Methodenartikel

Met behulp van buitengewone optische transmissie te kwantificeren cardiale Biomarkers in menselijk Serum

DOI:

10.3791/55597

⸱

13 december 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NUS Nanoscience and Nanotechnology Initiative, National University of Singapore, 2Cardiovascular Research Institute, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 3Department of Electrical and Computer Engineering, National University of Singapore, 4Institute of Materials Research Engineering, A*STAR (Agency for Science, Technology and Research)

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk beschrijft een nanoimprinting lithografie methode om kwalitatief hoogwaardige sensing matrices die op het principe van buitengewone optische transmissie werken. De biosensor is lage kosten, robuust, makkelijk te gebruiken, en kan detecteren cardiale troponine ik in serum op klinisch relevante concentraties (99th percentiel cutoff ∼10-400 pg/mL, afhankelijk van de test).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor een biosensing platform dat klinische relevantie in point-of-care (POC) instellingen, zijn assay gevoeligheid, reproduceerbaarheid, en het vermogen om te controleren op een betrouwbare manier analyten tegen de achtergrond van menselijk serum cruciaal.

Nanoimprinting lithografie (nihil) werd gebruikt voor het fabriceren, tegen een lage prijs, sensing gebieden zo groot als 1.5 x 1.5 mm. Het sensing oppervlak werd gemaakt van HiFi-arrays van nanoholes, elk met een oppervlakte van ongeveer 140 nm2. De grote reproduceerbaarheid van nihil maakte het mogelijk een strategie van het één-chip, een-meting op 12 individueel vervaardigde oppervlakken, met minimale chip-op-Spaander variatie in dienst. Deze nanoimprinted gelokaliseerd oppervlakte plasmon resonantie (LSPR) chips waren uitgebreid getest op hun vermogen om op een betrouwbare manier meten een bioanalyte in concentraties variërend van 2,5 tot 75 ng/mL in het midden van de achtergrond van een complex biofluid-in dit geval, menselijk serum. De hifi van nihil stelt de generatie van grote sensing gebieden, die op zijn beurt de noodzaak van een Microscoop, elimineert zoals deze biosensor kan gemakkelijk worden geïnterfacet met een lichtbron van algemeen beschikbare laboratorium. Deze biosensoren kunnen cardiale troponine detecteren in serum met een hoge gevoeligheid, bij een limiet aantoonbaarheidsgrens (LOD) voor 0.55 ng/mL, die klinisch relevant is. Ze tonen ook lage chip-op-Spaander afwijking (als gevolg van de hoge kwaliteit van de productie-procédé). De resultaten zijn commensurabele met gebruikte enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-gebaseerd testen, maar de techniek behoudt de voordelen van een LSPR gebaseerde sensing platform (dat wil zeggen, inschikkelijkheid miniaturisatie en multiplexing, waardoor het meer haalbaar voor POC toepassingen).

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chemische sensoren op basis van nanohole matrices zijn een onderwerp van talloze onderzoeken sinds het eerste verslag over buitengewone optische transmissie (EOT) werd gepubliceerd door Ebbesen et al. in 19981. Wanneer licht inbreuk op periodieke arrays van nanohole structuren van sub golflengte dimensies maakt, verbeterde transmissie gebeurt bij specifieke golflengten. Dit gebeurt wanneer het incident lichte met Bloch-Golf oppervlakte polariton (BW-SPP) en/of gelokaliseerde oppervlakte plasmons (LSP)2 paren.

De onderliggende fysieke principe misbruikt wanneer biosensing met dergelijke periodieke arrays eenvoudig is. Adsorptie van moleculen op of in de buurt van de interface van metaal verandert de diëlektrische constante van het medium in contact met het metaal, op zijn beurt het verschuiven van de locatie van de transmissie-bands in het spectrum. Het spectrum zelf kan worden aangepast door de vorm, de grootte en scheiding afstand3,4,5nano-engineering. Inherent aan het ontwerp hebben sensoren op basis van EOT karakteristiek bands in hun spectra die specifieke toewijzingen6,7,8 te gedurende de behandeling van moleculaire binding gebeurtenissen vergemakkelijken. Dit is een cruciaal voordeel ten opzichte van commercieel beschikbare oppervlakte plasmon resonantie (SPR) platformen.

