Light-Sheet gebaseerd fluorescentiemicroscopie van de levens- of gefixeerd en gekleurd Tribolium castaneum Embryo's

Samenvatting

Afbeelden van de morfogenese van insecten embryo met licht-sheet based fluorescentiemicroscopie is state of the art worden. Dit protocol beschrijft en vergelijkt drie montagetechnieken geschikt voor Tribolium castaneum embryo, worden twee nieuwe op maat gemaakte transgene lijnen geschikt voor levende imaging bespreekt essentiële kwaliteitscontroles en geeft de huidige experimentele beperkingen.

Samenvatting

De rode Tribolium castaneum is uitgegroeid tot een belangrijke insect modelorganisme in ontwikkelings-genetica en de evolutionaire ontwikkelingsbiologie. De waarneming van Tribolium embryo met licht-sheet based fluorescentiemicroscopie heeft meerdere voordelen ten opzichte van conventionele groothoek en confocale fluorescentiemicroscopie. Vanwege de unieke eigenschappen van een licht-sheet based microscoop, kunnen driedimensionale beelden van levende exemplaren worden opgenomen met hoge signaal-ruisverhouding en een aanzienlijk verlaagde foto-bleking en foto- toxiciteit langs meerdere richtingen gedurende perioden dat verschillende duren dagen. Met meer dan vier jaar van ontwikkeling van de methodiek en een continue toename van data, lijkt het geschikt moment in standard operating procedures vast te stellen voor het gebruik van licht plaat technologie in de Tribolium gemeenschap als in het insect gemeenschap in het algemeen. Dit protocol beschrijft drie bevestigingstechnieken geschof andere doeleinden, presenteert twee nieuwe op maat gemaakte transgene lijnen Tribolium geschikt voor langdurige levende beeldvorming, stelt vijf fluorescerende kleurstoffen intracellulaire structuren vaste embryo label verschaft informatie aangaande data naverwerking voor de tijdige evaluatie van de geregistreerde gegevens. Representatieve resultaten concentreren op de lange termijn live-imaging, optische sectie en de observatie van dezelfde embryo langs meerdere richtingen. De respectieve datasets worden geleverd als downloadbare bron. Tenslotte beschrijft het protocol kwaliteitscontroles voor levende beeldvormende assays huidige beperkingen en de toepasbaarheid van de beschreven procedures met andere insectensoorten.

Dit protocol is vooral bedoeld voor ontwikkelingsstoornissen biologen die imaging oplossingen die standaard laboratoriumapparatuur overtreffen zoeken. Het bevordert de continue poging om de kloof tussen de technisch georiënteerde laboratoria / gemeenschappen, die zich ontwikkelen en verfijnen micro sluitenkopiëren methodologisch, en de life science laboratoria / gemeenschappen, die 'plug-and-play' oplossingen voor technische uitdagingen vereisen. Bovendien ondersteunt een axiomatische benadering die de biologische vraagstukken in het middelpunt van de aandacht beweegt.

Inleiding

De rode Tribolium castaneum, die behoort tot de grote familie van zwartlijfkevers (Tenebrionidae), heeft een lange geschiedenis binnen de landbouw- en biowetenschappen en is het tweede best bestudeerde model insect modelorganisme na de vrucht Drosophila melanogaster vliegen. Gedurende de laatste vier decennia, het werd een krachtige en populaire insect modelorganisme in ontwikkelingsstoornissen genetica, in de evolutionaire ontwikkelingsbiologie en tijdens de laatste twintig jaar, in embryonale morfogenese voor een verscheidenheid van redenen:

Drosophila en Tribolium behoren beide tot de Holometabola, maar gedivergeerd ongeveer 300 miljoen jaar geleden ^{1, 2, 3, 4.} Terwijl de embryonale ontwikkeling van Drosophila algemeen wordt beschouwd als zeer afgeleid, Tribolium toont een voorouderlijke vorm van ontling die in een aanzienlijk groter deel van insectensoorten ^{5, 6, 7, 8, 9.} Enerzijds, Tribolium vertoont niet-involutie head ontwikkeling, namelijk de monddelen en antennes reeds ontstaan tijdens embryogenese ^{10, 11, 12, 13, 14, 15.} Ten tweede, Tribolium de beginselen van korte kiem ontwikkeling, namelijk buiksegmenten worden achtereenvolgens een achterste groeizone tijdens germband rek ^{16, 17, 18, 19.} Ten derde, Tribolium ontwikkelt en later degradeerttwee extra-embryonale membranen dwz het amnion, die het embryo enige ventraal bedekt en de serosa, waarbij het embryo volledig omhult ^{20, 21, 22.} Beide membranen spelen een cruciale morfogenetische ²³ en de beschermende rol tegen micro-organismen ^{24, 25} en ²⁶ uitdroging. Ten vierde, de embryonale ontwikkeling benen volledig functioneel tijdens het larvale levensfase en dienen als primordia voor de volwassen benen tijdens pupal metamorfose ^{27, 28, 29, 30, 31.}

