Auditieve hersenstam neuronen van avians en zoogdieren zijn gespecialiseerd in snelle neurale codering, een fundamenteel proces voor normale gehoorfuncties. Deze neuronen ontstaan uit duidelijke precursoren van embryonale hindbrain. We presenteren technieken die elektroporatie gebruiken om genen uit te drukken in het achterhoofd van kippenembryo's om de genfunctie tijdens de auditieve ontwikkeling te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In Ovo Electroporation in de Kip Auditory Brainstem
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Elektroporatie is een methode die genen van belang stelt in biologisch relevante organismen zoals het kippenembryo. Het is lang gevestigd dat het kippenembryo een effectief onderzoeksmodel is voor het bestuderen van basis biologische functies van auditieve systeemontwikkeling. Meer recent is het kippenembryo bijzonder waardevol geworden bij het bestuderen van genuitdrukking, -regulatie en -functie in verband met gehoor. In ovo kan elektroporatie worden gebruikt om auditieve hersenstamregio's te beheren die verantwoordelijk zijn voor zeer gespecialiseerde auditieve functies. Deze gebieden omvatten de kippenkernmagnocellularis (NM) en nucleus laminaris (NL). NM en NL neuronen ontstaan uit verschillende precursoren van rhombomeren 5 en 6 (R5 / R6). Hier presenteren we in ovo elektroporatie van plasmide gecodeerde genen om genetische eigenschappen in deze regio's te bestuderen. We tonen een methode voor ruimtelijke en temporale controle van genuitdrukking die zowel winst of verlies van functioneel fenotype bevorderenes. Door middel van auditieve neurale voorloperregio's geassocieerd met R5 / R6 tonen we plasmide-transfectie in NM en NL. Temporele regulatie van genuitdrukking kan worden bereikt door een tet-on vectorsysteem aan te nemen. Dit is een drug induceerbare procedure die de genen van belang in de aanwezigheid van doxycycline (Dox) uitmaakt. De in ovo elektroporationstechniek - samen met biochemische, farmacologische en / of in vivo functionele analyses - biedt een innovatieve aanpak voor de studie van auditieve neuronontwikkeling en bijbehorende pathofysiologische verschijnselen.
Inleiding
Snelle neurale codering van geluid is essentieel voor normale auditieve functies. Deze omvatten geluids lokalisatiemogelijkheden 1 , spraak in geluidsdiscriminatie 2 en het begrip van andere gedragsrelevante communicatiesignalen 3 . Analoge neuronen in de auditieve hersenstam van zowel avia's als zoogdieren zijn zeer gespecialiseerd voor snelle neurale codering 4 . Deze omvatten de kipkern Magnocellularis (NM), de nucleaire laminaris (NL) en hun zoogdieranaloge, de anteroventrale cochleaire kern (AVCN) en de mediale superieure Olijf (MSO), respectievelijk
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door de Institusionele Dierenzorg- en Gebruikscommissies van de Noordwestelijke Universiteit, en uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Richtlijnen voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren.
1. Eierhantering
- Koop bevruchte eieren van een lokale leverancier. Bewaar eieren bij 13 ° C in de koelkast voor maximaal 5 dagen voor incubatie. De levensvatbaarheid van embryo neemt significant af na 1 week.
- Schep elk ei met 70% ethanol voordat u in de incubator zit.
- Zet 1-2 tientallen eieren aan hun zijden in een incubator met de temperatuur ingest....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We laten hier zien dat in ovo elektroporation genexpressie in een normaal ontwikkelend biologisch systeem toelaat. Plasmide-gecodeerde genen worden focaal geïnjecteerd in de neurale buis boven R5 / R6. Een schematisch voorbeeld van de elektrode- en pipetplaatsingen ten opzichte van belangrijke anatomische markers is getoond in figuur 1A . De juiste plaats van plasmide-injectie wordt 24 uur na elektroporatie bevestigd en getoond in figuur IB . De.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In ovo elektroporatie is een methode om genen van belang uit te drukken of te kloppen om in vivo genfunctie 8 , 9 te analyseren. In het kippenembryo is het een innovatieve methode voor het uitdrukken van plasmide-gecodeerde genen in verschillende auditieve hersenstamregio's 8 . Om optimale expressie te waarborgen, zijn er meerdere kritische stappen nodig. Eerst, injecteer alleen embryo's waarvan de otocyten duide.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij bedanken Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria en Mevr. Ximena Optiz-Araya voor de eerste hulp bij het opzetten van protocollen en voor het leveren van plasmiden. Dit werk werd ondersteund door NIH / NIDCD grant DC013841 (JTS).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Bevruchte witte leghorn kippen eieren | Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI) | ||
| Picospritzer | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III, enkele of dubbele kanaal |
| Stroom/spannings stimulator | Grass Technologies | SD9 | SD9 |
| Microfil spuitnaalden | World Precision Instruments | MF28G67-5 | 28 Gauge, 67 mm Lang, (Verpakking van 5) |
| Elektrode houder | Warner Instruments | 64-1280 | MP Serie: Niet-elektrische druk toepassingen |
| Stimuleer micro-elektrode | FHC | PBSA1075 | PBSA1075 |
| Luchttank/regelaar | NU Laboratory Services | Air dry 300 CF | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258-25G | F7258-25G |
| Doorzichtige plastic tape | Scotch | 191 | |
| Doxycycline hyclaat | Sigma Aldrich | D9891-1G | |
| Ei koelkast | Vissani Wine Refrigerator | 13.3 - 16.1 °C (56-61° F) | |
| Incubator | Hova-Bator | 38 ° C (100 ° F), ~50% vochtigheid | |
| Dissectie scope | Zeiss | 4.35E+15 | SteREO Discovery, V8 Microscoop, 50.4X |
| Koude lichtbron | Zeiss | 4.36E+15 | CL6000 LED |
| Micromanipulators | Narishige Japan | Model: MM-3 | 2 Micromanipulators |
| Kapillairbuisjes | Sutter Instrument | BF150-86-10 | Dikvloerse borosilicaat (afmetingen) |
| Spuiten | 1 mL, 3 mL | ||
| Naalden | BD Precision Glide | 27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2 | |
| Pincetten | Stoelting | No. 5 Super Fine Dumont | |
| Ei houder | Op maat gemaakt | Klei basis werkt ook | |
| Micropipet puller | Sutter Instrument | Model P-97 | |
| Spuitfilter | Ultra Cruz | sc-358811 | PVDF 0.22 μm |
Referenties
- Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. Mechanisms of sound localization in mammals. Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).
- Anderson, S., et al. Neural timing is linked to speech perception in noise. J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).
- Shannon, R. V., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