Sensoren met behulp van EOT meestal betrekken een lichtbron optisch uitgelijnd zodanig zijn dat een collimated balk incident op het sensing oppervlak. Technieken voor het genereren van grote nanohole oppervlakken, zoals co-polymeer sjablonen en interferentie en nanosphere lithografie, hebben arme reproduceerbaarheid9. Vanwege deze beperkingen in het nauwkeurig het fabriceren van grote oppervlakken die aantonen dat het verschijnsel van EOT, moest een optische Microscoop correct positie van de lichtbron en detector. Ter vereenvoudiging van de techniek, de hoge kwaliteit nanoimprinting lithografie (nihil)10 werkte. Hierdoor is de productie van grote sensor oppervlakten11 (mm-schaal), het verwijderen van de noodzaak van een microscoop om te zoeken naar het sensing oppervlak op een chip. In plaats daarvan, deze sensor gemakkelijk kon worden geïnterfacet met een standaard optische glasvezelkabel.

Aangezien de pieken van de overdracht voor deze nanohole array zijn vervat in het zichtbare gebied nabij-infrarood (NIR), is het perfect geschikt voor sensing bindende gebeurtenissen voor biomoleculen in een waterige omgeving. De verwachte optische werking van de nanohole matrix werd gesimuleerd. Het resultaat werd vervolgens gecontroleerd door middel van studies met vloeistoffen van standaard refractieve indexen (RI). Deze matrix werd vervolgens gebruikt voor het meten van de concentratie van cardiale troponine ik (cTnI) in de complexe achtergrond van menselijk serum. cTnI is de klinische gouden standaard voor de diagnose van acuut myocardinfarct.

Met behulp van deze sensor, is het mogelijk om te detecteren en kwantificeren van cTnI in menselijk serum tegen een limiet aantoonbaarheidsgrens (LOD) voor 0.55 ng/mL, die klinisch relevant is. De detectie is veel sneller dan de meest technologie in dit domein, de enzym-verbonden immunosorbent analyse (ELISA gebruikte). Anderzijds het sensing oppervlak kan gemakkelijk worden opnieuw gegenereerd en daarom hergebruikt. Vandaar, dit werk toont de belofte van nanohole arrays als een levensvatbare point-of-care (POC) technologie voor biosensing binnen complexe biofluids.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. fabricage van de Sensor en de verwerving van de gegevens

