Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In Ovo Electroporation in de Kip Auditory Brainstem

8.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55628

⸱

9 juni 2017

 ,  , 
1Roxelyn and Richard Pepper Department of Communication Sciences and Disorders, Northwestern University, 2Knowles Hearing Research Center, Northwestern University, 3Department of Neurobiology, Northwestern University

In dit artikel

Samenvatting

Auditieve hersenstam neuronen van avians en zoogdieren zijn gespecialiseerd in snelle neurale codering, een fundamenteel proces voor normale gehoorfuncties. Deze neuronen ontstaan ​​uit duidelijke precursoren van embryonale hindbrain. We presenteren technieken die elektroporatie gebruiken om genen uit te drukken in het achterhoofd van kippenembryo's om de genfunctie tijdens de auditieve ontwikkeling te bestuderen.

Samenvatting

Elektroporatie is een methode die genen van belang stelt in biologisch relevante organismen zoals het kippenembryo. Het is lang gevestigd dat het kippenembryo een effectief onderzoeksmodel is voor het bestuderen van basis biologische functies van auditieve systeemontwikkeling. Meer recent is het kippenembryo bijzonder waardevol geworden bij het bestuderen van genuitdrukking, -regulatie en -functie in verband met gehoor. In ovo kan elektroporatie worden gebruikt om auditieve hersenstamregio's te beheren die verantwoordelijk zijn voor zeer gespecialiseerde auditieve functies. Deze gebieden omvatten de kippenkernmagnocellularis (NM) en nucleus laminaris (NL). NM en NL neuronen ontstaan ​​uit verschillende precursoren van rhombomeren 5 en 6 (R5 / R6). Hier presenteren we in ovo elektroporatie van plasmide gecodeerde genen om genetische eigenschappen in deze regio's te bestuderen. We tonen een methode voor ruimtelijke en temporale controle van genuitdrukking die zowel winst of verlies van functioneel fenotype bevorderenes. Door middel van auditieve neurale voorloperregio's geassocieerd met R5 / R6 tonen we plasmide-transfectie in NM en NL. Temporele regulatie van genuitdrukking kan worden bereikt door een tet-on vectorsysteem aan te nemen. Dit is een drug induceerbare procedure die de genen van belang in de aanwezigheid van doxycycline (Dox) uitmaakt. De in ovo elektroporationstechniek - samen met biochemische, farmacologische en / of in vivo functionele analyses - biedt een innovatieve aanpak voor de studie van auditieve neuronontwikkeling en bijbehorende pathofysiologische verschijnselen.

Inleiding

Snelle neurale codering van geluid is essentieel voor normale auditieve functies. Deze omvatten geluids lokalisatiemogelijkheden 1 , spraak in geluidsdiscriminatie 2 en het begrip van andere gedragsrelevante communicatiesignalen 3 . Analoge neuronen in de auditieve hersenstam van zowel avia's als zoogdieren zijn zeer gespecialiseerd voor snelle neurale codering 4 . Deze omvatten de kipkern Magnocellularis (NM), de nucleaire laminaris (NL) en hun zoogdieranaloge, de anteroventrale cochleaire kern (AVCN) en de mediale superieure Olijf (MSO), respectievelijk 5 . Ontwikkelingsmechanismen die snelle neurale codering regelen, worden echter slecht begrepen in de auditieve hersenstam. Daarom is het voordelig om specifieke genen die verantwoordelijk zijn voor snelle neurale codering te bestuderen om hun expressie, regelgeving en functie beter te kunnen begrijpenDijmontwikkeling.

Het ontwikkelende kippenembryo is een effectief en goed gevestigd onderzoeksinstrument om fundamentele biologische vragen van auditieve systeemontwikkeling 6 , 7 te bestuderen. Recente moleculaire voorschotten hebben deze biologische vragen in het ontwikkelende kippenembryo aangepakt door genen van belang uit te drukken of neer te zetten om in vivo genfunctie 8 , 9 te analyseren. Het onderzoek naar de regulerende rol van specifieke genen is een belangrijke vooruitgang bij het begrijpen van pathologieën die verband houden met auditieve tekorten. Hier presenteren we in ovo elektroporatie van plasmide-gecodeerde genen in de kip auditieve hersenstam, waar snel neurale codering van geluid optreedt 10 . Door te targeten op auditieve neurale voorloperregio's geassocieerd met rombomeren 5 en 6 11 , 12 (R5 /R6), tonen wij ruimtelijke controle van plasmide transfectie in NM en NL. Daarnaast tonen we tijdelijke regulering van expressie door een tet-on vector systeem aan te nemen. Dit is een drug induceerbare procedure die de genen van belang in de aanwezigheid van doxycycline (Dox) 8 uitmaakt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures werden goedgekeurd door de Institusionele Dierenzorg- en Gebruikscommissies van de Noordwestelijke Universiteit, en uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Richtlijnen voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren.

