Methodenartikel

High Precision FRET op single-molecuul niveau voor biomolecule structuur bepaling

10.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55623

⸱

13 mei 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Clemson University, 2Department of Physics and Astronomy, Clemson University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center for Membrane Biology, Graduate School for Biomedical Sciences, University of Texas Health Science Center

In dit artikel

Samenvatting

Hier wordt een protocol voor hoogwaardige FRET-experimenten op het molecuulniveau voorgesteld. Daarnaast kan deze methodologie worden gebruikt om drie conformatieve staten in het ligand-bindende domein van de N-methyl-D-aspartaat (NMDA) receptor te identificeren. Het bepalen van precieze afstande is de eerste stap in de richting van het opbouwen van structurele modellen op basis van FRET-experimenten.

Samenvatting

Hierbij wordt een protocol voor het uitvoeren van nauwkeurige interdyeafstandmetingen met behulp van Förster resonantie-energieoverdracht (FRET) op het molecuulniveau in de multiparameter fluorescentiedetectie (MFD) -modus weergegeven. MFD maximaliseert het gebruik van alle "dimensies" van fluorescentie om fotofysische en experimentele artefacten te verminderen en maakt het mogelijk om de interdye afstand te meten met een nauwkeurigheid tot ~ 1 Å in stijve biomoleculen. Deze methode werd gebruikt om drie conformatieve toestanden van het ligandbindende domein van de N-methyl-D-aspartaat (NMDA) receptor te identificeren om de activatie van de receptor op ligandbinding te verklaren. Bij het vergelijken van de bekende kristallografische structuren met experimentele metingen, kwamen ze binnen minder dan 3 Å overeen met meer dynamische biomoleculen. Het verzamelen van een reeks afstandsbeperkingen die de volledige dimensionaliteit van de biomoleculen bedekken, zou het mogelijk maken om een ​​structureel model van dynamische biomoleculen te verschaffenes.

Inleiding

Een fundamenteel doel van structurele biologische studies is om de relatie tussen de structuur en de functie van biomoleculaire machines te ontrafelen. De eerste visuele indruk van biomoleculen ( bijv. Proteïnen en nucleïnezuren) vond plaats in de jaren 1950 door middel van de ontwikkelingsröntgenkristallografie 1 , 2 . Röntgenkristallografie biedt hoge resolutie, statische structurele informatie die door de kristalverpakking wordt beperkt. Daarom verdwijnt de inherente immobiliteit van röntgenstructuurmodellen de dynamische aard van biomoleculen, een factor die de meeste biologische functies 3 , 4 , 5 beïnvloedt. Nucleaire magnetische resonantie (NMR) 6 , 7 , 8 leverde een alternatieve oplossing voor het probleem door structurele modellen in waterige oplossingen op te lossen. Een groot voordeelVan NMR is het vermogen om de intrinsieke dynamische aard van biomoleculen en conformatieve ensembles te herstellen, die de intrinsieke relaties tussen structuur, dynamiek en functie 3 , 4 , 5 verduidelijken. Niettemin vereist NMR, beperkt door steekproefgrootte en grote hoeveelheden van het monster complexe labelingstrategieën voor grotere systemen. Daarom is er een dringende behoefte aan alternatieve methoden in de structurele biologie.

Historisch gezien heeft Förster resonantie energie-overdracht (FRET) 9 geen belangrijke rol in structurele biologie gezien door de misvatting dat FRET nauwkeurige afstandsmetingen levert. Het doel van dit protocol is het vermogen van FRET om de afstanden op de nanometerschaal te bepalen, te herzien, zodat deze afstanden kunnen worden gebruikt voor het opbouwen van structurele modellen van biomoleculen. De eerste experimentele verificatieDe toewijzing van de R6 - afhankelijkheid van de FRET-efficiëntie is in 1967 door Stryer uitgevoerd door polyprolines van verschillende lengtes te meten als een spectroscopische liniaal. Een soortgelijk experiment werd in 2005 op het enkelmolecuulniveau bereikt. Polyproline moleculen bleken niet ideaal te zijn, en dus werden dubbelstrengs DNA-moleculen later 12 gebruikt. Dit heeft het venster geopend voor nauwkeurige afstandsmetingen en het idee om FRET te gebruiken om structurele eigenschappen van biomoleculen te identificeren.

FRET is optimaal wanneer de afstandsafstand tussen de afstanden van 0,6-1,3 R 0 is , waarbij R 0 de Förster-afstand is. Voor typische fluoroforen die worden gebruikt in single-molecule FRET experimenten, is R0 ~ 50 Å. FRET biedt typisch veel voordelen ten opzichte van andere methoden in het vermogen om de structuren en dynamiek in te lossen en te differentiërenHeterogene systemen: (i) Door de ultieme gevoeligheid van fluorescentie kunnen single-molecule FRET-experimenten 13 , 14 , 15 , 16 heterogene ensembles oplossen door de structuren van zijn individuele leden direct te tellen en tegelijkertijd te karakteriseren. (Ii) Complexe reactiewegen kunnen direct worden ontcijferd in single-molecule FRET-studies omdat er geen synchronisatie van een ensemble nodig is. (Iii) FRET kan toegang krijgen tot een breed scala van temporale domeinen die ruim 10 decennia in de tijd liggen, en omvatten een breed scala aan biologisch relevante dynamieken. (Iv) FRET-experimenten kunnen worden uitgevoerd in elke oplossing, zowel in vitro als in vivo . De combinatie van FRET met fluorescentiemicroscopie maakt het mogelijk om moleculaire structuren en interacties direct in levende cellen 15 , 16 , Sup> 17 , 18 , 19 , zelfs bij hoge precisie 20 . (V) FRET kan toegepast worden op systemen van bijna elke grootte ( bijv. Polyproline oligomeren 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , HIV reverse transcriptase 26 en ribosomen 27 ). (Vi) Ten slotte kan een netwerk van afstanden die alle dimensionaliteit van biomoleculen bevatten, gebruikt worden om structurele modellen van statische of dynamische moleculen 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref "> 35 , 36 , 37 .

Daarom kan single-molecule FRET spectroscopie worden gebruikt om afstanden af ​​te leiden die nauwkeurig genoeg zijn om te worden gebruikt voor afstandbeperkte structurele modellering 26 . Dit is mogelijk door gebruik te maken van multiparameter fluorescentiedetectie (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , die acht dimensies van fluorescentie-informatie gebruikt ( dat wil zeggen excitatiespectrum, fluorescentie spectrum, anisotropie, fluorescentie levensduur, fluorescentie kwantumopbrengst, Macroscopische tijd, de fluorescentie-intensiteiten en de afstand tussen fluoroforen) om nauwkeurig en precies afstandbeperkingen te verschaffen. Daarnaast wordt gepulseerde interleaved excitatie (PIE) gecombineerd met MFD(PIE-MFD) 42 om directe excitatie-acceptor fluorescentie te monitoren en single-molecule gebeurtenissen te selecteren die voortvloeien uit monsters die een 1: 1 donor-to-acceptor stoichiometrie bevatten. Een typische PIE-MFD-configuratie maakt gebruik van tweepulsige interleaved excitatie-lasers die zijn verbonden met een confocaal microscooplichaam, waarbij de detectie van foton in vier verschillende kanalen wordt verdeeld in verschillende spectrale vensters en polarisatiekenmerken. Meer details zijn te vinden in figuur 1 .