  1. Voorbereiding van de nikkel-schimmel
    1. Jas een 220 nm-dikke laag van negatieve elektronenbundel weerstaan op een 600 µm dik 4-in silicium wafer. Schrijf de ontworpen nanohole array op deze wafer met behulp van een electron beam lithografie systeem.
      1. Om te versnellen van de e-balk schrijven, schrijven de patronen met een laag dotmap (N) van 20k voor elke veldlengte 300 µm (A) (dat wil zeggen, er zijn 0,4 miljard dots toegewezen op elk gebied van de2 300 µm en elke stip zal ofwel worden blootgesteld door de e-bundel of niet afhankelijk van het ontwerp van het patroon). De e-bundel weerstaan blootstelling dosis voor het weerstaan ingesteld op 110 µC cm−2 en schrijven op een stroom (I) van 800 pA.
        Opmerking: E-bundel schriftelijk, de blootstelling dosis (D) wordt gecontroleerd door de belichtingstijd voor elke stip (Tstip), berekend door figure-protocol-1 . Voor de blootstelling dosis op 110 µC cm−2is de e-bundel woning tijd op elke blootgestelde stip 0,5 µs12. Omdat de matrix een oppervlakte van 1,8 mm2 vangt, zijn er een totaal van 36 patches van 300-µm2 veld gebieden elkaar gestikt aan vorm één grote, gouden nanohole array.
    2. Ontwikkelen van de weerstaan door het onderdompelen van de 4 inch silicium wafer in de oplossing van de ontwikkelaar voor 10 s en laten de wafer drogen in de lucht.
    3. Een laag van zaad van een metaal, zoals aluminium, nikkel en koper op het silicium wafer storten.
    4. Electroplate de wafer in een beplating systeem in een bad van nikkel sulfamate. Verrichten de galvaniseren in twee stappen. In de eerste stap, duurzame 95 min, gebruikt een stroomdichtheid van 0,7 A dm−2; Dit wordt de nanopatterns volledig gevuld met nikkel. In de tweede stap, duurzame 125 min, 12 A dm−2 gebruiken tot 300 µm als de laatste nikkel schimmel dikte (20 nm). Zorgen dat de pH-waarde op 3.5-3.8 is en dat de temperatuur bij 52-54 ° C.
    5. De nikkel-mal van het silicium substraat scheiden door zachte mechanische kracht toe te passen. Geniet van de nikkel-schimmel in ongeveer 100 mL positieve fotoresist verwijdering reagens 's nachts weg te wassen het residu van de e-bundel weerstaan.
    6. Voeden de schimmel van nikkel in een oven en droog het bij 100 ° C gedurende 3 h. schoon te maken in een plasma etsen systeem met O2 gas bij 10 sccm en 100 W gedurende 3 minuten.
  2. Fabricage van de gouden nanostructuur
    1. Jas van 150 µL van heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl trichlorosilane (FDTS) op de mal van nikkel in een zelf-assemblage enkelgelaagde (SAM) coating machine bij 80 ° C.
      Opmerking: Dit zal een anti-lijm laag, waardoor de scheiding van de mal van de fotoresist ("demolding") zal na de voltooiingvan de nanoimprinting stap vormen. Het verdampen tijd moet 180 s, en de reactietijd moet 900 s.
    2. Colofon van de nanopatterns op een 4 - in glas wafer die heeft zijn bekleed met een 300 nm-dikke laag van foto-drogende nihil weerstaan met behulp van een nano-imprinter een druk van 10 bar en een temperatuur van 40 ° C gedurende 10 minuten.
    3. De mal, de fotoresist en de glas-wafer overbrengen met een UV-licht uithardende systeem en photocure met 75 mW cm-2 van UV blootstelling voor 30 s.
      Opmerking: Als alle stappen correct gevolgd, de nikkel-schimmel moet gemakkelijk worden demolded uit de fotoresist.
    4. Een reactive ion etching (RIE) systeem, Voer in een lege etsen van de fotoresist op het glas-substraat, met een O-2 gasstroom van 10 sccm, op 50 W voor 2 s om het glas op de ingesprongen gebieden bloot te stellen.
    5. Storten een 5 nm-dikke laag van chroom (Cr) voor metalen hechting en een 100 nm van goud (Au) voor de Enterprise sensor op de wafer glas in een elektronenbundel afzetting machine. Gebruik een afzetting tarief van 1 Å s−1 voor Cr en 2 Å s−1 voor Au.
    6. Astronauten van de fotoresist uitvoeren door O2 plasma etsen gedurende 3 minuten gevolgd door een 15-s sonification stap in aceton.
    7. Dobbelstenen het monster in 5 mm × 5 mm chips. De nanohole matrix zal bezetten de centrale 2 mm × 2 mm van de chip.
  3. Overname van de gegevens
    1. Het apparaat instellen om de optische metingen zodanig dat een witte lichtstraal verlaten tot het einde van de zender optische vezel is collimated en incident op het sensoroppervlak (nanohole array) op 90 is °.
      Opmerking: Licht wordt overgedragen via de hele nanohole array.
    2. Het verzonden signaal met de ontvanger optische vezel verzamelen en opnemen met een UV-zichtbaar spectrometer die binnen het bereik van 300 tot 1000 nm.
    3. De Acquisitietijd instellen voor elk frame 20 ms. gemiddelde 100 frames te verkrijgen van de laatste spectrum te verlagen van het lawaai in de metingen.
    4. Plotten software gebruiken voor het analyseren van de gegevens op basis van de pieken van de eerder geïdentificeerde transmissie (met een Lorentz-gebaseerde methode).

2. sensor Bulk gevoeligheidstest

  1. Stort de standaard RI-vloeistof op de vloeibare cel, met de RI, variërend van 1.31 tot 1.39.
  2. Dompel de sensor-chip in de standaard RI-vloeistof en lijnen met de straal wit licht. Het spectrum van de transmissie te verkrijgen.
  3. Reinigen van de sensor-chip na elke meting met een tensioactieve schoonmaak reagens en droog het met stikstofgas.

3. sensor oppervlakte modificatie

  1. Voorafgaand aan chemische wijzigingen, reinig de sensor chips door sequentiële onderdompeling in isopropanol, aceton en gedeïoniseerd water. Droog, bij kamertemperatuur in een stroom van droog stikstofgas.
  2. Incubeer de sensor chips in een ethanolische oplossing van 0,4 mM 10-carboxy-1-decanethiol en 1.6 mM 1-octanethiol voor 12u bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Dit zal vormen een amine-reactieve zelf-assemblage enkelgelaagde (SAM).
  3. Ethanol gebruik goed naspoelen en drogen bij kamertemperatuur.
  4. Maak een mengsel van 75 mM sulfo-N-hydroxysuccinimide (sulfo-NHS) en 15 mM 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC). Dompel de chips in dit mengsel gedurende 15 minuten.
    Opmerking: Dit zal activeren de carboxylic groep van de SAM.
  5. Ter plaatse 50 µL van 200 µg/mL anti-troponine antilichaam oplossing gemaakt in een pH 4.5 acetaat buffer op het sensoroppervlak en incubeer gedurende 30 min.
  6. De spoorverontreiniging esters deactiveren door de sensor chip in 1 M ethanolamine-HCl-oplossing gedurende 15 minuten onder te dompelen.
  7. Spoel de chip met gedeïoniseerd water en droog het in een stroom van droog stikstofgas bij kamertemperatuur.