Door hun geringe omvang en bescheiden eisen, de teelt van Tribolium in het laboratorium is vrij eenvoudig. Culturen van wildtype (WT) stammen of transgene lijnen gewoonlijk uit ongeveer 100-300 volwassenen en kan binnen één liter glazen flessen (footprint 80 ^cm2) gevuld 3-4 cm hoog (ongeveer 50 g) met groeimedium dat uit volledige korreltarwe bewaard meel aangevuld met actieve droge gist. Een watertoevoer is niet nodig. Dit maakt het mogelijk zelfs kleine laboratoria om tientallen kever culturen binnen kleine of middelgrote handel verkrijgbaar insect incubators te houden. Later ontwikkelingsstadia van Tribolium (larven na ongeveer het vierde stadium, poppen en volwassenen) zijn gemakkelijk gescheiden van het groeimedium door zeven. Gesynchroniseerde embryo's worden verkregen door het incuberen volwassenen kortstondig op eierleggende medium. Voor snelle ontwikkeling, worden kever kweken bij 32 ° C (ongeveer vier weken per generatie) gehouden, terwijl voorraadbeheer typisch uitgevoerd bij 22-25 ° C (ongeveer tien weken per generatie).

In de afgelopen tien jaar veel standaard techniques zijn geleidelijk aangepast en geoptimaliseerd voor Tribolium, zoals samengevat in de Emerging Modelorganismen boeken ^32. Van groot belang voortbewogen genetische werkwijzen zoals embryonale ^33, larvale ^{34, 35} of ouderlijke ^{36, 37} RNA-interferentie genexpressie knockdown kiemlijn transformatie met ofwel de piggyBac ^{38, 39} of Minos ⁴⁰ transposase systeem CRISPR / Cas9 gebaseerde genoom ⁴¹ techniek. Voorts is de Tribolium genoom gesequenced ongeveer tien jaar geleden ^42, en is nu in de derde ronde van genoom samenstel los ^43, die efficiënt en genoom-brede identificatie en systematische analyse van genen mogelijk maakt ⁴⁴ of andere genetische elementen ^{45, 46.} Bovendien, de genomen van vier andere soorten coleoptera zijn vergelijkende genetische benaderingen ^{47, 48, 49, 50.} In samenwerking met de gesequenced genoom, hebben twee grote genetische analyses uitgevoerd, namelijk een insertie mutagenese scherm ⁵¹ en een systematische RNA interferentie-genexpressie knockdown scherm ^{52, 53.}

Fluorescentie levende beeldvorming met groothoek, confocale of lichte vel gebaseerde microscopie (LSFM) maakt het mogelijk om de morfologie van embryonale Tribolium acht als functie van de tijd (de morfogenese) in een multi-dimensionele context (tabel 1). In groothoek en confocale fluorescentie microscopie, de Excitatie en emissie licht wordt geleid door dezelfde objectieflens. In beide benaderingen wordt het gehele monster verlicht elke geregistreerde tweedimensionale vlak. Derhalve worden de monsters onderworpen aan zeer hoge energieniveaus. In LSFM alleen de fluoroforen in het brandvlak worden geëxciteerd door een ontkoppeling van belichting en detectie door twee loodrecht objectieflenzen (figuur 1). LSFM komt in twee canonieke implementaties - de enkel vlak belichting microscoop (SPIM) en de digitale gescande laserlicht vel basis fluorescentiemicroscoop (DSLM figuur 2) - en biedt een aantal belangrijke voordelen ten opzichte van traditionele werkwijzen: (i) intrinsieke optische sectie vermogen, (ii) goede axiale resolutie, (iii) sterk verlaagd niveau van foto-bleken, (iv) lage foto-toxiciteit, (v) een hoge signaal-ruisverhouding, (vi) een relatief hoge meetsnelheid, (vii) beeldvorming langs meerdere richtingen en (viii) diepere penetratie dankzij het gebruik van lage numerieke apertuur verlichtingsobjektiefstelsel lenzen ^{54, 55, 56.}

LSFM is al met succes toegepast in Tribolium tot bijna het gehele embryonale morfogenese ⁵⁷ te documenteren en aan de principes van extra-embryonale membraan breuk aan het begin van dorsale sluiting ²³ te analyseren. Om de aantrekkelijkheid van LSFM verhogen in de Tribolium gemeenschap en voor insecten wetenschap in het algemeen, is het van groot belang is voor standard operating procedures vast te stellen en de methoden, protocollen en het zwembad van de middelen om een niveau te verbeteren waar de microscoop wordt een gemak-of -gebruik standaard instrument in ontwikkelingsbiologie laboratoria, en de biologische vragen verblijven in het centrum van de belangstelling.

