blijven voor snellere resultaten.
  13. Zodra het prisma op de juiste hoek is, verlaag het geleidelijk in de hersenen in stappen van 10 μm tot een laatste z van 1,1 mm voor deze sonde, vanaf het hersenoppervlak. Het hersenweefsel zal zich om het prisma uitbreiden en elke druk die wordt gecreëerd ligt achter de visualizatieOp het vliegtuig en heeft geen invloed op het gezichtsveld. Steek de microscoop in op een computer met acquisitie software die via een USB3 poort is geïnstalleerd en de fluorescentie van het veld visualiseert door de LED aan te zetten.
  14. Bedek het blootgestelde weefsel rond het prisma in de craniotomie in een zeer dunne beschermlaag van elastomeerlijm met behulp van een 25G-naald.
  15. Nadat het elastomeerlijm gehard is (meestal in ~ 3-5 minuten), gebruik een 25G-naald om een ​​aantal cyanoacrylaatlijm aan te brengen om het glas van de prisma-lens aan de aangrenzende schedel over de laag elastomere kleefstof te bevestigen om te voorkomen dat de lens binnen beweegt De craniotomie. Bevestig de randen van de prisma sonde manchet voor betere hechting. Krijg geen lijm op het bovenvlak van de geïmplanteerde prisma sonde. Zodra het cyanoacrylaat lijm is uitgehard, verwijder de lenshouder en verwijder de microscoop zorgvuldig. Trek de stereotaxische manipulator arm langzaam terug om de prisma sonde veilig te laten implanteren.
  16. Breng een laag tandheelkundige acryl ofCyanoacrylaat lijm rond het implantaat om alle blootgestelde schedeloppervlakken te bedekken, tot maar niet aan het omringende teruggetrokken spierweefsel. Een groot deel van de schedel met deze craniale dop bedekt, zal later in de basisplaat bevestiging helpen. De huid rondom de implantaat moet op zichzelf rond de kranskap kapken.
    1. Kritische stap: Laat geen lijm aan de omliggende huid of spierweefsel kleven, en geef geen huid in de kranskap. Als u dit doet, zal de huid irriteren en kan het leiden tot overmatige krassen en mogelijke schade aan het implantaat.
  17. Optioneel: Als u een wakker hoofdinstelling wilt gebruiken om de microscoop vast te leggen aan de basisplaat van een dier in experimentele beeldsessies, in plaats van het dier kort te verdoving of schrobben, implanteert u een kop in de kranskap die compatibel is met een wakker hoofd- Vaste installatie van keuze (niet aangetoond in dit protocol).
  18. Meng de katalysator en de basis van een siliciumEen lijmspuit en doe een druppel van het elastomeer in de prisma sonde manchet om de bovenkant van de sonde te bedekken om te voorkomen dat er schade en stof ontstaan.
  19. Verwijder het dier uit het stereotaxische frame en laat het herstel van verdoving in een warme kamer. Administreer ketoprofen (2,5 mg / kg) of carprofen (2,5 mg / kg) subcutaan en keer het dier terug naar een schone huis kooi wanneer het ambulant is. Zodra alle onderwerpen huisvesten om het implantaat te beschermen en de dosis 24 uur later te herhalen.

