Dit protocol toont hoe planarian ogen (optische koppen) consistent snijden zonder verstoring omliggende weefsels. Via een insuline naald en spuit, een of beide ogen kunnen worden geablateerd voor onderzoek naar de mechanismen reguleren oog regeneratie, de ontwikkeling van visuele regeneratie en de neurale basis van door licht geïnduceerde gedragingen vergemakkelijken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Chirurgische Ablation Assay voor het bestuderen van Eye Regeneratie in planarians
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In de studie van volwassen stamcellen en regeneratieve mechanismen, planarian platwormen zijn een nietje in vivo modelsysteem. Dit is grotendeels te danken aan hun overvloedige pluripotente stamcellen bevolking en het vermogen om alle cellen en weefsels types na verwondingen die katastrofisch voor de meeste dieren zou regenereren. Onlangs hebben planarians populairder geworden als een model voor oog regeneratie. Hun vermogen om het gehele oog regenereren (bestaande uit twee weefseltypen: pigmentcellen en fotoreceptoren) maakt de dissectie van de mechanismen reguleren visuele systeem regeneratie. ablatie oog heeft verschillende voordelen boven andere technieken (zoals onthoofding of gaten) voor de behandeling oogspecifieke pathways en mechanismen, de belangrijkste daarvan is dat regeneratie grotendeels beperkt tot alleen oogweefsels. Het doel van deze video artikel is om te demonstreren hoe de planarian optische kop op betrouwbare wijze te verwijderen zonder de hersenen verstoren of de omliggende weefsels.De behandeling van wormen en het onderhoud van een gevestigde kolonie wordt ook beschreven. Deze techniek maakt gebruik van een 31 G 5/16 inch insuline naald operatief schep de optische kop planarians geïmmobiliseerd op een koude plaat. Deze werkwijze omvat zowel enkele als dubbele oog ablatie, met de ogen regenereren binnen 1-2 weken, waardoor een groot aantal toepassingen. In het bijzonder kan deze ablatietechniek goed te combineren met farmacologische en genetische (RNA interferentie) schermen voor een beter begrip van regeneratieve mechanismen en hun evolutie, oog stamcellen en hun onderhoud en phototaxic gedragsreacties en de neurologische basis.
Inleiding
Planarians een krachtige modelorganisme voor het bestuderen van volwassen stamcellen celgemedieerde regeneratie. Deze niet-parasitaire zoetwater platwormen bezitten het vermogen om alle ontbrekende weefsels, waaronder het centrale zenuwstelsel en de hersenen 1 regenereren. Bestudeerde al in 1700 2, technologische ontwikkelingen op het gebied planarian de afgelopen 10-15 jaar (zoals een gesequenced genoom, in situ hybridisatie, immunohistochemie, RNA interferentie (RNAi) en transcriptomics) hebben deze historische modelorganisme bijgewerkt . In het bijzonder, hebben planarians onlangs steeds populairder geworden als een opkomend model voor oog onderzoek 3.
Planarians hebben prototypische ogen met twee weefseltypen de fotoreceptor neuronen en pigmentcellen; Dit is de karakterisering van zijn oog stamcellen populatie ingeschakeld en toonden dat veel van de genen die de vertebrate eyekeling zijn geconserveerd in planarians 4, 5. De optische bekers dorsaal gelegen en uit de witte, ongepigmenteerde dendrieten van de fotoreceptor neuronen en halve maanvormige zwarte pigmentcellen en de ogen innerveren de hersenen via een optische opticum. Naast het feit dat een model voor het ophelderen van regeneratieve processen 6, planarian het oog is geschikt voor het bestuderen van de ontwikkeling van automomous 7, gedragsreacties licht (planarians weer negatief phototaxis) 8 en de neurologische basis van het gedrag 9.