Dit protocol begint met de basisprincipes van Tribolium </ em> teelt, dwz het onderhoud, de voortplanting en embryo collectie. Vervolgens worden twee experimentele strategieën toegelicht: (i) levende beeldvorming van op maat gemaakte transgene lijnen en (ii) beeldvorming vaste embryo's die werden gekleurd met fluorescente kleurstoffen (Tabel 2). Vervolgens drie bevestigingstechnieken met lichtjes verschillende doeleinden worden toegelicht (figuur 3 en tabel 3): (i) het agarosekolom, (ii) de agarose halfrond en (iii) het nieuwe spinnenweb houder. Het protocol legt vervolgens de data acquisitie procedure LSFM. Beeldvormende modaliteiten en de belangrijkste overwegingen zijn geschetst. Tenslotte wordt embryo retrieval uitgelegd en suggesties voor basisgegevens transformatie worden geleverd. In de representatieve resultaten, actuele beeldgegevens van twee nieuwe maat en Glia-blauwe ⁵⁸ transgene lijnen weergegeven en de bijbehorende datasets beeldvorming verschaft als downloadbare bron. Bovendien, imagegegevens van vaste embryo's die werden gekleurd met verschillende fluorescentie kleurstoffen worden gepresenteerd. De discussie richt zich op de kwaliteitscontrole, de huidige beperkingen van de live-imaging benadering en de aanpassing van het protocol bij andere soorten.

Het protocol is bestemd voor lichte plaat gebaseerde fluorescentie microscopen die zijn voorzien van een monsterkamer en een draaibaar klemmechanisme gestandaardiseerde monsterhouders ^{54, 59, 60,} die typisch cilindervormige elementen van metaal, kunststof of glas met een diameter in het millimeterbereik. Het protocol is geschikt voor canonische implementaties, namelijk SPIM en DSLM, alsmede voor opstellingen met twee of meer belichting en detectie armen ^{61, 62, 63.} De representatieve resultaten tonen gegevens in twee spektraalkanalen, groen (illumination met een 488 nm laser detectie door een 525/50 banddoorlaatfilter) en rode (belichting met een 561 nm laser detectie door een 607/70 banddoorlaatfilter), maar het protocol kan worden uitgebreid tot drie of vier spektraalkanalen.

Protocol

1. Veehouderij van Tribolium Cultures

OPMERKING: Standaard omstandigheden worden gedefinieerd als een incubatietemperatuur van 25 ° C en 70% relatieve vochtigheid in een 12 uur licht / 12 uur donker cyclus. Voor meer informatie over Tribolium en veeteelt, de respectieve richtlijnen beschikbaar ^64. Dit protocol vereist twee verschillende op meel gebaseerde media, dat kan worden bereid kilogramhoeveelheden en houdbaarheid van meerdere maanden.

1. Voordat hij met meel en actieve droge gist, slaan de ongeopende verpakking bij -20 ° C gedurende 24 uur en laat ze opwarmen tot kamertemperatuur. Deze procedure voorkomt potentiële ziekteverwekkers.
2. Passen generfd tarwebloem en inactieve droge gist door een zeef met 710 urn maaswijdte, bereidt vervolgens groeimedium door daaraan gezeefde generfd bloem met 5% (w / w) gezifte inactief droge gist.
3. Pass 405 fijn tarwemeel en inactieve droge gist door een zeef met 250 & #181; m maaswijdte, bereidt vervolgens eierleggende medium door daaraan gezeefd 405 fijne tarwebloem met 5% (w / w) gezifte inactief droge gist.
4. Passeer de respectieve Tribolium cultuur door middel van een zeef met 800 urn maaswijdte. Gooi de overgebleven groeimedium. Breng de larven, poppen en volwassenen met een groot glas schotel.
5. Als er geen nageslacht cultuur bestaat, over te dragen ongeveer 80 larven en / of poppen om een ​​nieuwe glazen fles naar een nieuw nageslacht cultuur te creëren. Als er geen larven en / of poppen aanwezig zijn, neemt ongeveer 40 volwassenen plaats. Voeg 50 g groeimedium en incubeer onder normale omstandigheden.
6. Verzamel ongeveer 300 volwassenen (500-700 mg) in een nieuwe glazen fles naar de beeldvorming cultuur te creëren. Voeg 50 g groeimedium en incubeer onder normale omstandigheden. Laat de beeldvorming kweek te regelen gedurende ten minste 24 uur in vers kweekmedium vóór embryo.
7. Vervang het groeimedium van de imaging cultuur minstens om de twee weeks, die kan worden uitgevoerd in samenhang met embryo (zie 3.2). Na twee tot drie maanden, volledig vervangen van de imaging cultuur door het nieuwe volwassenen uit het nageslacht cultuur.
8. Indien een niet homozygote transgene lijn wordt gebruikt, curate nakomelingen culturen vaak door het verwijderen van niet-transgene dieren. Idealiter genereren homozygote lijnen indien de respectieve transgen niet dodelijk of laat steriliteit indien aanwezig op beide chromosomen. Homozygote culturen hebben typisch een hogere gemiddelde fluorescentie niveau en de algemene experimentele omstandigheden zijn smaller, aangezien slechts één genotype aanwezig is.