4. Basisplaatje voor miniatuurmicroscoop installatie

  1. Een week tot 10 dagen na het implantaten van de prisma sonde, controleer op virusuitdrukking in het weefsel via de geïmplanteerde prisma sonde en bevestig een basisplaat op de schedel als het preparaat de celactiviteit aangeeft. De microscoop zal tijdens het livebeeld op de basisplaten dokken.
  2. Volg de stappen die zijn beschreven in de pre-operatieve procedure voor het bereiden van het dier voor basisplaatje.
  3. Verwijder de siliconen kleefdop over het oppervlak van de geïmplanteerde lens van de prisma sonde. Controleer het oppervlak van de lensprobe, en maak de puin voorzichtig schoon met lenspapier en 70% ethanol om ervoor te zorgen dat het afbeeldingsoppervlak schoon is.
  4. Sluit de microscoop aan op de DAQ-box en verbind deze via de USB3-poort naar de pc.
  5. Open de acquisitie software op de computer en verbind de microscoop via de USB3 poort. Gebruik de acquisitie software voor het controleren van neurale activiteit, en voor het meten en documenteren van de weergave-instellingen voor toekomstige opnamen in dit onderwerp.
  6. Bevestig een basisplaat aan de microscoop en bevestig de basisplaatschroef om de basisplaat vast te houden en bevestig de microscoop in de microscoopgrijper op de stereotaxische micromanipulatorarm door het lichaam van de microscoop. Bevestig de grijper aan een Newport staaf, die op de stereotaxische micromanipulator arm kan worden gemonteerd.
  7. Plaats de microscoop boven de prisma sonde lens met behulp van de sTereotaxische micromanipuatorarm. Controleer de oriëntatie visueel door de prisma lens van de zijkant en achterkant van het dierenfase te bekijken. De optische assen van zowel de microscoop objectief als de prisma sonde lens moeten uitgelijnd zijn.
  8. Zet de microscoop LED door de software aan. Evalueer de kwaliteit van de microscoopuitlijning door te richten op het bovenvlak van de geïmplanteerde prisma sonde lens in de acquisitie software. Als de randen van het prismaslens bovenkant gezicht goed zijn uitgelijnd, moeten ze scherp zijn.
  9. Stel de fysieke afstand van de microscoop boven de geïmplanteerde prisma sonde aan met behulp van de stereotaxische manipulator arm om het gewenste brandpuntsvlak in het weefsel te verkrijgen. De optisch geoptimaliseerde afstand tussen de microscoop objectief en geïmplanteerde GRIN lens is ~ 500 μm.
  10. Bewaar een referentie-fluorescentiebeeld zodra het gewenste beeldvormingsvlak is vastgelegd.
    Kritisch punt: Stel vanaf dit punt de positie van de microscoop niet aan, aangezien dit de locatie verandertOp van het beeldvlak in het weefsel.
    OPMERKING: Breng lijm in de volgende stap aan om de positie van de basisplaat permanent vast te stellen in verhouding tot de kranskap. Het lijm kan in de volgende dag of twee een beetje krimp krijgen, wat het brandpunt in het weefsel kan veranderen. Preemptief rekening hiervoor door het meten van de hoeveelheid krimp voor uw lijmmix en afstand ex vivo , en dan de uiteindelijke Z-positie van de microscoop + basisplaat te ondersteunen met die hoeveelheid voordat u naar de lijmtoepassingsstap gaat.
  11. Gebruik dentaal acryl of cyanoacrylaat om de basisplaat permanent vast te zetten aan de acrylkap die de schedel van de dieren overbrugt, met behulp van de acryl of het lijm. Het toepassen van tandheelkundige acryl / cyanoacrylaat geleidelijk en genezen in meerdere fasen kan het effect van de eerder genoemde krimp op de uiteindelijke positie van het beeldvlak van de microscoop minimaliseren.
    1. Kritische stap: Wees voorzichtig tijdens het aanbrengen van tandheelkundeAcryl / cyanoacrylaat om te voorkomen dat materiaal het objectieflens van de microscoop, de instelschroef of het microscooplichaam in contact brengt, zodat de instrumentatie later niet meer functioneert.
    2. Kritische stap: Duw de microscoop niet aan tijdens het aanbrengen van de lijm. Druk op de microscoop of basisplaat kan leiden tot beweging van de microscoopdoelstelling ten opzichte van de prisma sonde lens, die kan leiden tot verkeerde aanpassing of een verandering van het brandpuntsvlak in het weefsel dat een snelle herstelling zou vereisen.
  12. Controleer of het tandheelkundige acryl / cyanoacrylaat genezen en verhard is door op het acryl te tikken met een paar tang of spuit. Verkrijg een definitieve referentie fluorescentie afbeelding met de acquisitie software.
  13. Laat de microscoop los van de grijper en trek de grijper uit de microscoop. Als cyanoacrylaat of een ander transparant lijm werd gebruikt, bedek het met zwart nagellak of een laag zwart tandheelkundig cement om eenLicht lekkage in de hoofddop, waardoor toekomstige beelden die tijdens de experimenten zijn verworven, kunnen vervuilen.
  14. Verwijder desgewenst de microscoop op dit punt. Voor het scheiden van de microscoop vanaf de basisplaat los de schroef van de basisplaat los door de instelschroef ongeveer ½ draai naar links te draaien. Knip het microscooplichaam aan terwijl u de basisplaat en de acrylkap vasthoudt en de microscoop rechtop trekken. Vervang het in zijn opslagcontainer.
  15. Bescherm de geïmplanteerde prisma sonde met een bodembedekking. Dit voorkomt dat stofdeeltjes zich op het lensoppervlak vestigen, wat lastig kan zijn nadat de basisplaat is geïnstalleerd.
  16. Bevestig de bodembedekking op de basisplaat en verplaats de instelschroef met ongeveer ½ draai rechtsom of tot de instelschroef op de bodemplaat staat. Niet oversteken.
  17. Verwijder het dier van verdoving en monitor in een warme herstelkamer tot ambulant. Ga terugE dier in zijn huis kooi. Zodra alle dieren met geïmplanteerde basisplaten zitten om het implantaat te beschermen.