Eye regeneratie planarians is grotendeels bestudeerd in twee situaties: in het kader van kopregeneratie onthoofding na 4, 10, en na excisie van alleen de oogweefsels 11, 12 . De meeste planarian studies op het oog van de regeneratie hebben de onthoofding methode, want het is eenvoudig en ongecompliceerd. De meest voorkomende planarian oog excisie methode tot nu toe was verbindingsgat buisje met een fijne glazen capillaire buis 13, 14, hoewel sommige studies hebben ook uitgevoerd amputaties net achter de ogen (gedeeltelijke onthoofding) 15. Echter, al deze methoden omvatten het verlies van andere dan alleen het oog vele weefsels (zoals de hersenen, darmen, en nephridia), potentieel complicerende interpretatie van de resultaten. Het oog ablatie protocol hier gepresenteerde beperkt excisie aan de oogweefsels (met uitzondering van met hersenen), wat resulteert in gegevens die specifieker zijn voor het oog. Bovendien, in tegenstelling onthoofd wormen die 7-14 dagen om voeding te beginnen, zal Eye weggenomen wormen voeden binnen 24 uur ablatie 12, waardoor RNAi experimenten (waar RNAi via voedsel wordt geleverd) wordt performed gelijktijdig.
Hoewel oog ablatie is technisch moeilijker om met succes uit te voeren dan onthoofding, hebben de huidige studies met oog uitsnijding niet inbegrepen gedetailleerde instructies over hun procedures. Het doel van deze video artikel is onderzoekers in staat te stellen de planarian optische kop consequent te verwijderen zonder de onderliggende hersenweefsel en het verwijderen van zo weinig andere weefsels mogelijk te maken. Deze werkwijze kan worden gebruikt voor zowel enkele als dubbele oog ablatie en is toepasbaar op een groot aantal onderzoeken. Zoals de meeste regeneratie testen oog wordt ablatie goed geschikt voor combinatie met zowel farmacologische en genetische (RNAi) schermen en gedragsonderzoek. Hier beschrijven we methoden voor de behandeling van wormen, het handhaven van een planarian kolonie, en het oog ablatie techniek zelf.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Dierlijke Cultuur en Handling
Opmerking: In dit protocol wordt Schmidtea mediterranea, een diploïde planarian soort met een genoom gesequenced 16, 17 die gewoonlijk wordt gebruikt voor regeneratie onderzoek. De test is even succesvol bij andere soorten, zoals tijgerplatworm en girardia dorotocephala (die commercieel verkrijgbaar zijn).
- Handhaven wormen "worm water" van de 0,5 g / l zeezouten in ultrazuiver (of gefilterd gedeïoniseerd) water. Gebruik steriele polypropyleen of glazen containers naar de worm water vast te houden. Zie aanvullend bestand 1 voor meer informatie over worm water voorbereiding.
LET OP: Gebruik nooit zeep om containers (of andere benodigdheden) als zeep te reinigen is giftig voor wormen; plaats af met 70% ethanol en aan de lucht drogen.- Draag handschoenen tijdens het werken met planaria om hen te beschermen tegen besmetting.
LET OP: Worms zijn erg gevoelig voor milieu-toxines en chemicaliën, met inbegrip van zeep, bleekmiddel, shampoo, conditioner, en met de hand lotion.
- Draag handschoenen tijdens het werken met planaria om hen te beschermen tegen besmetting.
- Huis kolonies in polypropyleen houders, waarbij het deksel gedeeltelijk open gelaten voor luchtuitwisseling bij ~ 20 ° C (kamertemperatuur). Opslag experimentele wormen in beide petrischalen (20 wormen per 100 mm plaat) of niet-behandelde weefsel-kweekplaten (1 worm per putje voor platen met 12 putjes). Om stress te verminderen, houd beide kolonies en experimenten in het donker.