4. cTnI Assay

  1. Het blokkeren van alle niet-specifieke binding door spotten 100 µL van 1% bovien serumalbumine (BSA)-oplossing op het oppervlak.
Incubeer gedurende 15 minuten.
  • Spoel de sensor chips driemaal in-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing. De chip invoegen in de cel van de meting om vast te leggen van de transmissie-spectrum.
    Opmerking: Dit is het referentiespectrum.
  • Ter plaatse 50 µL van cTnI standaard op het oppervlak van de chip en broeden in een vochtige omgeving voor 30 min.
  • Spoel de sensor chips drie keer in PBS oplossing en plaatst u deze in de cel van de meting om vast te leggen van de transmissie-spectrum.
    Opmerking: Dit is het na bindende spectrum.
  • Onderdompelen van de chips in 50 mM glycine-HCl (pH 2) voor 1 min en dan afspoelen in PBS oplossing driemaal voor de regeneratie van het oppervlak van de chip. Meet het spectrum van de transmissie in PBS om te controleren of het succes van de regeneratie-stap.

    • 5. oppervlakte Plasmon resonantie (SPR) meting

    1. Voer de multiplexed SPR sensor chip op het SPR-systeem met PBS-T buffer.
      Opmerking: De samenstelling van de PBS-T buffer is 20 mM nb-fosfaat, 150 mM NaCl en 0,05% Tween-20. De pH is 7.4.
    2. Gebruik cTnI-standaard en het antilichaam, zoals beschreven in stap 4.
    3. Het activeren van 3 van de 6 beschikbare kanalen met een mengsel van EDC (0,2 M) en sulfo-NHS (0,05 M) voor 5 min. uitvoeren een 5 min injectie van 50 µg Mo/mL antilichaam 560 en een 5-min-injectie van 1 M ethanolamine-HCl-oplossing.
    4. De sensor-chip met 90° draaien en het injecteren van de cTnI-normen in verschillende concentraties (75, 30, 7.5 en 2.5 ng/mL).
    5. Observeer de vervoeging aan het antilichaam bij vlekken van interactie op de chip in real time via de SPR uitlezing.
    6. Het regenereren van de chip door het injecteren van 50 mM glycine-HCl (pH 2) voor 1 min.

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Resultaten

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    De optische setup voor metingen wordt weergegeven in figuur 1A. Een beeld van de werkelijke nanohole matrix wordt gegeven in figuur 1B. Om te begrijpen van de fysica rijden de sensing proces, was de software van de simulatie COMSOL gewend de verdeling van het Enterprise veld in een waterige omgeving simuleren. De resultaten van de simulatie werden vervolgens gerelateerd aan de werkelijke meting. Een eerder gepubliceerde studie be...

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Discussie

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Simuleren van de interactie tussen incident licht en de nanostructuren maakt het mogelijk om te identificeren van de juiste piek (in het spectrum transmissie), wiens shift kan worden opgenomen als een functie van de concentratie van de analyt. Het is belangrijk op te merken dat de lokalisatie van de bands met betrekking tot de structuur van de sensor cruciaal voor de keuze van de juiste band, waarvan verschuiving is te voelen van de analyt kan worden bijgehouden. De visualisatie kan worden bereikt door middel van simulat...

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Openbaarmakingen

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

    Dankbetuigingen

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    AP erkent de steun van Prof T Venkatesan, directeur, NUS Nanoscience Nanotechnology Initiative en Bureau van de ondervoorzitter (National University of Singapore) (R-398-000-084-646). CLD erkent de steun van de Singapore ministerie van gezondheid nationale Medical Research Council onder haar behandelaar wetenschapper financieringssysteem, NMRC/CSA/035/2012, en de National University of Singapore. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript.