5. Imaging Multiple Cortical Lagen in een vrij bewegende muis

  1. Bereid het gedragsapparaat ( bv. Phenotyper, Noldus) op door het schoonmaken en desinfecteren en af ​​te vegen met 10% bleekoplossing.
  2. Sluit de microscoop aan op de DAQ-box en sluit deze aan op de computer en start de acquisitie software.
  3. Controleer voor voldoende opslagruimte op de acquisitiecomputer en maak ruimte voor de calciumbeeldfilms. Sla rechtstreeks op van de software op de lokale harde schijf, in plaats van naar een externe harde schijf te schrijven, om de hoge data-overdrachtssnelheid tussen de microscoop en de computer tegemoet te komen en verlies van gegevens tijdens opnames te voorkomen.
  4. Verdoof het dier met isofluraan (5% in zuurstof) in een inductiekamer om de microscoop te bevestigen. Als alternatief, schroef het dier voorzichtig of gebruik een wakker hoofdopstellingMet een kopstang als verdoving bekend is dat het gedragsparadigma van de keuze verstoort.
  5. Verwijder het deksel van de basisplaat door de schroef van de basisplaat tegen de klok in te draaien en de basisplaat af te halen.
  6. Zet de microscoop in de basisplaat op het dier. De microscoop moet met behulp van de magneten op de basisplaat vastklikken. Bevestig de basisschroef van de basisplaat tot er een kleine weerstand wordt gevoeld.
    1. Kritische stap: Draai de schroef van de basisplaat niet vast om te voorkomen dat de behuizing van de microscoop wordt beschadigd.
  7. Controleer het beeldvlak in het weefsel door een fluorescentie-snapshot in de software te verkrijgen en eventueel het brandpuntsvlak in het weefsel aan te passen door de microscoop-turret set screw los te draaien, de microscoop-turret te draaien om de fijne focus aan te passen en de turret opnieuw aan te trekken Behuizing set schroef.
    1. Critical Step: Verdwijd het turret nooit om te draaien zonder eerst de instelschroef los te maken enDraai de schroef van de turret set niet aan.
  8. Als u een longitudinale studie uitvoert, ga terug naar de fysieke torenstand om hetzelfde beeldveld te vangen. In de hardware let op het aantal torentoren of de fysieke positie van het torentje voor elk dier dat met dezelfde microscoop is afgebeeld om snel terug te keren naar hetzelfde beeldveld.
  9. Laat het dier dat de microscoop draagt ​​in zijn huishok of gedragskamer los voor akklimatie, en wacht af van de afname van verdoving indien van toepassing.
    1. Kritische stap: Train de dieren om het gewicht van de microscoop met een dummymicroscoop te dragen voor meerdere sessies totdat het ervoor gezorgd is dat het dragen van de microscoop geen normaal gedrag inmengt voordat u experimentele sessies start. Regelmatige hantering en training voor wakker vasthouden, voorkomt onnodige stress op de dieren.
  10. Selecteer de acquisitie-instellingen die u wilt gebruiken om gegevens te verzamelen. Dit omvat de fraIk rate voor het vastleggen van gegevens ( bijv. 20 fps, Gain of 1, en LED power van 50%). Controleer het beeldhistogram bij het selecteren van de instellingen om een ​​goede SNR te waarborgen.
    OPMERKING: De numerieke diafragma voor de fluorescentieverzameling is 0,35 voor de 1 mm prismon, vergeleken met 0,5 voor de 1 mm rechte sonde.
  11. Start de gedragsoftware en programmeer deze om de microscoop te activeren bij de gewenste opname-opnamecyclus ( bijv. Een 4x 5 min ON 2 min OFF). Sluit de TTL-poort op de Noldus IO-box aan op de TRIG-poort op de DAQ-box via een RJ45-BNC-kabel.
  12. Plaats het dier in de gedragsarena, indien niet al, en start het experiment.
  13. Nadat u de gewenste gegevens hebt verworven, verdund het dier met isofluraan (5% in zuurstof) in een inductiekamer of veer het dier zachtjes wakker.
  14. Maak de schroef van de basisplaat los en maak de microscoop los van de basisplaat door de microscoop voorzichtig op te trekken. Vervang de bodembedekking en draai de basisplaat voorzichtig vastSchroef instellen.
  15. Keer het dier terug naar de thuiskooi tot de volgende opnamesessie. Gebruik de referentie-fluorescentiebeelden als een handleiding voor de volgende beeldsessies om terug te keren naar hetzelfde beeldveld.