LET OP: Colonies mag niet meer dan 500-1000 wormen per liter worm water te hebben. Voor experimenten, laat deksels volledig op zijn plaats, omdat de luchtstroom is ontworpen om in deze gerechten. - Feed niet-experimentele wormen een keer per week met gepureerde biologisch rundvlees of kip lever door het droppen van puree van een transfer pipet, het plaatsen van druppels van voedsel door de container. Toestaan wormen 2 uur om voedsel te consumeren in dedonker vóór het reinigen out container (zie stap 1.4). Voorafgaand aan gebruik, opslag puree bij -20 ° C voor korte termijn (weken) of -80 ° C voor lange termijn (maanden); do puree niet opnieuw invriezen voor hergebruik (zoals bacteriën kunnen bloeien en schadelijk zijn voor de wormen).
OPMERKING: Liver mag geen hormonen of antibiotica bevatten en bij voorkeur niet eerder worden ingevroren. Centrifuge puree voor het invriezen (of vóór het voeren) om lucht te verwijderen en te voorkomen dat voedsel drijven. Voedsel moet zinken naar de bodem van de container. 1 ml puree volstaat 500-1000 wormen. - Exchange water een keer per week met verse worm water voor zowel de kolonies en experimenten. Colony containers moeten ook naar beneden worden afgeveegd met een ongebleekt papieren handdoek (om slijm resten te verwijderen die val afval) een keer per week voor uitgehongerde wormen, of twee keer per week voor het voeden van wormen (2 uur na het voeden en weer 2 dagen later). Om de biofilm behouden door niet met meer dan 80% van de houder.
- Verplaats wormen tussen de containers (of een operatie Setup) met een transferpipet. Om vrij wormen gehecht aan houderoppervlakken, spuiten water boven / achter de worm om deze uit het oppervlak. zuigen vervolgens de worm in de pipet, terwijl het proberen om de worm in de bodem inch (dunner) gedeelte van de pipet te houden.
- Backload pipetten met een kleine hoeveelheid van de worm water voordat zuigen ze op.
- Probeer om het water rond de worm te verplaatsen, in plaats van de worm zelf, om te voorkomen dat scheuren soft-bodied wormen door ze aan te raken met de pipet.
- Houd experimentele gerechten vallen, tenzij de overdracht van wormen of het vervangen van water.
2. Bereiding
- Stop het voeden wormen ten minste een week voorafgaand aan de experimenten.
- Selecteer wormen die zijn niet gevoed ≥1 week en ten minste 5-7 mm in lengte. Breng de wormen een petrischaal 2/3 met water worm en bevestig worm lengte door er met een liniaal onder de schotel. meten wOrms met volledige uitgeschoven en bewegen.
OPMERKING: Tijdens kleiner (5-7 mm) wormen werken beter bij het uitvoeren van latere immunofluorescentie en in situ hybridisatie analyses, grotere wormen (8-10 mm) zijn gemakkelijker om mee te werken - met name bij het leren ablate. - Zorg ervoor dat de wormen zijn geheel, onbeschadigd en niet recent regenereren.
OPMERKING: Regenereren wormen zal veel lichter (of geen) pigment in het hoofd en / of de staart regio in vergelijking met normale wormen. - Als het uitvoeren van RNAi of farmacologische behandelingen op wormen, doe dat dan op dit moment. Indien wormen werden toegevoerd als onderdeel van de behandeling (zoals voor RNAi), wacht ten minste 7 dagen na de laatste voeding alvorens verder met stap 2.2.
- Selecteer wormen die zijn niet gevoed ≥1 week en ten minste 5-7 mm in lengte. Breng de wormen een petrischaal 2/3 met water worm en bevestig worm lengte door er met een liniaal onder de schotel. meten wOrms met volledige uitgeschoven en bewegen.
- Reinig de werkruimte en dissectiemicroscoop basis met 70% ethanol en laat het dan volledig opdrogen. Zet de schaal van de geselecteerde wormen aan de linkerkant van de scope. Rechts van het toepassingsgebied, plaats een paar # 5 tang, een 31 G 5/16 inch insuline naald met een 1ml spuit en een schone overdracht pipet.