Het is belangrijk om op te merken dat FRET moet worden gecombineerd met berekeningsmethoden om atomistische structurele modellen te realiseren die in overeenstemming zijn met FRET-resultaten 26 , 30 . Het is niet het doel van het onderhavige protocol om de bijbehorende methodologie over te gaan om structurele modellen te bouwen met FRET-afgeleide afstanden. Deze benaderingen zijn echter toegepast in combinatie met andere technieken ( bijv. Kleine hoek röntgenverdelingIng of electron paramagnetische resonantie), die het gebied van integratieve structurele biologie 43 , 44 , 45 , 46 bevoorraden. Het huidige doel is de weg te baan voor FRET als een kwantitatief instrument in de structurele biologie. Als voorbeeld werd deze methode gebruikt om drie conformatieve staten in het ligandbindende domein (LBD) van de N-methyl-D-aspartaat (NMDA) receptor te identificeren. Het uiteindelijke doel is om bovengenoemde beperkingen te overwinnen en FRET te brengen onder de integratieve methoden die worden gebruikt voor de structurele bepaling van biomoleculen door middel van gemeten afstanden met hoge precisie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. PBS-buffervoorbereiding en kamerbehandeling

OPMERKING: Draag een laboratoriumjas en wegwerphandschoenen bij het uitvoeren van natte chemische experimenten. Gebruik oogbescherming bij het aanpassen van de laser.

  1. PBS bufferbereiding
    1. Oplossen 4,5 g Na 2 HPO 4 , 0,44 g NaH2P04 en 3,5 g NaCl in 400 ml gedestilleerd water. Zorg voor een pH van 7,5 en steriliseer de oplossing door autoclaven op een vloeibare cyclus gedurende 1 uur (afhankelijk van het autoclaafsysteem).
    2. Neem 15 ml van de PBS-oplossing en meng het met 0,1 g houtskool. Filter de mix door gebruik te maken van een regelmatig 20 ml spuitfilter met een 0,2 μm poriegrootte . Verzegel de PBS-buffer bij kamertemperatuur en houd deze op.
  2. Microscope kamerbehuizing glasbehandeling
    1. Voeg 500 μl gedestilleerd water en 5 μl polysorbaat 20 nonionische oppervlakteactieve stof toe (zie de Materialenlijst)Naar een kamerbekledingsglas systeem (zie de materialenlijst) en meng goed. Laat het 30 minuten duren. Verwijder de polysorbaat 20 oplossing en doe de kamer tweemaal met gedestilleerd water. Laat het drogen.
      OPMERKING: De kamer is nu klaar voor gebruik.

2. Voorbereiding van DNA-voorbeelden

OPMERKING: Gebruik ontworpen gemarkeerde DNA-strengen (zie de Materials List) voor het maken van dubbele streng DNA (dsDNA) standaardmonsters. Ontworpen oligo's mogen geen kleurstoffen bevatten aan het einde van een polymeer om artefacten te voorkomen die de bepaalde afstand kunnen in gevaar brengen. De DNA-sequentie moet worden gekozen om zich als een stijf lichaam te gedragen.

  1. Voeg 1,5 μl van een donor gemerkt DNA-streng en 4,5 μl van een gratis (acceptor-gemerkte of niet-gelabelde) DNA-streng in een microfuge buis en meng ze met 24 μl nuclease-vrij water.
    OPMERKING: Afhankelijk van de mix van de geselecteerde oligonucleotiden worden de volgende monsters gegenereerd: geen FRET, loW-FRET, of high-FRET dsDNA's.
  2. Hybridiseer het DNA met behulp van een thermische mixer en het volgende proces: 95 ° C gedurende 10 minuten, 90 ° C gedurende 10 minuten, 80 ° C gedurende 10 minuten, 70 ° C gedurende 10 minuten, 60 ° C gedurende 10 minuten, 50 ° C Gedurende 10 minuten, 40 ° C gedurende 10 minuten, 30 ° C gedurende 10 minuten, 20 ° C gedurende 10 minuten, 10 ° C gedurende 10 minuten en bij 5 ° C vasthouden.
    OPMERKING: De gegenereerde dsDNA-standaarden kunnen in een -20 ° C vriezer worden gehouden voor langdurige opslag of kunnen direct gebruikt worden.

3. Bereiding van eiwitsample

Opmerking: Het beginnen met recombinant DNA voor de expressie van het eiwit van belang in bacteriële systemen, is het mogelijk om de resten te muteren waaruit de afstanden gemeten moeten worden in cysteinen. Gebruik hiervoor standaard site-directed mutagenese technieken 47 . Om eiwitzuivering te vergemakkelijken, klonteren het recombinante en gemuteerde DNA in een vector die een zuiveringsetiket bevat ( bijv.Een His-tag). Het glutamaat subunit 1 ligandbindend domein (LBD) van de NMDA glutamaat ionotrope receptor (GluN1) LBD ( dat wil zeggen NMDA GluN1 LBD gekloneerd in de pET-22b (+) vector) werd gebruikt.