1. Eierhantering

  1. Koop bevruchte eieren van een lokale leverancier. Bewaar eieren bij 13 ° C in de koelkast voor maximaal 5 dagen voor incubatie. De levensvatbaarheid van embryo neemt significant af na 1 week.
  2. Schep elk ei met 70% ethanol voordat u in de incubator zit.
  3. Zet 1-2 tientallen eieren aan hun zijden in een incubator met de temperatuur ingesteld op 38 ° C bij ~ 50% vochtigheid. Dit zorgt voor een goede embryo-positionering voor elektroporatie en respectievelijk optimale levensvatbaarheid.
    OPMERKING: Na 48 tot 52 uur incubatie zullen de eieren bij Hamburger-Hamilton (HH) stadium ~ 12-13 staan ​​en klaar zijn voor elektroporatie.

2. Voorbereiding

  1. Plasmide MiXing
    1. Voeg 1 μL 0,1% snelgroen (0,1% in 18 MΩ gedeïoniseerde en gedestilleerde H20 [ddH2O]) toe voor elke 7 μl DNA-mengsel.
    2. Voor co-elektroporatie van meerdere plasmiden, meng plasmiden in een 1: 1 verhouding. De uiteindelijke DNA-concentratie moet 5-8 μg / μL zijn.
  2. Fill Injection Pipette
    1. Trek pipetten op een micropipette-trekker. Vul de pipet met 1-2 μL plasmiden met een 28G spuitnaald.
    2. Breek de pipet tip tot 10 - 20 μm met behulp van tang. Gebruik een microscoop om te helpen bij het bepalen van de grootte van de gebroken pipettip. Bevestig de pipet aan de pipethouder van de picospritzer.

3. Winding

OPMERKING: De windowing procedure is vóór 13 gepubliceerd. Zie verwijzing 13 voor aanvullende visuele informatie.

  1. Veeg alle instrumenten en het werkgebied met 70%ethanol.
  2. Neem het gewenste aantal vaste eieren uit de broeikas (tussen 6-10), laat het bij kamertemperatuur, en individueel doei eieren met 70% ethanol opnieuw. Eieren blijven minimaal 2 uur levensvatbaar na verwijdering van incubator.
  3. Plaats het ei op een lichtverlichting om de embryopositie te identificeren. Omcirkel het middelpunt van het donkere gebied ( dwz embryo) met een potlood.
  4. Gebruik een 19G-naald en steek een gat in het stompe uiteinde van het ei.
  5. Poke een ander gat in de buurt van de getekende cirkel aan de punt van de ei. Verwijder een klein stukje van de buitenste eierschaal (ongeveer 16 mm 2 ) met de 19G-naald en verwijder vervolgens een klein stuk van de binnenste eierschaal (ongeveer 8 mm 2 ) met tang.
  6. Met een 3 ml spuit uitgerust met een 19G-naald, haal 1,5-2,5 ml albumine uit het ei door het stompe gat. Zorg ervoor dat u de naald om 45 ° kiest.
  7. Bedek het stompe gat met een klein stukje tape (1 cm x 1 cm). Bedek de getekende cirkel aD het tweede gat met tape (2,5 cm x 4 cm).
  8. Met gebogen schaar (snijrand = 2,5 cm) snijd een raam in de cirkel. De schaar moet parallel zijn aan de eierschaal en de diameter van het raam moet minder dan 2 cm zijn.