- Waarborgen dat de instrumenten niet tegen de bank (die verontreinigingen kan voorstellen) worden gehouden. Met een stijf voorwerp (bijvoorbeeld een eetstokje rust) om de tang, naald, pipet en schoon te houden. Als alternatief, plaats instrumenten op de top van een verse bruine (ongebleekt) papieren handdoek.
LET OP: Deze en volgende instructies zijn geschreven als ze betrekking hebben op rechtshandig personen. Linkshandige mensen moeten de links / rechts richting te keren.
- Waarborgen dat de instrumenten niet tegen de bank (die verontreinigingen kan voorstellen) worden gehouden. Met een stijf voorwerp (bijvoorbeeld een eetstokje rust) om de tang, naald, pipet en schoon te houden. Als alternatief, plaats instrumenten op de top van een verse bruine (ongebleekt) papieren handdoek.
- Naast de werkruimte, plaats een doos met pluisvrij doekje doekjes, een bron van zoet worm water, en een aantal extra pipetten (beschermd tegen de bank boven). Plaats worm water in een plastic spuitfles voor het gemak van doseren. Plaats ook een gelabelde 12-putjesplaat (of 100 mm petrischaal) rechts van de mogelijkheden voor het verzamelen van dieren geablateerd.
- Bij gebruik van een op maat gemaakte Peltier plaat wormen immobiliseren, plaats de Peltier plaat in de holte in tHij onderkant van de dissectiemicroscoop en stel de uitgang van de DC-voeding tot het werkoppervlak van de Peltier plaat voldoende is afgekoeld (gewoonlijk -5 V) .Alternatively, maak een koude plaat vult een 100 mm petrischaal ½ vol met water en vries gedurende ten minste 24 uur. Gooi het deksel en plaats de bodem van de schaal van 100 mm op basis van het ontleden scope en plaats het deksel van een 60 mm petrischaal omgekeerd direct op het oppervlak van het ijs (Figuur 1A).
- Nadat het water is bevroren in de schaal van 100 mm, een "vulkaan" ijs verschijnen in het midden van de plaat. Als dit gebeurt, gebruik een scheermesje om het ijs vlakke schrapen, om eventuele onregelmatigheden van het oppervlak te verwijderen.
LET OP: Tijdens operaties het ijs zal smelten, waardoor ablaties veel moeilijker. Bereid een aantal ijs gerechten op voorhand, en vervang diepvriesproducten voor het smelten van degenen die tijdens de test zodra het deksel van de 60 mm gerecht begint zweven.
- Nadat het water is bevroren in de schaal van 100 mm, een "vulkaan" ijs verschijnen in het midden van de plaat. Als dit gebeurt, gebruik een scheermesje om het ijs vlakke schrapen, om eventuele onregelmatigheden van het oppervlak te verwijderen.
- Bereid dechirurgie oppervlak. Snijd een 5 cm x 10 cm stuk plastic paraffinefilm (4 cm2 bij gebruik van de petrischaal koude plaat) en plaats het op het midden van de fixeerinrichting. Vouw een pluisvrije tissue wipe in een vierkant ongeveer 2 cm2 en plaatst deze bovenop de film. Snijd een stuk wit filterpapier 1,5-2 cm2 en zet deze boven van het afveegdoekje. Zie Figuur 1B-1E.
- Houd de gevouwen vegen op zijn plaats met een gehandschoende vinger, en gebruik worm water om licht te dempen het doekje te zorgen dat het blijft gevouwen. Met de zijkant van een transferpipet te rollen het doekje flat.
OPMERKING: Cold temperatuur helpt om wormen in beweging te houden. Werken "droge" helpt ook bij immobilisatie. Het weefsel wipe werkt om water opzuigen door het filterpapier, waarbij de worm vochtig tijdens de operatie zonder dat wormen volledig laten drogen (die dodelijk).