6. Evaluatie van grootschalige Ca 2+ beeldgegevens

  1. Om cellocatie en Ca 2+ -dynamiek uit het oogpunt van gegevens uit te trekken, kunnen verschillende data-analyseplatforms worden gebruikt. Mosaic, een data analyse platform ontworpen speciaal voor het verwerken van grote Ca 2+ imaging films is gebruikt voor deze studie hier.
  2. Bepaal defecte pixels en interpoleer alle afzonderlijke gevallen frames in de ruwe films in de preprocessing-stap. Plaats de beelden in de ruimte van het volledige beeldveld van 1.440 x 1.080 pixels tot 720 x 540 pixels om de data footprint te verminderen.
  3. Om voor bewegingsartifacten in de hersenen te corrigeren met betrekking tot de microscoop beeldsensor, registreer je de films met behulp van een strenge ImageJ gebaseerde beeldreactieGistration algoritme (TurboReg).
  4. Om individuele neuronen te identificeren, druk de afbeeldingen opnieuw op als relatieve veranderingen in fluorescentie ΔF / F 0 = FF 0 / F 0 waar F 0 de gemiddelde afbeelding is die wordt verkregen door de gehele film te berekenen.
  5. Identificeer de ruimtelijke filters die overeenkomen met afzonderlijke cellen met behulp van een gevestigd celsorteringsalgoritme. Hier hebben we hoofd- en individuele componentanalyse 21 gebruikt om individuele neuronen te identificeren.
    OPMERKING: een gebeurtenis werd gespecificeerd wanneer de piek amplitude van een gebeurtenis in een spoor meer dan 8 standaardafwijkingen was van de basislijn van het spoor in onze dataset en de cellocatie en Ca 2+ -dynamiekgegevens werden geëxporteerd voor verdere analyse.

Resultaten

Het hier beschreven protocol beschrijft een effectieve en efficiënte manier om longitudinale multilayer Ca 2+ beeldvorming uit honderden corticale neuronen uit te voeren in vrij gedragen muizen met behulp van prisma sondes ( Figuur 1 ). Vorige benaderingen voor corticale beeldvorming met meerdere lagen zijn voornamelijk beperkt tot hoofd vaste dieren 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Om dit niveau van gegevens in een vrij gedragen context te verwerven, werd een miniatuur microscoopplatform gebruikt voor flexibiliteit van gedrag; Een genetisch gecodeerde calcium indicator (GCaMP6f) werd gebruikt om een ​​specifieke celpopulatie (CAMKII + cellen in de cortex) te targeten; En een prisma-sonde werd gekozen om een ​​chronisch multilaagbeeldveld te verschaffen.

We hebben de workflow aangetoond voor het voorbereiden van het dier voor beeldvorming. Een virale vector die codeert voor een geschikte calciumindicator werd in de cortex geïnjecteerd ( Figuur 2 , Stap 1), voordat een prisma sonde chronisch wordt geïmplanteerd om optische toegang tot de gelabelde cellen mogelijk te maken ( Figuur 2 , Stap 2). Een basisplaat die als veilig, tijdelijke dok voor het positioneren van de microscoop tijdens beeldsessies wordt geïnstalleerd, werd vervolgens over het hoofd van het dier geïnstalleerd ( Figuur 2 , Stap 3), waardoor de visualisatie van corticale activiteit over meerdere cellagen in een wakker gedragen experimentele Setup ( afbeelding 2 , stap 4).

Om ervoor te zorgen dat de gewenste cellulaire populatie werd gericht, wordt een post-mortem coronale hersensectie van een representatieve muis getoond in figuur 3 met het prisma sonde kanaal en het zichtveld gemarkeerd ten opzichte van het GCaMP6f labNeuronen in Lagen 2/3 en 5 van de somatosensorische cortex.