4. Plasmide injectie

  1. Zet de picospritzer aan. Stel de druk in op 18 psi en de duur tot 5 μs. Zet de luchttank en de lamp voor de dissectiemicroscoop aan.
  2. Maak 30 ml voorraadoplossing van een 1:10 verdunning van in de winkel gekocht Indische inkt gemengd in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Bewaren bij 4 ° C. Injectie van Indische inkt is een belangrijke stap om de kippenembryo beter te visualiseren.
    1. Vul een 1 ml spuit met de verdunde Indische inktoplossing. Bevestig een 27G-naald en verwijder eventuele bellen die aanwezig zijn in de spuit.
    2. Plaats de naald net onder het geelmembraan ~ 2 - 3 mm van het embryo en injecteer 0,2 ml Indische inkt voorzichtig onder het embryo. DoInjecteer niet meer dan 0,5 ml van de Indische inkt, aangezien het embryo-overleving kan verminderen.
  3. Plaats het raamdeeg op een eihouder onder de dissectiemicroscoop. Gebruik de hoogste vergroting voor de beste visualisatie van de plasmide injectieplaats.
  4. Verwijder het membraan over het injectiegebied met behulp van tang. Auditieve hersenstamgebieden van belang ( dwz NM en NL) komen voort uit Rhombomeres 5 en 6 (R5 / R6). R5 / R6 bevinden zich naast de otocyten (een embryonale structuur in vertebraten die zich in het binnenoor ontwikkelen), die dienen als landmarks voor R5 / R6 plasmide injecties.
  5. Verlaag het DNA-gevulde pipet in de neurale buis die over het R5 / R6 gebied en tussen otocyten leidt met behulp van de micromanipulator. Een schema van ideale plaatsing wordt getoond in figuur 1A .
  6. Breng de luchtdruk (18 psi, 5 μs duur) van de picospritzer aan om DNA uit de neurale buis te verwijderen.

5. Elektroporatie

  1. Zet t aanHij stroom / spanning stimulator.
  2. Vul een 3 ml spuit met PBS en bevestig het spuitfilter. Voeg 1-2 druppels PBS op het embryo toe.
  3. Verlaag de bipolaire elektrode naar het embryo met behulp van de micromanipulator met de negatieve elektrode boven de injectieplaats (mediaal) en de positieve elektrode lateraal naar de R5 / R6 ( Figuur 1A ). Vermijd direct contact met het embryo. Gebruik bipolaire elektroden waar het elektrode materiaal platina iridium is. Pas de afstand tussen de tips aan op 0,5 mm met tang.
  4. Gebruik een stroom / spanningsstimulator, 20 keer bij 50 V voor 1 ms met intervallen van 1 s.
  5. Na elektroporatie voegt u een druppel PBS over het blootgestelde gebied. Verwijder de elektrode voorzichtig en maak het schoon met een laboratoriumweefsel en 70% ethanol. Sluit het raam dat het embryo met tape afdicht.
  6. Label eierschaal met het geïnjecteerde plasmide type en de luikdatum.
  7. Leg eieren terug in incubator met raamzijde omhoog. Incubeer bij 38 ° C met 50% Vochtigheid tot het gewenste ontwikkelingsfase is bereikt.
  8. Als een tet-on vector electroporated is voor tijdelijke controle van de genuitdrukking, doe Doxycycline (Dox) elke 24 uur aan om genuitdrukking te veroorzaken (zie rubriek 6).

6. Tet-on systeem voor temporale controle van genuitdrukking

  1. Gebruik de volgende plasmiden:
    PCAGGS-T2TP: een transposase expressieplasmide.
    PT2K-CAGGS-rtTA-M2: een plasmide dat stabiel het Dox-bindende eiwit uitmaakt.
    PT2K-BI-TRE-EGFP: een plasmide dat een bidirectionele tet-on promotor (TRE) -drivende expressie van de EGFP-reporter bevat en een tweede gen van belang.
    OPMERKING: De bovenstaande drie plasmiden moeten gecofroporiseerd worden in een verhouding van 1: 1: 1.
  2. Voorraadoplossing:
    1. Doxis oplosbaar in steriele PBS om een ​​voorraadoplossing van 1 mg / ml te produceren. Bewaren bij -20 ° C.
  3. Dox-applicatie:
    1. De expressio inducerenN van het gen van belang tijdens bepaalde ontwikkelingsfasen, doe Dox elke 24 uur.
    2. Wanneer u Dox toepast, haal het ei uit, open het raam, pipet 50 μL Dox op het chorioallointoïsche membraan, sluit het raam en zet het ei terug in de incubator.

7. Voorbereiding van Dissecting Area voor Brainstem Slices

OPMERKING: De volgende paragrafen (7 - 9) en procedures zijn vóór 14 gepubliceerd. Zie deze verwijzingen voor aanvullende visuele informatie.