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Materialen

    Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
    NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
    Electron Beam Lithography setupElionix ELS 700
    o-XyleenSigma Aldrich95662
    EB resistSumitomoNEB-22A2
    OntwikkelaarsreagensShipley CompanyMicroposit MF 321
    ElektropetmachineTechnotrans AG RD 50
    Fotoresiststripper Rohm and Haas Electronic Materials LLCMicroposit Remover 1165
    EtssysteemTrion Phantom
    Heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl)trichlorosilaan Gelest (PA, USA)78560-44-8
    SAM-coater Sorona Inc.AVC 150M
    Foto-uithardbare NIL-resistmicro resist technology GmbHmr-UVCur21-300nm
    LichtuithardingssysteemDymax Model 2000 Flood
    E-straaldepositiemachineDenton Explorer
    UV-zichtbaar spectrometer Ocean optic HR2000+ (Dunedin, FL, USA)
    Standaard brekingsindexvloeistoffen Cargill Inc (Cedar Grove, USA)18032
    PlotsoftwareOriginOrigin Pro 9
    10-carboxy-1-decaanthiol Dojindo Laboratories (Japan)C385-10
    1-octaanthiol Sigma-Aldrich, MO, USA471386
    Sulfo-N-hydroxysuccinimide en 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide BioRad (CA, USA)1762410
    Anti-troponine antilichaam 560Hytest (Finland)4T21
    Ethanolamine-HCl-oplossingBioRad (CA, USA)1762450
    Surface Plasmon Resonance setupBioRad XPR36 (Haifa, Israel)
    Multiplexed SPR-chipBioRadGLC
    Human cTnI-standaardPhoenix PharmaceuticalsEK -311-05
    Glycine-HClBioRad (CA, USA)1762221

    Referenties

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Ebbesen, T. W., Lezec, H. J., Ghaemi, H., Thio, T., Wolff, P. Extraordinary optical transmission through sub-wavelength hole arrays. Nature. 391 (6668), 667-669 (1998).
    2. Krishnan, A., et al. Evanescently coupled resonance in surface plasmon enhanced transmission. Optics Comm. 200 (1), 1-7 (2001).
    3. Yang, J. -C., et al. Enhanced optical transmission mediated by localized plasmons in anisotropic, three-dimensional nanohole arrays. Nano letters. 10 (8), 3173-3178 (2010).
    4. Kim, J. H., Moyer, P. J. Transmission characteristics of metallic equilateral triangular nanohole arrays. Appl Phys Lett. 89 (12), 121106(2006).
    5. Liu, H., Lalanne, P. Microscopic theory of the extraordinary optical transmission. Nature. 452 (7188), 728-731 (2008).
    6. Shon, Y. -S., Choi, H. Y., Guerrero, M. S., Kwon, C. Preparation of nanostructured film arrays for transmission localized surface plasmon sensing. Plasmonics. 4 (2), 95-105 (2009).
    7. Xiang, G., Zhang, N., Zhou, X. Localized surface plasmon resonance biosensing with large area of gold nanoholes fabricated by nanosphere lithography. Nanoscale Res Lett. 5 (5), 818(2010).
    8. Valsecchi, C., Brolo, A. G. Periodic metallic nanostructures as plasmonic chemical sensors. Langmuir. 29 (19), 5638-5649 (2013).
    9. Gates, B. D., et al. New approaches to nanofabrication: molding, printing, and other techniques. Chem Rev. 105 (4), 1171-1196 (2005).
    10. Guo, L. J. Nanoimprint lithography: methods and material requirements. Adv Mater. 19 (4), 495-513 (2007).
    11. Wong, T. I., et al. High throughput and high yield nanofabrication of precisely designed gold nanohole arrays for fluorescence enhanced detection of biomarkers. Lab on a Chip. 13 (12), 2405-2413 (2013).
    12. Deng, J., Wong, T. I., Sun, L. L., Quan, C., Zhou, X. Acceleration of e-beam lithography by minimized resist exposure for large scale nanofabrication. Microelect Eng. 166, 31-38 (2016).
    13. Wu, L., Bai, P., Li, E. P. Designing surface plasmon resonance of subwavelength hole arrays by studying absorption. JOSA B. 29 (4), 521-528 (2012).
    14. Ding, T., et al. Quantification of a cardiac biomarker in human serum using extraordinary optical transmission (EOT). PloS one. 10 (3), 0120974(2015).
    15. Im, H., Sutherland, J. N., Maynard, J. A., Oh, S. -H. Nanohole-based surface plasmon resonance instruments with improved spectral resolution quantify a broad range of antibody-ligand binding kinetics. Anal Chem. 84 (4), 1941-1947 (2012).
    16. Bhagawati, M., You, C., Piehler, J. Quantitative real-time imaging of protein-protein interactions by LSPR detection with micropatterned gold nanoparticles. Anal Chem. 85 (20), 9564-9571 (2013).

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Herprints en machtigingen

    Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

    Toestemming aanvragen

    Trefwoorden

    Nanoimprint lithografiegelokaliseerde oppervlakteplasmonresonantiedetectie van menselijk serumfabricage van biosensorendetectie van troponinepoint of care detectieoptische transmissiemetingoppervlakteplasmonresonantie

    Gerelateerde artikelen