Tijdens wekelijks gedragen beeldvorming met het systeem werd de activiteit van de somatosensorische corticale neuronen geregistreerd wanneer de muis werd blootgesteld aan drie verschillende omgevingen: Open Field (Dag 1), Object Familiarization (Dag 2-4) en Nieuw Object (Dag 5) ( Figuur 4 ). Op dag 1 werd de muis geplaatst op een gedrags arena zonder voorwerpen. Op dag 2-4 werd de muis in de arena geplaatst met dezelfde twee texturaal verschillende objecten (een geluidskussen en een houten blok). Op dag 5 werd één van de objecten vervangen door een nieuw object. Het dier werd gedurende 5 dagen voor 20 minuten per dag afgebeeld.

Na de celontwinning met behulp van de Ca 2+ beelddata-analyse software, werden ruimtelijke filters die overeenkomen met cellocaties overgelegd op de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de microscoop opname data( Figuur 5) . Een witte streeplijn scheidt lagen 2/3 en 5 cellen. Corresponderende Ca 2+ sporen van 5 cellen uit elk van de lagen tonen het ontstekingspatroon van de cellen in twee verschillende gedragscontexten - Object Familiarization en Novel Object Exposure. Layer 2/3 cellen waren meer actief in vergelijking met laag 5 cellen op de dag waarop de muis werd blootgesteld aan een nieuw object. Dit blijkt ook uit de raster plots die de drempelvuuractiviteit van alle afgebeelde cellen op dag 1, 4 en 5 tonen.

figure-results-1
Figuur 1: In Vivo Ca 2+ Imaging over meerdere Cortical Lagen in vrij bewegende muizen. ( A ) Prism sonde specificaties en afbeeldingen van beeldvorming vlak. De reflecterende coating aan de binnenzijde van de hypotenuse maakt het mogelijk om 90 ° van het invoegvlak van de prisma sonde af te beelden. De lens cuFf integreert met de lenshouder, die de implantatieprocedure stroomlijnt en mogelijk maakt voor het bekijken van fluorescentie van de omgevingsweefsel tijdens implantatie ( B ) (i). Illustratie van de plaatsing van de krismotomie van de prisma sonde en het snijden van een mes ten opzichte van de virusinjectieplaats, en (ii) illustratie van de plaats van de prisma sonde vlakke zijde ten opzichte van de mesinspringings- en virusinjectieplaats. ( C ) Illustratie van in-vivo Ca 2+ beeldvorming setup die het lichtpad voor een klein gebied in het volledige zichtveld toont door middel van prisma sonde geïmplanteerd in de muiscortex. ( D ) Voorbeeld zichtveld tijdens de prisma sonde installatie. Miniatuurmicroscoop is bevestigd aan de lenshouder, die de prisma-sonde vasthoudt om de virusuitdrukking tijdens de prisma-sonde-installatie te controleren. ( E ) Integratie van microscoop met prisma sonde voor multi-layer corticale beeldvorming van GCaMP6f gelabelde S1 cellen. F Voorbeeld veld van weergaveTijdens de installatie van de baseplaat. Duidelijke bloedvatpatroon is zichtbaar op het moment waarop de basisplaat installeert met sommige cellen in rauwe afbeelding. Meer cellen zijn duidelijk zichtbaar wanneer DF / F in het acquisitie software venster is ingeschakeld. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Schematische weergave van de tijdlijn van Workflow Events voor Prism Sonde Implantatie en Microscoop Installatie. Aantal weken wordt weergegeven op de X-as en de werkstromen van de procedures langs de Y-as. ( A ) Grafisch illustreren virale injectie (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) langs dezelfde dorso-ventrale as, om meerdere lagen van de muis somatosensaire cortex te markeren. ( B ) 2 weken na virusinjecties, een prisma probE wordt geïmplanteerd op een as die parallel is aan de virusinjectieplaatsen. ( C ) Ongeveer een week na de implantatie van de prisma sonde wordt het dier gecontroleerd op expressie met de microscoop en een basisplaat is op het hoofd gemonteerd als een populatie cellen zichtbaar is. ( D ) Het dier is dan klaar voor chronische beeldvorming tijdens relevante gedragstaken (Muisklemkunst gewijzigd na toestemming van- UW-Madison Biochemistry MediaLab). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Postmortem Histologische Validatie van Prism probe Locatie en GCaMP Expression. ( A ) Coronale sectie van een representatieve muisbrein die het prismasectraalkanaal toont en met zijn beeldende zijde naar voren wijstDe GCaMP6f-expressiecellen (AAV1.CaMKII.GCaMP6f uitgedrukt in neuronen in lagen 2/3 en 5). ( B ) Zelfde coronale hersensectie als gevolg van de kleuring voor DAPI. Schaalbalk = 250 μm ( C ) Inzoomen in het licht van GCaMP6f die cellen uitdrukken in somatosensory cortex. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Muisactiviteit tijdens de Habituation, Familiarization, en Exposure Testing van de nieuwe object werd Video Tracked met behulp van Video Software. ( A ) Op dag 1 werd het dier geplaatst in een gedrags arena zonder voorwerpen (Open Field). ( B ) Op dagen 2-4 werden dezelfde twee texturaal verschillende objecten (gel pad en houtblok) in de arena geplaatst (Object Familiarization). ( C ) Op dag 5 werd één van de voorwerpen vervangen door een nieuw object (houtblok met zandpapier) (nieuwe objectobjectie). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Calciumdynamica van oppervlakkige en diepe lagen van Somatosensorische Cortex van een representatieve muis die wordt weergegeven met de microscoop. ( A ) samengevoegd beeld van neuronale ruimtelijke filters (groene blobs) en gemiddelde fluorescentie-intensiteit projectie van de microscoop opname door middel van prisma sonde veld van het zicht. Border tussen supragranulaire en infragranulaire lagen aangegeven door een witte streeplijn. Schaalbalk = 100 μm. ( B ) Calciumsporen van vijf voorbeeld oppervlakkige en diepe laagcellen (gevuld blauw en rood cElls in paneel A), waarin de eenheden van standaardafwijking van fluorescentie worden aangegeven, in navolging van hoofd- en onafhankelijke componentanalyse. Horizontale schaalbalk 50 s en verticale schaalbalk 10 SD ( C ) Schema van cellen van oppervlakkig (lagen 2/3) en diepe lagen (laag 5) getoond boven Open veld, Objectbekendheid en Nieuwe object exploratie. Schaalbalk = 100 s. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het begrijpen van neurale kringactiviteit tijdens wakker gedrag is een vitaal niveau van neurowetenschappelijk onderzoek dat nodig is om de hersenfunctie effectief in gezondheid en ziekte op te lossen. De cortex is een bijzonder belangrijk gebied om te studeren in het kader van wakker gedrag, omdat het een belangrijke rol speelt in vele vitale, cognitieve en uitvoerende functies 28 , 29 .