  1. Bereid een agaroplossing (40 mg / ml agarose, dwz 4% in ddH20). Giet de agaroplossing in een Petri-schotel en laat het op kamertemperatuur stollen. Bewaar overdekte agarplaat in de koelkast voor toekomstig gebruik tijdens het breinappen van het weefsel.
  2. Bellen kunstmatig cerebrale spinale vloeistof (ACSF) met 95% O2 en 5% CO2 (pH 7,2-7,4 en osmolariteit: 295-310 mOsm / L).
  3. Reinig het werkgebied en vibratomeer met 70% EtOH en spoel het mes met gedestilleerd water.
  4. Plaats een schoon vloeibaar absorptieblok op het werkgebied met geschikte dissectie-gereedschappen.
  5. Neem de agarplaat uit de koelkast, snijd een kleine agar kubus (10 mm x 10 mm x 8 mm). Plak het agarblok aan op het stadium van een vibratoom-snijkamer met gebruik van commercieel verkrijgbare superlijm.

8. Isolatie van Kip Auditory Brainstem

  1. Open het ei op de tapijtplaats. Doe de membraksak met een scalpel en verwijder het hoofd van het kippenembryo.
  2. Ontdek de kip met een scherpe schaar.
  3. Zet de scheermespunt een beetje achter de ogen. Inkijk door de schedel op de rostral-naar-caudale middenlijn. Pas kleine druk toe afhankelijk van de leeftijd van het embryo. Oudere embryo's hebben meer druk nodig.
  4. Druk de huid en de veren voorzichtig op om schedel bloot te stellen en controleer de middelste snede.
  5. S toepassenTrong druk, snijd het rostral gedeelte van de schedel met een scheermesje. Plaats het blad direct achter de ogen en snijd door de hele schedel en het breinweefsel.
  6. Maak middenlijn-naar-laterale insnijdingen met een schaar in de caudale regio van de schedel, iets voor de nekspieren aan beide kanten van het hoofd. Ontdek hersenen en cerebellum door de schedel en het overtollige weefsel weg te trekken.
  7. Knip weefsel vast aan de hersenstam met een schaar en verwijder de hersenstam, die vrij van de schedel loskomt.