  1. Proteïne expressie
    1. Transformeer het DNA-plasmide van het constructie in het gekozen expressiesysteem 48 .
      OPMERKING: In de volgende stappen wordt aangenomen dat de expressie van een oplosbaar eiwit in Escherichia coli wordt getransformeerd. Zuivering van bijvoorbeeld getransfecteerde zoogdiercellen 49 of getransduceerde insectencellen 50 is ook mogelijk, en gedetailleerde stappen kunnen elders worden gevonden. Zorg ervoor dat de geselecteerde E. coli stam geschikt is voor het eiwit van belang. Bijvoorbeeld, de expressie van eiwitten die disulfide-bruggen bevatten vereist een stam van bekwame cellen met een minder reducerend intracellulair compartiment (zie de Materials List).
    2. Inoculeer een voorgerecht E. Coli cultuur door gebruik te maken van een steriele pipet tip om een ​​enkele getransformeerde kolonie 48 op te halen . Zet het in 100 ml selectief LB-medium (zie de materialenlijst) en laat de cultuur overnachten bij 37 ° C groeien.
    3. Bereid LB bouillon (zie de materialenlijst). Autoclaaf het om te steriliseren.
    4. Inoculate grootschalige culturen van getransformeerd E. coli door de nachtcultuur toe te voegen aan 2 liter selectief LB-medium bij een verhouding van 1: 500.
    5. Bepaal de groei van de cultuur in de komende paar uur door de absorptiewaarden (Abs) van de cultuur bij 600 nm te controleren, soms aangeduid als de optische dichtheid bij 600 nm (OD 600 ) of door gebruik te maken van een celdichtheidsmeter. Merk op dat de lezingen mettertijd stijgen.
    6. Induceer eiwit expressie met een uiteindelijke concentratie van 0,5 mM isopropyl-P-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) wanneer de cultuur een OD 600 bereikt van 0,7. Schud geïnduceerde E. coli bij 20 ° C gedurende 20-24 uur
    7. Na eiwitinductie, pellet de E. coli door gedurende 20 minuten bij 3000 xg en 4 ° C te draaien. Verwijder de supernatant en berg de E. coli pellet die het intracellulaire eiwit bevat bij -80 ° C tot gebruik.
  2. Proteïne zuivering
    1. Lyse E. coli met behulp van een gekozen lysis methode ( bijv. Sonicatie, franse pers, stikstofcavitatie, enz. ) 51 .
    2. Spin het membraan en het celafval door centrifugeren van het lysaat gedurende 1 uur bij 185.000 xg en 4 ° C.
    3. Voor een His-getagd eiwit laad het supernatant op een geëquilibreerde, nikkel geladen, geïmmobiliseerde metaalaffiniteit chromatografie (IMAC) kolom onder gebruikmaking van een snel eiwit vloeistofchromatografie (FPLC) systeem (zie de Material Table ) 52 .
      OPMERKING: Equilibratiebuffer voor de NMDA GluN1 LBD: 200 mM NaCl, 20 mM Tris en 1 mM Glycine, pH 8. Elutiebuffer voor NMDA GluN1 LBD: 200 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM Glycine en 400 mM Imidazool, pH 8.
      1. Was de IMAC kolom met buffer met een lage hoeveelheid (~ 12 mM) imidazool.
      2. Verwijder het eiwit uit de IMAC kolom onder gebruikmaking van een lineair gradiënt van imidazool van 12 mM tot 400 mM.
    4. Dialyseer het eiwit overnacht in equilibratiebuffer zonder imidazool 53 door het eluaat van stap 3.2.3.2 in dialysebuizen te plaatsen en gedurende 2-3 uur in de equilibratiebuffer te onderdompelen. Herhaal tenminste nog een keer.
      OPMERKING: De stappen 3.2.3-3.2.6 nemen de zuivering van een His-tagged eiwit aan. Als u door een andere methode zuivert, pas het protocol dienovereenkomstig aan.
    5. Kwantificeer de eiwithoeveelheid door de absorptie bij 280 nm van het gedialyseerde eiwit te nemen en gebruik te maken van de wet van Beer ( Absorbance unit = ε Lc , waar ε Is de uitstootcoëfficiënt (M -1 cm -1), Die hier 54 kunnen worden verkregen ; L is de lichtweglengte (cm); En c is de eiwitconcentratie (M)).
      OPMERKING: Verscheidene eiwit kwantificatie assays zijn beschikbaar, waaronder de Bradford assay en bicinchoninezuur assay. Beiden leveren nauwkeurige resultaten.
  3. Proteïne etikettering
    1. Voeg donor (maleimide reactieve cyaan-groene kleurstof) en acceptor (maleimide reactieve verrode kleurstof) fluorophoren toe aan het gezuiverde eiwit bij een 1: 1: 8 eiwit: donor: acceptor molaire verhouding.
    2. Incubeer het eiwit- en fluorofoormengsel op ijs gedurende 30 minuten. Langere incubatietijden zijn mogelijk.
    3. Pak een 0,5 ml Ni-Nitrilotriazijnzuur (Ni-NTA) agarosekolom (zie de Materialenlijst) en evenwilibreer het met dezelfde evenwichtbuffer als in stap 3.2.3, terwijl het eiwit incubatieert.
      OPMERKING: Houd de hoeveelheid geladen eiwit in overeenstemming met de harsbindende capaciteit.
    4. Na de 30 minuten inKubatie, laad het eiwit / fluorofoor mengsel op de kolom bereid in stap 3.3.3 en zuiver door zwaartekrachtstroom.
    5. Was de overmaat fluorofoor af met 5 ml evenwichtbuffer.
    6. Verwijder het gelabelde eiwit door zwaartekracht uit de kolom vier keer met 0,5 ml elutiebuffer. Omdat het eiwit al is gezuiverd van andere eiwitten, is geen gradiënt nodig.
    7. Controleer elk eluaat met een UV-Vis spectrometer om te bepalen welke fractie het gelabelde eiwit bevat. Scan de absorptie van 230-700 nm om ervoor te zorgen dat de absorptie piept van het eiwit (280 nm) en elke fluorofoor (493 nm voor de cyaangroene fluorofoor en 651 nm voor de verre rode fluorofoor) zijn zichtbaar in de eluaat.
      OPMERKING: Het eiwit zal typisch eluteren in fractie 2.
    8. Equilibreer een ontziltende kolom (zie de materiaaltabel ) met houtskool behandelde PBS (stap 1.1).
    9. Laad het gelabelde eiwit op de ontziltende kolom door de zwaartekrachtstroom.
      OPMERKING: Houd de hoeveelheid geladen eiwit in overeenstemming met de geselecteerde desalting column capaciteit 55 .
    10. Maak gebruik van 3,5 ml houtskool behandelde PBS door zwaartekrachtstroom en haal 0,5 ml fracties van het eluaat op.
    11. Gebruik een UV-Vis spectrometer om de absorptie van elk eluaat van 230-700 nm te scannen om te bepalen welke fractie gemerkt eiwit bevat.
      OPMERKING: Stappen 3.3.8-3.3.11 dienen in principe als een bufferuitwisselingsstap. Andere protocollen die dit doel dienen, zijn ook mogelijk ( bijv. Uitgebreide dialyse). Als alternatief kan men rechtstreeks naar stap 3.3.8 van stap 3.3.2 gaan.