De corticale kolom wordt beschouwd als de basisfunctionele eenheid in de cortex en populatie-niveau activiteit van corticale cellen is bekend om te verschillen op basis van hun fysieke locatie binnen de kolom. Bijvoorbeeld, excitatoire neuronen in lagen 2/3 in de somatosensorische cortex projecten in hoofdzaak naar andere neocortische gebieden en moduleren andere corticale netwerken 30 , terwijl cellen in dieper lagen vooral naar subcortische gebieden zoals de thalamus 31 raken. Opnemen van de activiteit van honderdS van vooraf gespecificeerde corticale cellen tegelijkertijd en betrouwbaar over de tijd over verschillende lamina's in vrijgedragen onderwerpen, zou ons begrip voor de corticale informatiestroom sterk verbeteren, waardoor een fijnere functionele dissectie van corticale kolommen wordt geïnformeerd door real-time gedragsinformatie en taakrelevante tijd- schalen.

Het verzamelen van dit niveau van neurale kringsdata is mogelijk gemaakt door gebruik te maken van een efficiënt en gestroomlijnd miniaturiseerd microscopieplatform om grootschalig Ca 2+ beeldvorming in vrijgedragen onderwerpen (of hoofdonderwerpen zoals gewenst) uit te voeren. Gebruikt met genetisch gecodeerde calciumindicatoren om een ​​specifiek targeting van cellen te activeren en een multi-lags gezichtsveld voor te stellen die wordt geleverd door een chronisch geïmplanteerde prisma sonde, onderzoekt dit protocol onder veel mogelijke toepassingen: observatie van laminaire verschillen in somatosensorische corticale verwerking bij muizen Fysiek verloofd met een nieuw object ( figuur 5 ).Dit is de eerste procedurele illustratie van dit soort celtype specifieke, in vivo aanpak om meerdere corticale lagen te bestuderen bij wakker, vrij gedragen dieren en verbrengt het spectrum van experimentele methoden die beschikbaar zijn om laminaire structuren in de actieve hersenen te begrijpen.

Het periscopische zichtveld dat door de prisma sonde in deze techniek wordt geactiveerd, kan haalbaar toegepast worden op andere hersenstructuren wanneer het behoud van het weefsel direct dorsaal naar een gebied van belang is gewenst; Bijvoorbeeld, CA3 beeldvorming kan worden bereikt zonder verstoring van de hippocampale functie.