9. Bereiding van hersenstamelschijven voor in-vivo elektrofysiologie of beeldvorming

  1. Knip de hersenstam door de optische tecta.
  2. Verwijder het cerebellum door middel van scharen met een schaar, waarbij de vloer van de vierde ventrikel wordt blootgesteld.
  3. Verwijder eventuele membranale weefsels en bloedvaten uit het hersenstamoppervlak met behulp van een pincet.
  4. Om de hersenstam te blokkeren, maakt u een horizontale snede in het meest rostrale einde van de vloer van de vierTh ventrikel, gewoon caudaal aan de cortex. Maak laterale snede loodrecht door de optische tecta om de hersenstam te isoleren.
  5. Plaats een kleine hoeveelheid superlijm op het vibratomeer vlak voor het agarblok.
  6. Breng de hersenstam aan het ruggenmerg met behulp van tweezers en plaats het op de superlijm met rostralzijde naar beneden en de dorsale kant naar het vibratomeerblad. Verwijder overtollige lijm met een laboratoriumweefsel of filterpapier.
  7. Giet zuurstofgezuurde ACSF in de vibratomeer. Zet het vibratomeerblad op een hoek van 20-22 °. Start vibratome bij maximale amplitude oscillatie. Verplaats het podium naar het mes zodat de bovenkant van het weefsel parallel is met het mes.
  8. Draai het mes snel naar breinstamweefsel. Verlaag het mes aanzienlijk voor het contact van het mes met het weefsel.
  9. Snij weefsel met de langste mogelijke voorwaartse snelheid. Zodra het mes door het gehele koronale weefselprofiel is, verwijder het plakje voorzichtig met een transferpipette.
  10. Verlaag het stadium 200-300 μm en plak opnieuw. Herhaal tot anatomische oriëntatiepunten van auditieve kernen zichtbaar worden, bijvoorbeeld de afzonderlijke dorsale / ventrale neuropil regio van NL en de mediale locatie van NM ten opzichte van NL.
  11. Houd schijfjes zorgvuldig in ACFS. Dit kan bij kamertemperatuur (22 ° C) of dichtbij fysiologische omstandigheden (~ 41 ° C) worden gedaan met een warm waterbad. Let op de volgorde van het snijden. De eerste plak komt overeen met het meest caudale gebied van weefsel en de laatste plak komt overeen met het meest rostralale gebied. Dit vertegenwoordigt ruwweg de tonotopische organisatie van de auditieve hersenstam, respectievelijk van laag- tot hoogfrequente coderende gebieden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We laten hier zien dat in ovo elektroporation genexpressie in een normaal ontwikkelend biologisch systeem toelaat. Plasmide-gecodeerde genen worden focaal geïnjecteerd in de neurale buis boven R5 / R6. Een schematisch voorbeeld van de elektrode- en pipetplaatsingen ten opzichte van belangrijke anatomische markers is getoond in figuur 1A . De juiste plaats van plasmide-injectie wordt 24 uur na elektroporatie bevestigd en getoond in figuur IB . De...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In ovo elektroporatie is een methode om genen van belang uit te drukken of te kloppen om in vivo genfunctie 8 , 9 te analyseren. In het kippenembryo is het een innovatieve methode voor het uitdrukken van plasmide-gecodeerde genen in verschillende auditieve hersenstamregio's 8 . Om optimale expressie te waarborgen, zijn er meerdere kritische stappen nodig. Eerst, injecteer alleen embryo's waarvan de otocyten duide...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij bedanken Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria en Mevr. Ximena Optiz-Araya voor de eerste hulp bij het opzetten van protocollen en voor het leveren van plasmiden. Dit werk werd ondersteund door NIH / NIDCD grant DC013841 (JTS).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bevruchte witte leghorn kippen eierenSunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
PicospritzerParker Hannifin052-0500-900Picospritzer III, enkele of dubbele kanaal
Stroom/spannings stimulatorGrass TechnologiesSD9SD9
Microfil spuitnaaldenWorld Precision InstrumentsMF28G67-528 Gauge, 67 mm Lang, (Verpakking van 5)
Elektrode houderWarner Instruments64-1280MP Serie: Niet-elektrische druk toepassingen
Stimuleer micro-elektrodeFHCPBSA1075PBSA1075
Luchttank/regelaarNU Laboratory ServicesAir dry 300 CF
Fast greenSigma AldrichF7258-25GF7258-25G
Doorzichtige plastic tapeScotch191
Doxycycline hyclaatSigma AldrichD9891-1G
Ei koelkastVissani Wine Refrigerator13.3 - 16.1 °C (56-61° F)
IncubatorHova-Bator38 ° C (100 ° F), ~50% vochtigheid
Dissectie scopeZeiss4.35E+15SteREO Discovery, V8 Microscoop, 50.4X
Koude lichtbronZeiss4.36E+15CL6000 LED
MicromanipulatorsNarishige JapanModel: MM-32 Micromanipulators
KapillairbuisjesSutter InstrumentBF150-86-10Dikvloerse borosilicaat (afmetingen)
Spuiten1 mL, 3 mL
NaaldenBD Precision Glide27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2
PincettenStoeltingNo. 5 Super Fine Dumont
Ei houderOp maat gemaaktKlei basis werkt ook
Micropipet pullerSutter InstrumentModel P-97
SpuitfilterUltra Cruzsc-358811PVDF 0.22 μm
```

Referenties

  1. Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. Mechanisms of sound localization in mammals. Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).
  2. Anderson, S., et al. Neural timing is linked to speech perception in noise. J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).
  3. Shannon, R. V., et al. Speech recognition with primarily temporal cues. Science. 270 (5234), 303-304 (1995).
  4. Carr, C. E., et al. Evolution and development of time coding systems. Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).
  5. Carr, C. E., Soares, D. Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system. Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).
  6. Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).
  7. Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).
  8. Schecterson, L. C., et al. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  9. Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
  10. Oertel, D. Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates. Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).
  11. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).
  12. Cramer, K. S., et al. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).
  13. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. (8), e306(2007).
  14. Sanchez, J. T., et al. Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices. J Vis Exp. (49), (2011).
  15. Jhaveri, S., Morest, D. K. Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study. Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).
  16. Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain. PLoS One. 7 (11), e48730(2012).
  17. Koppl, C. Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies. J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).
  18. Hyson, R. L. The analysis of interaural time differences in the chick brain stem. Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).
  19. Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. Emergence of hearing in the chicken embryo. J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).
  20. Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick. Brain Res. 63, 59-74 (1973).
  21. Woolf, N. K., Ryan, A. F. The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil. Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).
  22. Walsh, E. J., McGee, J. Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens. Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).
  23. Uziel, A., Romand, R., Marot, M. Development of cochlear potentials in rats. Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Controle van genexpressieplasmidinjectienucleus magnocellularisnucleus laminarisrhombomere 5 6Tet-On-systeemdoxycycline-inductieontwikkeling van auditieve neuronen
In Ovo Electroporation in de Kip Auditory Brainstem
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.