4. Metingen die nodig zijn in Ensemble-omstandigheden (in cuvette)

  1. Bepaling van de Förster constante
    1. Scan f D , fluorescentie-fluorescentie-uitstoot (cps), in een fluorimeter door de donor op 15 nm op te spannen tot zijn maximale absorptiegolflengte om de volledige emIssion spectrum. Monitor de emissie vanaf 5 nm na de excitatie golflengte en eindigend 150 nm later. Gebruik magische hoekomstandigheden door de emissierolarisator op 54,7 ° in te stellen En de excitatie polariseert naar 0 ° 56 .
      OPMERKING: voor de donor fluorofoor die hier wordt gebruikt, komt het Abs maximum bij 490 nm; 475 nm wordt gebruikt als de excitatie golflengte en de emissie van 480-650 nm wordt gecontroleerd. Voor de acceptor komt het Abs maximum bij 645 nm; 630 nm wordt gebruikt voor de excitatie golflengte en de emissie van 635-735 nm wordt gecontroleerd.
    2. Gebruik de fluorimeter om een ​​excitatiescan uit te voeren van de acceptorfluorofoor (Abs A ), variërend van 400-700 nm en gebruik magische hoekomstandigheden door de emissierolarisator in te stellen op 54,7 ° En de excitatie polariseert naar 0 ° 56 . Stel de emissiemonochromator in op 15 nm na de maximale emissie golflengte. Normaliseer tot de maximale exciTation waarde.
    3. Op de gepubliceerde tabellen, zoek de extinctiecoëfficiënt van de acceptor, ε A (M -1 cm -1 ) 56 , of gebruik de door de fabrikant verstrekte waarden.
      OPMERKING: De waarde die is gepubliceerd voor de acceptorfluorofoor die in dit manuscript wordt gebruikt, is ε A647 = 270.000 cm -1 M -1 56 .
    4. Bereken de spectrale overlap met J = Σf D · (Abs A · ε A ) · λ 4 , waar f D , Abs A en ε A hierboven zijn gedefinieerd λ en de golflengte (nm) is. Gebruik een werkblad om alle golflengte afhankelijke waarden in stap 4.1.1-4.1.3 in kolommen te noteren. Breng ze uit volgens golflengte. Voer de samenvatting uit van de minimale golflengte van de donoruitstoot (λ min ) tot de maximale golflengte van de acceptorabsorbansE (λ max ).
    5. Bereken de Förster constante (R o ) met de volgende formule R o 6 = 8,79 x 10 -5 · J · K 2 · F, D · n -4 , waar J de spectrale overlap is die eerder is berekend in stap 4.1.4, Κ 2 Is de oriëntatiefactor, Φ F, D Is de fluorescentie kwantum opbrengst van de donor fluorofore, en n is de brekingsindex van het medium waarin de fluorofore is gelegen.
      OPMERKING: Gebruik n = 1.33 (als waterige buffer gebruikt wordt) en κ 2 = 2/3.
    6. Bepaal de kwantumopbrengstwaarde van de donor fluorofoor (Φ F, D , Milieu afhankelijk) op gepubliceerde tabellen (zie Referentie 57) en gebruik de waarde van de spectrale overlap die is verkregen in stap 4.1.4 om de uiteindelijke waarde van de Förster-constante te berekenen met behulp van de eqVan stap 4.1.5.
      OPMERKING: Als de kwantumopbrengst niet beschikbaar is, volgt u stap 4.2 hieronder om het te berekenen. Gebruik in dit geval Φ F, D = 0.8, dat overeenkomt met een donorlevens τ D, r = 4.0 ns.
  2. Bepaling van fluorescentie kwantumopbrengst
    OPMERKING: De volgende procedure veronderstelt alleen dynamische quenching. Om de statische uitblusing te overwegen, raadpleegt u Referentie 56. PIE-MFD-experimenten zijn echter ook handig bij het bepalen van de kwantumopbrengst, zelfs bij statische quenching (zie de resultaten).
    1. Selecteer een referentie fluorofoor met soortgelijke absorptie- en emissieprofielen voor zowel de acceptor als de donorfluoroforen waarvoor de kwantumopbrengst (Φ r ) is bepaald.
      OPMERKING: Voor de donor, Φ r = 0,8 en τ r = 4 ns, terwijl voor de acceptor, Φ r = 0,32 en τ r = 1,17 ns, wDie overeenkomen met de Φr en τ voor de cyaangroene fluorofore- en de verre rode fluorofoor-gemerkte oligonucleotiden, respectievelijk 57 .
    2. Meet de tijd opgeloste fluorescentie verval (f (t)) met behulp van de tijd gecorreleerde single photon counting (TCSPC) methode bij magische hoek omstandigheden.
    3. Pas het fluorescentieverval op met een mono- of multi-exponentiële vervalfunctie in de vorm van f (t) = Σ i x i e -t / τ i , waar x i Is de bevolkingsfractie en τ i Is de populatie fluorescentie levensduur.
    4. Bereken de gemiddelde levensduur van de soorten, <τ> x = Σx i τ i , Waar x i Is de bevolkingsfractie en τ i Is de populatie fluorescentie levensduur.
    5. Gebruik thE formule Φ F, D = <τ D > x * Φ r / τ r Het berekenen van de fluorescentie-kwantumopbrengst van de donorfluorofoor door het fluorescentie-levensduur en kwantumopbrengst van de referentie aan te sluiten, evenals de fluorescentie-levensduur van de donorfluorofoor.
      OPMERKING: Deze methode veronderstelt dynamische quenching. Voor andere Φ F, D- bepalingen, volg Lakowicz 56 .

5. Experiment Alignment voor PIE-MFD Single-molecule Detection (SMD)

OPMERKING: Het is beter om de lichten uit te zetten bij het meten.