Prism sonde gebaseerde aanpak voor imaging Ca 2+ activiteit vereist de fysieke invoeging en permanente implantatie van een microprism in de cortex, die overeenkomt met de creatie van een corticale letsel waar de lens sonde wordt geplaatst. Dit kan leiden tot verstoringen van de lokale neurale schakeling, met inbegrip van de afscheiding van apische dendrieten en processen. TZijn procedure zal ook een initiële activering van glialcellen in het gebied veroorzaken, alhoewel dit naar verwachting wordt gelokaliseerd aan het weefsel ongeveer 150 μm van het prisma-gezicht en om te dalen nadat de hersenen 22 genezen hebben. Het is zeer belangrijk om te overwegen of deze techniek de normale anatomie en / of gedrag van de dieren beïnvloedt bij het plannen van experimenten. Gedragsgroepen moeten altijd worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat er geen significante veranderingen zijn in het basisgedrag dat kan leiden tot confounding experimentele resultaten.

Met behulp van deze miniaturiseerde, mobiele Ca 2+ beeldvormingstechniek met neurofarmacologische manipulatie, verschillende cognitieve, sociale, motorische of intrinsieke gedragsparadigma's, en het combineren met andere fysiologische metrischen kunnen de studies worden verdiept en verrijkt die gericht zijn op het begrijpen van de functionele rollen van neurale schakelingen in gedrag en signaal Verwerking 32 . Onderdrukking of actiefAtion van bepaalde pathes, gemoduleerd door drugs, kan bijbehorend gedrag beïnvloeden, die gemakkelijk met deze technologie kan worden bestudeerd 33 . Uitbreiden in verschillende celtypes door de targeting van de calciumindicator te wijzigen is een andere krachtige en handige applicatie, en maakt het mogelijk om veel creatieve combinaties van experimentele hulpmiddelen aan te passen aan diverse neurale schakelvragen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben het beleid van het tijdschrift gelezen en hebben de volgende concurrerende belangen: SG, SO en VC zijn betaalde werknemers bij Inscopix.

Dankbetuigingen

De auteurs danken V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger en K. Svoboda van het Genetisch-Gecodeerde Neuronale Indicator en Effector (GENIE) Project op Janelia Research Campus van het Howard Hughes Medical Institute voor hun royale donatie van AAV1-GCaMP6f Naar de Universiteit van Pennsylvania Vector Core. Zij willen ook de A. Olson en Neuroscience Microscopy Core aan de Stanford University bedanken, ondersteund door NIH NS069375 subsidie ​​voor hun confocale microscopiediensten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Neurostar Motorized
Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument		KopfModel 963SDChirurgie
StereoscopeLabomedPrima DNTChirurgie en Beeldvorming
Mini Rectal Thermistor Probe (.062"/1.6 mm diameter) - 1/4" JackFHC40-90-5D-02Chirurgie
Heating Pad 5 X 12.5 cm FHC40-90-2-07Chirurgie
DC Temperature ControllerFHC40-90-8DChirurgie
Microsyringe PumpWorld Precision InstrumentsUMP3 model; serial 155788 F110Chirurgie
NanoFil 10 μL SyringeWorld Precision InstrumentsNANOFILChirurgie
35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PKWorld Precision InstrumentsNF35BV-2Chirurgie
Omnidrill35, 115 - 230 VWorld Precision Instruments503598Chirurgie
Burrs for Micro DrillFine Science Tools19007-05Chirurgie
nVistaInscopix100-001048Beeldvorming
AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40Penn Vector CoreAV-1-PV3435Chirurgie
KetoprofenVictor Medical5487Chirurgie
CarprofenVictor Medical1699008 Chirurgie
IsofluraneVictor Medical1001054Chirurgie
Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12 cm x 7 mm)Pfizer (Fisher Scientific)NC9841478Chirurgie
Dumont #5/45 forcepsFine Science Tools11251-35Chirurgie
Dumont #5 forcepsFine Science Tools11251-30Chirurgie
Dissecting knivesFine Science Tools10055-12Chirurgie
ProView Implant KitInscopix100-000756Chirurgie en Beeldvorming
ProView Prism Probe 1.0 mm-Dia. ~4.3 mm LengthInscopix100-000592Chirurgie en Beeldvorming
Kwik-Sil adhesive pack of 2World Precision InstrumentsKWIK-SILChirurgie
Kwik-Cast SealantWorld Precision InstrumentsKWIK-CASTChirurgie en Beeldvorming
Miniature Optical Mounting PostNewportM-TSP-3Beeldvorming
Microscope BaseplateInscopixBPL-2Beeldvorming
Microscope Baseplate CoverInscopixBPC-2Beeldvorming