2. Microscoop Instellingen en kalibratie

OPMERKING: De Tribolium embryo een anterior-posterior lengte van ongeveer 600-660 urn en een transversale diameter van ongeveer 300-330 urn. De meeste moderne CCD camera's hebben een sensorchip grootte van ongeveer 9 mm x 7 mm, dat wil zeggen een diameter van 11,4 urn en een pixel-pixelafstand van 6,45 urn.In combinatie met een vergroting van 10X objectief, kan het embryo worden afgebeeld in zijn geheel met een pixel pitch van 0,645 urn. De meeste moderne sCMOS camera's hebben een grotere sensor chip afmeting van ongeveer 16 mm x 14 mm, dat wil zeggen een diameter van 21,3 urn en een pixel-pixelafstand van 6,5 urn. In combinatie met een vergroting van 20x objectief, kan het embryo worden afgebeeld in zijn geheel met een pixel pitch van 0,325 urn.

1. Bevestig de belichting en detectie objectieven aan de microscoop. Waarborgen dat lasers en fluorescentie filters overeenkomen met de fluorofoor absorptie- en emissiespectra goed.
2. Bevestig de monsterkamer aan de microscoop. Vul de monsterkamer met PBS pH 7,4 of andere geschikte buffer beeldvorming.
3. Schakel en kalibreren de microscoop. Uitgebreide kalibratie routines en richtlijnen voor het oplossen van problemen voor custom-built light-sheet gebaseerde microscopen (meer specifiek voor de DSLM implementatie) zijn gepubliceerd previously ^65. Voor commerciële apparaten, volg de instructies van de fabrikant zeer zorgvuldig. Verkeerd gebruik kan de monsterkamer van het medium uitputten en verwoesting leiden naar het instrument en het specimen.

3. Verzameling van transgene embryo's of WT

1. Voorbij de beeldvormende kolonie door een zeef met maaswijdte 800 pm. Verzamel volwassen kevers in een nieuwe glazen fles en voeg 10 g eierleggende medium. Incubeer de eierleggende kweek gedurende 1 uur bij 25 ° C en 70% relatieve vochtigheid in licht.
2. Voorbij de eierleggende cultuur door een zeef met 800-um maaswijdte volwassenen scheiden van de eierleggende medium dat ongeveer 30-100 embryo bevat. Transfer volwassenen om een ​​nieuwe glazen fles en voeg ofwel de oude of 50 g vers groeimedium.
3. Als observatie moet beginnen tegen uniform blastoderm fase (voorbeeld dataset DS0002), incubeer de eierleggende medium gedurende 15 uur bij 25 ° C en 70% relatieve vochtigheid. To beginnen bij het begin van terugtrekking germband (bijvoorbeeld datasets DS0001 en DS0003), incubeer embryo's gedurende 23 uur bij 32 ° C en 70% relatieve vochtigheid. Als andere ontwikkelingsstadia gewenst, verwezen naar de desbetreffende literatuur ^{64, 65} en passen incubatietijd en / of temperatuur nodig.

4. Embryo Dechorionation

OPMERKING: De chorion is het buitenste gedeelte van de eierschaal en bestaat uit eiwitten en polysachariden. Het sterk lichtabsorberende maar niet essentieel voor een goede ontwikkeling en kan derhalve chemisch worden verwijderd.