  1. Apparatuur aanpassing (Figuur 1)
    OPMERKING: Voor dit experiment wordt een huisgebouwde MFD-opstelling weergegeven in figuur 1 , met twee pulserende lasers en 4 detectiekanalen in een omgekeerde microscooplichaam. Er zijn soortgelijke commerciële systemen.
    1. Zet de 485 nm en 640 nm lasers en alle detectors van de MFD-installatie aan. Open de software die de TCSPC-acquisitie en lasers beheert. Zorg ervoor dat de laserherhalingssnelheid 40 MHz bedraagt.
    2. Stel de 485 nm pulserende laservermogen op 60 μW in een beeldvlak van de 60X 1,2 NA-waterdempingsdoelstelling en de 640 nm-pulserende laservermogen tot 23 μW in de pulserende interleaved excitatietoestand (PIE-MFD) 42 .
      OPMERKING: Om de PIE-MFD in te stellen, worden de twee laserpulsen vertraagd in de lasercontroller software. Voor 485 nm laser excitatie zijn de detectie TCSPC kanalen (TAC kanalen) 1-12.499 ("prompt" kanaal). Voor 640 nm laser excitatie, de detectie TCSPC kanalen (TAC kanalen) zijn 12.499-50.000 ("vertraging" kanaal).
    3. Voeg objectieve onderdompelingsvloeistof (een druppel gedistilleerd water) tussen de objectieflens van de microscoop en een dekselglasdia. Om ervoor te zorgen dat het beeldvlak in de oplossing ligt en ver van de glazen surfCe, draai de instelknop een en een halve omwenteling na het vinden van het tweede heldere brandpunt door de reflectie van de lasers op de glas-vloeistof interface.
    4. Voeg 1 μL van 100 nM Rhodamine 110 tot 50 μl gedestilleerd water toe aan het midden van het dekselglas. Zorg ervoor dat de oplossing ook in het midden van de microscoopdoelstelling staat.
    5. Pas de pinhole (grootte: 70 μm) posities aan (x en y richting een tegelijk), terwijl u de fotonenteller op de acquisitie software controleert om het aantal gedetecteerde fotonen te maximaliseren.
  2. Standaardmeting SMD (werken in een donkere kamer)
    1. Gebruik het voorbeeld van stap 5.1.4 en record 120 s van de tellerfactor door op de tijdstippen tijdopgeloste (TTTR) bedieningspaneel in "* .ht3" -formaat 58 op de acquisitie software op de knop "Start" te klikken.
    2. Bereken offline fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) 59 , </ Sup> 60 , 61 ( dwz FCS meting) om de karakteristieke tijd van diffusie, het aantal moleculen in het confocale volume, de triplet state kinetics en de moleculaire helderheid 62 te bepalen .
      1. Open de software voor FCS (Kristine, MFD suite). Selecteer de experimentele instellingen door op "Opties" te klikken -> "Selecteer instellen." Selecteer een bestand met soortgelijke experimentele instellingen en klik op "parameters van bestand krijgen" om de koptekstinformatie op het bestand te lezen.
      2. Selecteer 'Bewerken' -> 'Correleren' om FCS uit te voeren.
        OPMERKING: Zorg ervoor dat de kanaalnummers juist zijn opgegeven en dat de "TAC Gate" (TCSPC-kanalen) is gecontroleerd om de prompt of vertragingskanalen dienovereenkomstig te selecteren.
      3. Selecteer 'Bedien' -> 'Global Fit of Correlation Curves' om de fit routine te openen. Gebruik "vergelijking # 24" op de softwareE en klik op "start".
        OPMERKING: Vergelijking # 24 op de software beschrijft de autocorrelatiefunctie (Gc) van vrij diffuserende fluorescerende moleculen over een driedimensionaal Gaussisch verlichtingsprofiel, zoals 61 :
        figure-protocol-1
        Waar N het gemiddelde aantal moleculen is in het detectievolume, x T is de fractie moleculen die triplet-state kinetiek uitoefenen met de kenmerkende tijd t T , tc, is de correlatietijd, t diff is de diffusietijd in verband met de geometrische Parameter ω , en ω beschrijft het Gaussische verlichtingsprofiel. Noteer na de fit de diffusietijd en het aantal moleculen in het confocale volume.
    3. Voeg 10 μl 100 nM Rhodamine 101 in 50 μl gedestilleerdWater en meng goed. Plaats deze mix bovenop het afdekglas en zorg ervoor dat de druppel in het midden van de objectieflens ligt. Klik op de knop "start" op het TTTR-bedieningspaneel om 120 s data in TTTR-formaat op te nemen.
    4. Voeg 1 μL 100 nM ver-rode fluorofoor in 50 μl gedistilleerd water en meng goed. Plaats deze mix in het midden van de objectieflens. Klik op de knop "Start" en record 120 s van gegevens in TTTR-formaat.
    5. Plaats 50 μl gedistilleerd water in het midden van de objectieflens. Klik op de knop "Start" en record 300 s van de gegevens in TTTR-formaat.
    6. Plaats 50 μL PBS-buffer in het midden van de objectieflens. Klik op de knop "Start" en record 300 s van de gegevens in TTTR-formaat.
    7. Neem 1 μL van de mix uit stap 5.1.4 en meng met 50 μl gedestilleerd water. Plaats deze mix op het afdekglas. Klik eerst op de knop "Start" en verzamel 10 s data in de TTTR-modus. Analyseer dan de TTTR modus bestand met behulp van de Burst Integration Fluorescence Lifetime (BIFL) analyse software (Parijs, MFD suite), zoals beschreven in stap 5.3.
      OPMERKING: Controleer het aantal uitbarstingen per seconde uit de burst selectie en analysesoftware 26 , 61 . Als het burstniveau ongeveer elke 10 s is, is het geschikt voor meting van een molecuul.
    8. Blijf doorgaan met het opnemen van de tellerratio in TTTR-formaat gedurende 1,5 uur ( dwz TCSPC bij SMD) om te behandelen als een meetmolecule met een molecuul.
      OPMERKING: Door de grote bestandsgrootte splitsen ruwe "* .ht3" -bestanden in kleinere bestanden om te laden en te verwerken met behulp van BIFL.
  3. Analyse van standaardmonsters met behulp van BIFL
    1. Open de BIFL-software (Parijs).
    2. Selecteer de instelling voor PIE in het automatische pop-upvenster "Bevestig instellen" en lees de koptekst door het bestand te selecteren met soortgelijke experimentele instellingen. Klik op "krijg parameters uitM-bestand. "Klik op" OK. "Opmerking dat het pop-upvenster sluit en geïntegreerd is in het frontend van Parijs. Klik op" OK "onder" Volgende ".
    3. Kies de bestanden die u wilt analyseren door op "Select" te klikken op "Data Path Array" om de meting te selecteren die u wilt analyseren.
      1. Klik op "Green scatter" (voor een watermeting), "Green BG" (voor een buffermeting), "Green thick" (voor een 2 nM Rhodamine 110 meting), "Red scatter" (voor een watermeting) Red BG "(voor een buffer of watermeting)," Red thick "(voor een 20-nM Rhodamine 101 meting)," Yellow scatter "(voor een watermeting)," Yellow BG "(voor een buffermeting) "Yellow Thick" (voor een 2 nM ver-rode fluorofore meting).
      2. Klik onder 'Next' op 'OK'.
        OPMERKING: Het "groen" kanaal komt overeen met het signaal van de groene detectoren in de "prompt" TCSPC kanalen. De4; rood "kanaal correspondeert met het signaal van de rode detectoren in de" prompt "TCSCP kanalen. Het" geel "kanaal komt overeen met het signaal van de rode detectoren in de vertraging TCSPC kanalen.
    4. Klik op "Aanpassen" naast "Data cut Burstwise" om de parameters voor single-molecule selectie aan te passen. Selecteer in het nieuwe pop-upvenster single-molecule-gebeurtenissen met twee standaardafwijkingen van de gemiddelde tussentijdse aankomsttijd ("dt") door de interphoton aankomsttijd onder "Drempel" te veranderen en het minimale aantal fotonen per enkele molecule gebeurtenis onder "min . #. " Klik op 'Return' om het pop-upvenster te sluiten. Klik onder 'Next' op 'OK'.
      OPMERKING: De drempel, in ms-eenheden, hangt af van de achtergrondtarief. Het typische minimum aantal fotonen gebruikt is 60.
    5. Pas de initiële fluorescentie levensduur "Kleurpasparameters" aan (bijvoorbeeld, van, tot en convolution) voor het genererenD fluorescentie decay parameters op de "Groene", "Rode" en "Gele" kleuren. Stel in hetzelfde venster de "van" en "naar" waarden voor "prompt" en "vertraging" in. Klik op 'Return' om het pop-upvenster te sluiten. Klik onder 'Next' op 'OK'.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat het selectievakje 2 kleuren excitatie is geselecteerd. "Van" en "naar" komen overeen met de begin- en eindbakken op het fluorescentievervalhistogram (TAC-kanaalnummer). Als de aanvankelijke pasvormparameters correct worden geselecteerd, wordt bij elke fluorescentie op elke kanaal een fitfunctie toegevoegd.
    6. Selecteer de locatie op de vaste schijf om alle verwerkte ASCII-bestanden op te slaan in een ouder map.
      OPMERKING: Parijs verwerkt alle geselecteerde bursts en creëert meerdere ASCI output bestanden dan kan worden gebruikt door andere programma's voor visualisatie (bijvoorbeeld Margarita MFD suite).