- Houd de gevouwen vegen op zijn plaats met een gehandschoende vinger, en gebruik worm water om licht te dempen het doekje te zorgen dat het blijft gevouwen. Met de zijkant van een transferpipet te rollen het doekje flat.
3. Chirurgische Ablatie
- Gebruik een transfer pipet om op te plaatsene worm dorsale zijde naar boven op de filter papier. Draai de lichtbron en richt de goosenecks zodat het licht is gericht op de worm. Stel het ontleden scope focus en vergroting, zodat de ogen zijn duidelijk zichtbaar (het hele worm niet hoeft te worden in het oog); 5X vergroting is een goed uitgangspunt. Oriënteren de worm door aan de paraffinefilm zodat de kop gericht is naar de onderzoeker (naar de voorzijde van de microscoop), hoekig 30-40 graden naar rechts.
- Vermijd het gebruik van felle licht om overtollige worm beweging te voorkomen. Planarians tonen negatieve phototaxis en zal proberen aan fel licht te ontwijken.
- Indien de worm gepositioneerd ventrale zijde naar boven (met faryngeale opening zichtbaar) Gebruik de doffe kant van de tang voorzichtig positie van de worm dorsale zijde naar boven (met de ogen zichtbaar). Vermijd het naderen van het dier met de scherpe punt van de tang om de kans op scheuren door zachte weefsels bij de herpositionering van de dieren zo weinig mogelijk.
- Pas de microscoop scherpstelling zodat de ogen zijn duidelijk in focus. Ook voor zorgen dat zowel de ogen en de omliggende hoofd weefsels in het zicht staan.
- Houd een nieuwe naald / spuit in de rechterhand alsof het een pen (tussen duim en wijsvinger). Brace de linker duim tegen de Peltier plaat (of petrischaal koude plaat) en gebruikt de linker duim als een draaipunt, waarop de bodem van de spuit rusten (figuur 2A). Kijk door de microscoop, en zorg ervoor dat de schuine kant van de naald zichtbaar is.
LET OP: Naalden zijn erg scherp. Wees voorzichtig bij de omgang met hen. Het dragen van latex of nitril kan enige bescherming bieden.- Gebruik de linker duim te helpen houden de naald / spuit stabiel gedurende de procedure en te voorkomen dat handen schudden.
- Maak een hoek van ongeveer 40 ° met de linker duim en linker wijsvinger (met de wijsvinger op de operatie oppervlak) om te helpen houden de operatie oppervlak stabiel.
- Metde schuine kant van de naald naar boven gericht (zoals een lepel), plaatst de naald loodrecht op het oog (figuur 2B). Met de punt van de naald subtiel in de dunne laag weefsel boven de optische kop (wit gepigmenteerde gebied) van het oog, scheppen van rechts naar links. Zeer verwijder voorzichtig gepigmenteerde weefsel zich in de optische kop, verzorgen de bodem niet te doorboren en de grenzen van de optische kop te vernietigen.
- Indien de worm op het filtreerpapier gedurende> 1-2 min is op enig moment tijdens de procedure, één druppel water worm de worm rehydrateren.
OPMERKING: Uitdroging zal de gevoeligheid van de worm te verhogen tot scheuren verwondingen.
- Indien de worm op het filtreerpapier gedurende> 1-2 min is op enig moment tijdens de procedure, één druppel water worm de worm rehydrateren.
- Herhaal stap 3.3 totdat alle zwart gepigmenteerd weefsels (pigmentcellen), alsook elk van witte weefsels van de optische kop (dendrieten van de fotoreceptor cellen) worden verwijderd. Verwijderen uitgesneden weefsels vast aan het uiteinde van de naald door voorzichtig afvegen met een tissue afvegen. Als dubbele oog ablatie is gewenst ablatie het tweede oog op dit punt.