Referenties

  1. McConnell, S. K. Development and decision-making in the mammalian cerebral cortex. Brain Res. 472 (1), 1-23 (1988).
  2. Kwon, S. E., Yang, H., Minamisawa, G., O'Connor, D. H. Sensory and decision-related activity propagate in a cortical feedback loop during touch perception. Nat. Neurosci. 19 (9), 1243-1249 (2016).
  3. Miller, E. K., Cohen, J. D. An integrative theory of prefrontal cortex function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 167-202 (2001).
  4. Bailey, M. R., Simpson, E. H., Balsam, P. D. Neural substrates underlying effort, time, and risk-based decision making in motivated behavior. Neurobiol. Learn. Mem. 133, 233-256 (2016).
  5. Dehaene, S., Changeux, J. P. Reward-dependent learning in neuronal networks for planning and decision making. Prog. Brain Res. 126, 217-229 (2000).
  6. Ferenczi, E. A., et al. Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behavior. Science. 351 (6268), aac9698(2016).
  7. Anomal, R. F., et al. Impaired Processing in the Primary Auditory Cortex of an Animal Model of Autism. Front. Sys. Neurosci. 9, 158(2015).
  8. Pauls, D. L., Abramovitch, A., Rauch, S. L., Geller, D. A. Obsessive-compulsive disorder: an integrative genetic and neurobiological perspective. Nat. Rev. Neurosci. 15 (6), 410-424 (2014).
  9. Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nat. Neurosci. 16 (3), 264-266 (2013).
  10. Jennings, J. H., et al. Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2015).
  11. Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
  12. Sun, C., et al. Distinct speed dependence of entorhinal island and ocean cells, including respective grid cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (30), 9466-9471 (2015).
  13. Kitamura, T., et al. Entorhinal Cortical Ocean Cells Encode Specific Contexts and Drive Context-Specific Fear Memory. Neuron. 87 (6), 1317-1331 (2015).
  14. Pinto, L., Dan, Y. Cell-Type-Specific Activity in Prefrontal Cortex during Goal-Directed Behavior. Neuron. 87 (2), 437-450 (2015).
  15. Cox, J., Pinto, L., Dan, Y. Calcium imaging of sleep-wake related neuronal activity in the dorsal pons. Nat. Comm. 7, 10763(2016).
  16. Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat. Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
  17. Hooks, B. M., et al. Organization of cortical and thalamic input to pyramidal neurons in mouse motor cortex. The J. Neurosci. 33 (2), 748-760 (2013).
  18. Masamizu, Y., et al. Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task. Nat. Neurosci. 17 (7), 987-994 (2014).
  19. Rowland, D. C., Moser, M. -B. From cortical modules to memories. Curr. Opin. Neurobiol. 24 (1), 22-27 (2014).
  20. Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nat. Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
  21. Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
  22. Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).
  23. Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nat. Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).
  24. Chia, T. H., Levene, M. J. In vivo imaging of deep cortical layers using a microprism. J. Vis. Exp. (30), (2009).
  25. Chia, T. H., Levene, M. J. Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging. J. Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).
  26. Chia, T. H., Levene, M. J. Multi-layer in vivo imaging of neocortex using a microprism. Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (8), pdb.prot5476 (2010).
  27. Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (52), 18739-18744 (2014).
  28. Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
  29. Hawrylycz, M., et al. Inferring cortical function in the mouse visual system through large-scale systems neuroscience. Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (27), 7337-7344 (2016).
  30. Petrof, I., Viaene, A. N., Sherman, S. M. Properties of the primary somatosensory cortex projection to the primary motor cortex in the mouse. J. Neurophysiol. 113 (7), 2400-2407 (2015).
  31. Aronoff, R., et al. Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex. Euro. J. Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).
  32. Rogan, S. C., Roth, B. L. Remote control of neuronal signaling. Pharma. Rev. 63 (2), 291-315 (2011).
  33. Berdyyeva, T., et al. Zolpidem reduces hippocampal neuronal activity in freely behaving mice: a large scale calcium imaging study with miniaturized fluorescence microscope. PloS One. 9 (11), e112068(2014).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Corticale calciumimagingimplantatie van Prism probessomatosensorische cortextweefotonmicroscopiekopgemonteerde microscoopbevestiging van de basisplaatvirale labelingcalciumdynamiek

Gerelateerde artikelen