6. dsDNA Standaarden en Sample Measurements

  1. Voeg 500 μL PBS-buffer toe aan een bekledingsdekselglas en plaats een druppel gedestilleerd water tussen de kamer en de objectieflens. Klik op de knop "Start" op het bedieningspedaal en verzamel 5 minuten data in de TTTR-modus om deze te gebruiken voor analyse.
  2. Neem een ​​kleine hoeveelheid (meestal ongeveer 0,1 μL, concentratie van ongeveer 1 μM) van de dsDNA-standaard, voeg deze toe aan de PBS-buffer en meng goed. Verzamel eerst 10 s data door op "Start" te klikken. Controleer dan de burst om 35 bursts per 10 s te krijgen (zoals in stappen 5.2.7 en 5.3). Uiteindelijk verzamelt u> 2 uur data in TTTR-formaat, zoals hierboven beschreven.
  3. Analyseer de verzamelde gegevens voor de dsDNA-monsters, zoals in stap 5.3.3.
  4. Visualiseer de burst-histogrammen met behulp van de MFD-suite (Margarita) en laat de FRET-efficiëntie zien tegen <τ D (A) > f of de F D / F A versus <τ D (A) > f .
    1. Open tHij Margarita software en selecteer "Bestand" -> "Importeer alle *. ?? 4 en *. Mti bestanden." Selecteer de bovenliggende map met diverse submappen.
    2. Selecteer de parameters om te visualiseren door op een van de parameters van Parijs (bijvoorbeeld tau groen of <τ D (A) > f ), naast de "X" (abscisse) te klikken; Herhaal dit ook voor de orden "Y" om de gewenste parameter te selecteren om te visualiseren (bijvoorbeeld FRET-efficiëntie, F D / F A of S PIE PIE).
      OPMERKING: in dit geval corrigeren de FRET-efficiëntie, F D / F A of S PIE voor een juiste achtergrondtempo in de groene, rode en gele kanalen; Voor kwantumopbrengsten van de donor en acceptor; Voor de detectie-efficiëntieverhouding (g G / g R ); En voor crosstalk (α). Hier, g G / g R = 3,7 en a = 0,017, afhankelijk van het instrument. Achtergrond telling tarievenAfhankelijk van de gebruikte buffer, en de kwantumopbrengstwaarden zijn eerder bepaald.
    3. Voeg een FRET-lijn toe door het venster "Overlay Equation" te openen door op "Weergave" te klikken -> "Overlay Equation." Selecteer de statische FRET-lijn in het pop-upmenu. Selecteer de juiste donorleeftijden en kwantumopbrengstparameters om de juiste FRET-lijn te genereren.
      OPMERKING: FRET-lijnen voor het correleren van verschillende FRET-indicatoren kunnen worden gegenereerd.
  5. Bepaal de correctiefactor voor de acceptor excitatie door de donor excitatie bron (β) met behulp van de stoichiometrie parameter door het weergeven van FRET efficiëntie versus stoichiometrie (S PIE ) in Margarita (vergelijking 1, hieronder).
    OPMERKING: β is zodanig gekozen dat het donormonster een piek heeft bij S PIE = 1.0 in de stoichiometrische schaal; Het acceptor-enige monster zou een stoichiometrie van S PIE = 0,0 moeten hebben en de dsDNA met beide labels zou een stoichiometrie van S PIE ~ 0.5 moeten hebben.
    OPMERKING: Instrument is nu klaar, en het is mogelijk om FRET-gemerkte monsters te meten.
  6. Meet en analyseer FRET-gemerkte monsters bereid in sectie 3 door de stappen 6.3-6.4 te volgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In typische smFRET experimenten met behulp van een MFD setup (laser lijnen: 485 nm bij 60 μW en 640 nm bij 23 μW, sectie 5.1) wordt het fluorescentiemonster verdund tot een laag picomolaire concentratie ( 10-12 M = 1 pM) en geplaatst In een confocale microscoop, waar een sub-nanoseconde laserpuls exciterende gelabelde moleculen opwekt, die vrijwel door een excitatievolume diffunderen. Een typisch confocaalvolume is <4 femtoliters (fL). Bij zulke lage concentraties worden éé...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit werk wordt het protocol voor het uitlijnen, kalibreren en meten van interdyeafstanden met hoge precisie met behulp van PIE-MFD single-molecule FRET-experimenten gepresenteerd. Door alle instrumentele parameters nauwkeurig te kalibreren, kan men de nauwkeurigheid van de gemeten afstanden verhogen en de nauwkeurigheid van de angstrom bereiken. Om dit te doen worden diverse multidimensionale histogrammen gebruikt om populaties te analyseren en te identificeren voor verdere karakterisering. Met behulp van de gemiddel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben met de inhoud van dit artikel.