Opmerking: Om verwonding te voorkomen, kunnen naalden worden gereinigd door het grijpen van de naald met een schone tissue wipe gehouden met de duim en wijsvinger, vervolgens met de andere hand de naald te trekken door het wegvegen van de duim en wijsvinger. Als alternatief kan de naald worden geveegd op het oppervlak van een natte tissue wipe en onderzocht op reinheid. - Wanneer u klaar bent, gebruik maken van een transfer pipet om de worm te verplaatsen naar een gelabeld schaal met vers worm water. Wanneer het analyseren groepsgegevens plaatst tot 20 wormen in een 100 mm petrischaal. Indien het volgen regeneratie in dezelfde individuen de tijd, plaats 1 worm in elk putje van een 12-wells plaat. Zodra alle wormen worden overgebracht, spoel wormen door alle worm water van de borden / putten en te vervangen door meer verse worm water.
- Wormen uit het filter te verwijderen, backload de pipet met een kleine hoeveelheid water worm en het water vrij op de schroef. Dit moet tillen tHij worm uit het filterpapier onmiddellijk wordt gezogen in de pipet voor de overdracht.
- Incubeer experimenten bij ~ 20 ° C (kamertemperatuur) beschermd tegen licht en volg het regeneratieve proces.
OPMERKING: Wormen kunnen worden opgeslagen in een thermisch geïsoleerde incubator om een constante temperatuur te handhaven, maar dit is niet strikt noodzakelijk. De meeste kamer temperatuur varieert alleen 5 ° C, die niet van invloed op het vermogen van de worm te regenereren. - Desgewenst vast wormen voor immunohistochemie (zie figuren 3-4) en / of in situ hybridisatie analyse van genexpressie. Verschillende bevestigingsmethoden aanwezig voor planarian immunohistochemie 18, 19, 20 en in situ hybridisatie 21, 22, 23 protocollen.
- Wanneer experimenten worden gesloten, sacrifice leven wormen door het verwijderen worm water uit de schaal en te vervangen door 70% ethanol. Incubeer wormen gedurende 3-5 minuten, het controleren op wormen lyseren en draai grijsachtig.
- Plaats de niet-behandelde wormen in de normale afvalstroom eenmaal opgeofferd. Voorkomen dat er levende wormen in het milieu, met name niet-inheemse soorten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Voor de eerste 1-2 uur na de operatie, kunnen dieren vertonen verminderde beweging ten opzichte van intacte wormen (maar ze zullen nog bewegen). Indien gewenst, wormen eet binnen 24 uur van chirurgie (bijvoorbeeld voor RNAi voeding). Bij het volgen van eye regeneratie in dezelfde individuen over de tijd, zorg ervoor dat je een foto van elke worm te nemen, zowel voorafgaand aan de operatie (intact) en op 1 uur na ablatie (HPA). Per 4 dagen na ablatie (dpa) regenereren van pigmentcellen zi...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit oog ablatietechniek verbetert de huidige methoden (bijvoorbeeld gaten) door het uitsluiten hersenweefsels en beperken excisie voornamelijk aan de oogweefsels. Met de praktijk, kan deze techniek worden uitgevoerd door de meeste mensen, van technici met ervaring in microsurgeries te onervaren maar gewetensvolle undergraduate studenten. Aanbevolen wordt deze techniek vele malen worden uitgevoerd voor het gebruik in ablaties experimenten, waaronder (indien mogelijk) is bevestigd door volledige verwijdering van alle oogw...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag Michelle Deochand bedanken voor het perfectioneren van dit oog ablatie techniek, Taylor Birkholz voor hulp met de functionele assay, Michael Levin voor de anti-arrestin antilichaam en Junji Morokuma voor informatie over de Peltier platen. Dit werk werd ondersteund door een SFSA subsidie van Western Michigan University te WSB.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Instant Ocean sea salts | Spectrum Brands | SS15-10 | "10 Gallon" box (nettogewicht 3 lbs) |
| Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe | Kimberly-Clark | 34155 | 4.5 x 8.5 in |
| Whatman #2 filter paper | Sigma | WHA1002125 | Cirkels, 125 mm diameter, wit |
| Easy Touch Insulin syringe (met naald) | Pet Health Market | 17175-04 | U-100 1 cc spuit, 31 G 5/16 inch naald |
| 100 mm Petri schaal | VWR | 25384-342 | 100 mm x 15 mm |
| 60 mm Petri schaal | VWR | 25384-092 | 60 mm x 15 mm |
| Dumont #5 pincet | Fine Science Tools | 11254-20 | Inox, rechte punt, 11 cm |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | Gegradueerd, grote kop, 7.5 mL, niet steriel |
| Parafilm M paraffinefolie | Brand | 701606 | 4 inch x 125 voet rol |
| 12-wels onbehandelde weefselkweekplaat | VWR | 15705-059 | Onbehandeld, platte bodem, sterieel, Falcon merk |
| Kunststof voedselcontainers (voor kolonie) | Ziploc | Grote rechthoek | 2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16" |
| Planaria (Girardia tigrina) | Carolina Biological | 132954 | Verkocht als "Bruin" Planaria; meestal zijn ze G. tigrina (aka Dugesia tigrina), maar soms zijn ze G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); beide zullen werken. |
| Planaria (Schmidtea mediterranea) | n/a | n/a | S. mediterranea zijn niet commercieel verkrijgbaar. Op dit moment zijn dieren alleen verkrijgbaar bij laboratoria die ze gebruiken en extra dieren hebben. |
| Bruine papieren handdoeken | Grainger | 2U229 | 9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED |
| Wasfles (voor wormwater), optioneel | VWR | 16650-275 | Wasflessen, lagedichtheid Polyethyleen, Breed Mond, 500 mL |
| Anti-synapsin antilichaam, optioneel | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3C11 | Supernatant |
| Anti-arrestin antilichaam, optioneel | n/a | n/a | Niet commercieel verkrijgbaar. Vriendelijk geschenk van Michael Levin, Tufts University |
| Nalgene Lowboy carboy met kraan (voor het bewaren van wormwater), optioneel | Nalge Nunc International Corporation | 2324-0015 | 15 L, polypropyleen, lage profiel maakt het gemakkelijker om plastic koloniecontainers te vullen |
| Aangepaste Peltier plaat, optioneel | Williams Machine, Foxboro, MA | n/a | Ontwerpspecificaties met dank aan Junji Morokuma, Tufts University: De Peltier plaat is geconstrueerd uit een standaard thermo-elektrische warmtepomp (bijvoorbeeld, All Electronics Corp Catalogus # PJT-1, 30 mm2). De vierkante warmtepomp is bedekt met een dunne gespiegelde oppervlakte, vervolgens geplaatst in een 30 mm2 vierkante gat in een ronde plexiglas vorm (~50 mm in diameter). Deze vorm is van vergelijkbare dikte als de warmtepomp, en past strak in een uitgefreesd in het centrum van een ronde warmtesink (~115 mm in diameter). De vorm/warmtepomp wordt "verankerd" aan de goot met siliconen basis warmtesink compound. De kabels worden door gaten getrokken die door zowel de vorm als de warmtesink zijn geboord. De onderste helft van de warmtesink is uitgefreesd in een "voet" die past in de opening van de basisplaat van uw microscoop's. |
| DC-stroombron (voor Peltier plaat), optioneel | B & K Precision | 1665 | Geregelde lage spanning DC-voeding, 1-18 V (DC), 1-10 ampère. |
| Andere gebruikelijke benodigdheden | |||
| Handschoenen | |||
| Scheermesje | |||
| Schaar | |||
| Dissectie microscoop met zwanenhalsverlichting | |||
| Stokjeshouder, optioneel |
Referenties
- Gentile, L., Cebria, F., Bartscherer, K. The planarian flatworm: an in vivo model for stem cell biology and nervous system regeneration. Dis Model Mech. 4 (1), 12-19 (2011).