Dankbetuigingen

VJ en HS erkennen ondersteuning van NIH R01 GM094246 naar VJ. HS erkent startfondsen uit het Clemson University Creative Research Program en het Centrum voor Optische Materialen Wetenschappen en Technologie Technologieën aan de Clemson University. Dit project werd ook ondersteund door een trainingsgemeenschap van het Keck Centrum voor Interdisciplinaire Bioscience Training van de Gulf Coast Consortia (NIGMS Grant No. 1 T32GM089657-05) en de Schissler Foundation Fellowship voor Translational Studies of Common Human Diseases in DD. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
houtskoolMerck KGaAK42964486 320
spruitspuitfilterFisherbrand09-719Cmaat: 0.20 µm
kamerdeksellaagjeFisher Scientific1554091.5 borosilicaatglas, 8 putjes
microscoopdekglasFisher Scientific063014-9maat: 24 x 60-1.5
Nuclease-vrij waterFisher Scientific148859nuclease-vrij
tween-20Thermo Scientific2832010% oplossing van Polysorbaat 20
acceptor DNA-streng (High FRET)Integrated DNA Technologies1781248955´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
acceptor DNA-streng (Low FRET)Integrated DNA Technologies1779564245´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
donor DNA-strengIntegrated DNA Technologies1779514375´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)
DNA-streng (Geen FRET)Integrated DNA Technologies5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
thermische cyclerEppendorfE6331000025nexus gradient
Alexa Fluor 488 C5 MaleimideThermo ScientificA10254benaming cyan-groen fluorofoor in het manuscript
Alexa Fluor 647 C2 MaleimideThermo ScientificA20347benaming ver-rood fluorofoor in het manuscript
Rhodamine 110Sigma-Aldrich83695-250MG
Rhodamine 101Sigma-Aldrich83694-500MG
LB Broth, MillerFisher ScientificBP1426Voor cultuur van E. coli
AmpicillineSigma-AldrichA0166Gebazigd bij 100 µg/mL eindconcentratie in selectief LB-medium om plasmideselectie te behouden
Tetracycline Calbiochem58346Gebazigd bij 12.5 µg/mL eindconcentratie in selectief LB-medium om gor (glutathione reductase) mutatie in Origami B(DE3) stammen te behouden om disulfidebinding oxidatie te vergemakkelijken
KanamycineFisher ScientificBP906-5Gebazigd bij 15 µg/mL eindconcentratie in selectief LB-medium om trxB (thioredoxin reductase) mutatie in B(DE3) stammen te behouden om disulfidebinding oxidatie te vergemakkelijken
Origami B(DE3) Competente CellenMillipore70837-3Competente E. coli cellen voor expressie van eiwitten met disulfidebruggen
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)Fisher ScientificBP1755Voor inductie van E. coli eiwitexpressie
HiTrap Chelating HPGE Life Sciences17-0409-01Voor grootschalige FPLC-zuivering van His-gelabeld eiwit
ImidazoolSigma-Aldrich56749
Ni-NTA Agarose Qiagen30210
PD-10 OntzoutingskolomGE Life Sciences17-0851-01
AktaPurifierGE Life Sciences28406264FPLC Instrument
DialysebuisSpectrum labs13256215 kD MWCO 24 mm Breedte, 10 meters/rol
DichroicsSemrockFF500/646-Di01-25x36500/646 BrightLight
50/50 Stralingsdeler polarisatorQioptiq Linos G33 5743 00010 x 10 filmpolarisator
Groen doorlaatfilterChromaET525/50mET525/50m 25 mm diameter montage
Rode doorlaatfilterChromaET720/150mET720/150m 25 mm diameter montage
VermogensmeterThorLabdPM200
UV-Vis spectrofotometerVarianCary300Bio
Fluorolog 3 fluorometerHoribaFL3-22-R3
Fluorohub TCSPC controllerHoribaFluorohub-BTCSPC elektronica voor ensemble metingen
NanoLed 485LHoriba485LBlauwe diodelaser
NanoLed 635LHoriba635LRode diodelaser
Olympus IX73 MicroscoopOlympusIX73P2FMicroscoopframe
PMA 40 Hybrid DetectorPicoQuant GmbH932200, PMA 40Geoptimaliseerd voor groene detectie
PMA 50 Hybrid DetectorPicoQuant GmbH932201, PMA 50Geoptimaliseerd voor ed shifter gevoeligheid
485 nm laserPicoQuant GmbHLDH-D-C-485
640 nm laserPicoQuant GmbHLDH-D-C-640
Hydraharp 400 en TTTR acquisitiesoftwarePicoQuant930021Picoseconde gebeurtenistimer en Time Correlated Single Photon Counting Unit, inclusief TTTR acquisitiesoftware
SEPIA II SLM 828 en SEPIA softwarePicoQuant910028Laserdriver voor picoseconde pulsen, inclusief SEPIA software controller.
computerDelloptiplex 7010cpu: i7-3770 ram:16GB
FRET Positionering en Screening (FPS) softwareHeinrich Heine UnviersityHet bevat de Accessibel Volume calculator beschikbaar op http

Referenties

  1. Kendrew, J. C. Architecture of a protein molecule. Nature. 182 (4638), 764-767 (1958).
  2. Kendrew, J. C., et al. A three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by x-ray analysis. Nature. 181 (4610), 662-666 (1958).
  3. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).
  4. Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-927 (2007).
  5. Henzler-Wildman, K. A., et al. Intrinsic motions along an enzymatic reaction trajectory. Nature. 450 (7171), 838(2007).
  6. Kline, A. D., Wuthrich, K. Secondary structure of the alpha-amylase polypeptide inhibitor tendamistat from Streptomyces tendae determined in solution by 1H nuclear magnetic resonance. J. Mol. Biol. 183 (3), 503-507 (1985).
  7. Williamson, M. P., Havel, T. F., Wuthrich, K. Solution conformation of proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by 1H nuclear magnetic resonance and distance geometry. J. Mol. Biol. 182 (2), 295-315 (1985).
  8. Havel, T. F., Wuthrich, K. An evaluation of the combined use of nuclear magnetic resonance and distance geometry for the determination of protein conformations in solution. J. Mol. Biol. 182 (2), 281-294 (1985).
  9. Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann.Phys. 437 (1), 55-75 (1948).
  10. Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).
  11. Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 2754-2759 (2005).
  12. Wozniak, A. K., Schroder, G. F., Grubmuller, H., Seidel, C. A., Oesterhelt, F. Single-molecule FRET measures bends and kinks in DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18337-18342 (2008).
  13. Orrit, M., Bernard, J. Single Pentacene Molecules Detected by Fluorescence Excitation in a p-Terphenyl Crystal. Phys. Rev. Lett. 65 (21), 2716-2719 (1990).
  14. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  15. Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 93, 6264-6268 (1996).
  16. Michalet, X., Weiss, S., Jager, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chem. Rev. 106 (5), 1785-1813 (2006).
  17. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat. Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
  18. Sakon, J. J., Weninger, K. R. Detecting the conformation of individual proteins in live cells. Nat Methods. 7 (3), 203-205 (2010).
  19. Stahl, Y., et al. Moderation of Arabidopsis root stemness by CLAVATA1 and ARABIDOPSIS CRINKLY4 receptor kinase complexes. Curr. Biol. 23 (5), 362-371 (2013).
  20. Fessl, T., et al. Towards characterization of DNA structure under physiological conditions in vivo at the single-molecule level using single-pair FRET. Nucleic Acids Res. 40 (16), e121(2012).
  21. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annu. Rev. Biochem. 47, 819-846 (1978).
  22. Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (8), 2754-2759 (2005).
  23. Best, R. B., et al. Effect of flexibility and cis residues in single-molecule FRET studies of polyproline. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (48), 18964-18969 (2007).
  24. Hoefling, M., et al. Structural heterogeneity and quantitative FRET efficiency distributions of polyprolines through a hybrid atomistic simulation and Monte Carlo approach. PLoS One. 6 (5), e19791(2011).
  25. Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. , (2016).
  26. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat. Meth. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  27. Hickerson, R., Majumdar, Z. K., Baucom, A., Clegg, R. M., Noller, H. F. Measurement of internal movements within the 30 S ribosomal subunit using Forster resonance energy transfer. J. Mol. Biol. 354 (2), 459-472 (2005).
  28. Margittai, M., et al. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15516-15521 (2003).
  29. Weninger, K., Bowen, M. E., Chu, S., Brunger, A. T. Single-molecule studies of SNARE complex assembly reveal parallel and antiparallel configurations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14800-14805 (2003).
  30. Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J. Struct. Biol. 173 (3), 497-505 (2011).
  31. Choi, U. B., et al. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat. Struct. Mol. Biol. 17 (3), 318-324 (2010).
  32. DeRocco, V., Anderson, T., Piehler, J., Erie, D. A., Weninger, K. Four-color single-molecule fluorescence with noncovalent dye labeling to monitor dynamic multimolecular complexes. BioTechniques. 49 (5), 807-816 (2010).
  33. McCann, J. J., Zheng, L., Chiantia, S., Bowen, M. E. Domain orientation in the N-Terminal PDZ tandem from PSD-95 is maintained in the full-length protein. Structure. 19 (6), 810-820 (2011).
  34. McCann, J. J., et al. Supertertiary structure of the synaptic MAGuK scaffold proteins is conserved. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (39), 15775-15780 (2012).
  35. Andrecka, J., et al. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase II elongation complex. Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).
  36. Muschielok, A., et al. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).
  37. Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the Nano-Positioning System to the Analysis of Fluorescence Resonance Energy Transfer Networks. J. Phys. Chem. B. 115 (41), 11927-11937 (2011).
  38. Renner, A., et al. High Precision FRET Reveals Dynamic Structures in the Drosophila Scaffold Protein Complex Stardust-DPATJ-DLin-7 Mediated by L27 Domains. Biophys. J. 106 (2), 256(2014).
  39. Antonik, M., Felekyan, S., Gaiduk, A., Seidel, C. A. Separating structural heterogeneities from stochastic variations in fluorescence resonance energy transfer distributions via photon distribution analysis. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (13), 6970-6978 (2006).
  40. Gaiduk, A., Kühnemuth, R., Antonik, M., Seidel, C. A. Optical Characteristics of Atomic Force Microscopy Tips for Single-Molecule Fluorescence Applications. ChemPhysChem. 6 (5), 976-983 (2005).
  41. Eggeling, C., Fries, J., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  42. Kudryavtsev, V., et al. Combining MFD and PIE for Accurate Single-Pair Förster Resonance Energy Transfer Measurements. ChemPhysChem. 13 (4), 1060-1078 (2012).
  43. Steven, A. C., Baumeister, W. The future is hybrid. J. Struct. Biol. 163 (3), 186-195 (2008).
  44. Cowieson, N. P., Kobe, B., Martin, J. L. United we stand: combining structural methods. Curr. Opin. Struct. Biol. 18 (5), 617-622 (2008).
  45. Boura, E., et al. Solution structure of the ESCRT-I complex by small-angle X-ray scattering, EPR, and FRET spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (23), 9437-9442 (2011).
  46. Dominguez, C., Boelens, R., Bonvin, A. M. HADDOCK: a protein-protein docking approach based on biochemical or biophysical information. J. Am. Chem. Soc. 125 (7), 1731-1737 (2003).
  47. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J Vis Exp. (27), (2009).
  48. Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
  49. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. J Vis Exp. (117), e54792(2016).
  50. Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), e51206(2014).
  51. Protein Sample Preparation, Handbook. GE Healthcare. , Available from: http://www.gelifesciences.com/file_source/GELS/Service%20and%20Support/Documents%20and%20Downloads/Handbooks/Protein_sample_preparation_handbook.pdf (2016).
  52. Li, Q., Richard, C. -A., Moudjou, M., Vidic, J. Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli. J Vis Exp. (106), e53432(2015).
  53. Scopes, R. K. Protein Purification: Principles and Practice. , Springer. New York. (1993).
  54. Protein Extiction Coefficient Calculator. , Available from: http://www.biomol.net/en/tools/proteinextinction.htm (2016).
  55. Desalting Column Product booklet. GE. , Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_20161110134421.pdf (2016).
  56. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. (2007).
  57. Sindbert, S., et al. Accurate distance determination of nucleic acids via Forster resonance energy transfer: implications of dye linker length and rigidity. J. Am. Chem. Soc. 133 (8), 2463-2480 (2011).
  58. Wahl, M. Technical Note. Time Tagged Time-Resolved Fluorescence Data Collection in Life Sciences. PicoQuant. , Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/14528/technote_tttr.pdf (2010).
  59. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
  60. Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. 13 (1), 29-61 (1974).
  61. Felekyan, S., et al. Full correlation from picoseconds to seconds by time-resolved and time-correlated single photon detection. Rev. Sci. Instrum. 76 (8), 083104(2005).
  62. Iyer, V., Rossow, M. J., Waxham, M. N. Peak two-photon molecular brightness of fluorophores is a robust measure of quantum efficiency and photostability. JOSA B. 23 (7), 1420-1433 (2006).
  63. Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chem. Phys. Lett. 353 (5), 439-445 (2002).
  64. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 102 (33), 6601-6613 (1998).
  65. Kühnemuth, R., Seidel, C. A. M. Principles of Single Molecule Multiparameter Fluorescence Spectroscopy. Single Mol. 2 (4), 251-254 (2001).
  66. Widengren, J., et al. Single-molecule detection and identification of multiple species by multiparameter fluorescence detection. Anal. Chem. 78 (6), 2039-2050 (2006).
  67. Sisamakis, E., Valeri, A., Kalinin, S., Rothwell, P. J., Seidel, C. A. Accurate single-molecule FRET studies using multiparameter fluorescence detection. Methods Enzymol. 475, 455-514 (2010).
  68. Kalinin, S., Felekyan, S., Antonik, M., Seidel, C. A. Probability distribution analysis of single-molecule fluorescence anisotropy and resonance energy transfer. The Journal of Physical Chemistry B. 111 (34), 10253-10262 (2007).
  69. Kask, P., et al. Two-dimensional fluorescence intensity distribution analysis: theory and applications. Biophys. J. 78 (4), 1703-1713 (2000).
  70. Traynelis, S. F., et al. Glutamate Receptor Ion Channels: Structure, Regulation, and Function. Pharmacol. Rev. 62 (3), 405-496 (2010).
  71. Furukawa, H., Gouaux, E. Mechanisms of activation, inhibition and specificity: crystal structures of the NMDA receptor NR1 ligand-binding core. EMBO J. 22 (12), 2873-2885 (2003).
  72. Furukawa, H., Singh, S. K., Mancusso, R., Gouaux, E. Subunit arrangement and function in NMDA receptors. Nature. 438 (7065), 185-192 (2005).
  73. Dolino, D. M., Rezaei Adariani,, Shaikh, S., A, S., Jayaraman, V., Sanabria, H. Conformational Selection and Submillisecond Dynamics of the Ligand-binding Domain of the N-Methyl-d-aspartate Receptor. J. Biol. Chem. 291 (31), 16175-16185 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Single molecule FRETMultiparameter fluorescentiedetectieMeting van inter kleurstofafstandNMDA receptorLigandbindend domeinConformationele toestandenFluorescentie resonantie energietransferPrecisie afstandmetingen

Gerelateerde artikelen