- Elliott, S. A., Sanchez Alvarado, A. The history and enduring contributions of planarians to the study of animal regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (3), 301-326 (2013).
- Emili Saló, R. B. Chapter 3. Animal Models in Eye Research. Tsonis, P. A. , Academic Press. 15-26 (2008).
- Lapan, S. W., Reddien, P. W. dlx and sp6-9 Control optic cup regeneration in a prototypic eye. PLoS Genet. 7 (8), e1002226(2011).
- Lapan, S. W., Reddien, P. W. Transcriptome analysis of the planarian eye identifies ovo as a specific regulator of eye regeneration. Cell Rep. 2 (2), 294-307 (2012).
- Inoue, T., et al. Morphological and functional recovery of the planarian photosensing system during head regeneration. Zoolog Sci. 21 (3), 275-283 (2004).
- Pineda, D., et al. The genetic network of prototypic planarian eye regeneration is Pax6 independent. Development. 129 (6), 1423-1434 (2002).
- Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength. PLoS One. 9 (12), e114708(2014).
- Raffa, R. B., Martley, A. F. Amphetamine-induced increase in planarian locomotor activity and block by UV light. Brain Res. 1031 (1), 138-140 (2005).
- Sandmann, T., Vogg, M. C., Owlarn, S., Boutros, M., Bartscherer, K. The head-regeneration transcriptome of the planarian Schmidtea mediterranea. Genome Biol. 12 (8), R76(2011).
- Vasquez-Doorman, C., Petersen, C. P. The NuRD complex component p66 suppresses photoreceptor neuron regeneration in planarians. Regeneration (Oxf). 3 (3), 168-178 (2016).
- Deochand, M. E., Birkholz, T. R., Beane, W. S. Temporal regulation of planarian eye regeneration. Regeneration. 3 (4), 209-221 (2016).
- Sakai, F., Agata, K., Orii, H., Watanabe, K. Organization and regeneration ability of spontaneous supernumerary eyes in planarians -eye regeneration field and pathway selection by optic nerves. Zoolog Sci. 17 (3), 375-381 (2000).
- Asano, Y., Nakamura, S., Ishida, S., Azuma, K., Shinozawa, T. Rhodopsin-like proteins in planarian eye and auricle: detection and functional analysis. J Exp Biol. 201 (Pt 9), 1263-1271 (1998).
- Cross, S. D., et al. Control of Maintenance and Regeneration of Planarian Eyes by ovo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7604-7610 (2015).
- Robb, S. M., Gotting, K., Ross, E., Sanchez Alvarado, A. SmedGD 2.0: The Schmidtea mediterranea genome database. Genesis. 53 (8), 535-546 (2015).
- Robb, S. M., Ross, E., Sanchez Alvarado,, A, SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database. Nucleic Acids Res. 36, D599-D606 (2008).
- Beane, W. S., Tseng, A. S., Morokuma, J., Lemire, J. M., Levin, M. Inhibition of planar cell polarity extends neural growth during regeneration, homeostasis, and development. Stem Cells Dev. 21 (12), 2085-2094 (2012).
- Forsthoefel, D. J., Waters, F. A., Newmark, P. A. Generation of cell type-specific monoclonal antibodies for the planarian and optimization of sample processing for immunolabeling. BMC Dev Biol. 14, 45(2014).
- Ross, K. G., et al. Novel monoclonal antibodies to study tissue regeneration in planarians. BMC Dev Biol. 15, 2(2015).
- Cardona, A., Fernandez, J., Solana, J., Romero, R. An in situ hybridization protocol for planarian embryos: monitoring myosin heavy chain gene expression. Dev Genes Evol. 215 (9), 482-488 (2005).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev Biol. 13, 8(2013).
- Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev Dyn. 238 (2), 443-450 (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