1. Voorbij de eierleggende medium door een zeef met maaswijdte 300 urn. Verzamelen van de embryo's in een cel zeef van 100 urn maaswijdte en gooi de overgebleven eierleggende medium.
2. Bereid een 6-wells plaat als volgt: vul de A1, A2, A3 en B3 putjes met 10 mL PBS pH 7,4 en B1 en B2 putjes met 9 ml PBS. Voeg vervolgens voorzichtig1 ml natriumhypochloriet naar B1 en B2. Let op de voortgang van de stappen 4,3-4,8 onder de stereo microscoop. VOORZICHTIG natriumhypochloriet is corrosief.
3. Plaats de cel zeef in de put A1 (PBS pH 7,4) en was de embryo gedurende één minuut onder voorzichtig roeren. Grotere bloemdeeltjes moeten losmaken van het embryo.
4. Breng de cel zeef om de put B1 (natriumhypochloriet in PBS pH 7,4) en schud de plaat krachtig gedurende 30 seconden. De resterende bloemdeeltjes moet volledig los van het embryo.
5. Breng de cel zeef om de put A2 (PBS pH 7,4) en was de embryo's gedurende 1 min onder zacht schudden.
6. Voor dechorionation, breng de cel zeef om de B2 put (natriumhypochloriet in PBS pH 7,4). Schud de plaat krachtig tot het chorion breuken en los van het embryo. Het chorion lijkt op een dunne semi-transparante membraan met gescheurde randen, terwijl dechorionated embryo een gewone silhouet.
7. Transfer the cel zeef om de put A3 (PBS pH 7,4) en was de embryo's gedurende 1 min onder zacht schudden. Indien chorion fragmenten nog de embryo's na het wassen verbonden Herhaal stap 4.6.
8. Bewaar de embryo's in de B3 goed (PBS pH 7,4). Opslag gedurende enkele uren is niet schadelijk voor de embryo's, maar in gedachten houden dat de ontwikkeling doorgaat.
9. Voor niet-homozygote transgene lijnen, verwijder niet fluorescerende embryo indien mogelijk. Voor fixatie en kleuring van WT of transgene embryo's, verder met stap 5. Voor live beeldvorming van transgene embryo verder met stap 6.

5. vitellinemembraan permeabilisatie, fixatie en kleuring

OPMERKING: De vitellinemembraan is de binnenlaag van de eierschaal. Het is ongevoelig voor fluorescente kleurstoffen en moet chemisch permeabel worden voor kleuring daarmee.

1. Vul een scintillatieflesje met fixatie / permeabilisatie (1,5 mL 4% (w / v) paraformaldehyde in PBS pH 6,9 eennd 1,5 ml n-heptaan). Transfer embryo's met een penseel aan de flesjes. flesjes cover met aluminiumfolie om fluoroforen te beschermen tegen licht en incubeer gedurende 30 minuten op een schudplatform bij 50 omwentelingen per minuut. LET paraformaldehyde is giftig en bijtend, n-heptaan is brandbaar en giftig.
2. Verwijder fixeeroplossing en behandelen embryo drie maal gedurende 15 min in 3 mL 0,1% (v / v) Triton X-100 in PBS pH 7,4 en daarna eenmaal gedurende 15 minuten in 3 ml 1% (v / v) Triton X-100 in PBS pH 7,4 op een schudplatform bij 50 omwentelingen per minuut. LET OP Triton X-100 is bijtend.
3. Verwijder permeabilisatie oplossing en voeg 0,5 ml kleuroplossing aan het flesje. Illustratieve kleuringoplossingen worden gegeven in tabel 2. Vlek embryo overnacht bij 4 ° C op een schudplatform bij 50 omwentelingen per minuut. Voor de in tabel 2 voorgesteld kleurstoffen, wassen is niet nodig.

6. Bereiding Montagevoorbeeld Agarose

1. Voeg 1 g low-meltagarose 100 mL PBS pH 7,4 en verwarm het mengsel gedurende 2-3 minuten in een magnetron bij 800 W. Als kleine agarosedeeltjes nog aanwezig, herhaalt het verwarmingsproces in 30 seconden intervallen totdat de deeltjes volledig op te lossen. De montage agarose hoeft niet vers bereid telkens de agarose stolde kan opnieuw vloeibaar gemaakt door verhitting zoals hierboven beschreven. Dit proces kan 5-6 maal herhaald worden voordat te veel water verdampt is.
2. Laat de agarose afkoelen tot ongeveer 40-45 ° C en vult twee 1,5 ml reageerbuisjes met de verwarmde agarose en houd deze buizen bij 35 ° C in een thermoblok.

7. Embryo Montage en inbrengen in de monsterkamer

1. Optie 1: agarosekolom (figuur 3A-C, eerste kolom, tabel 3, tweede kolom)
   1. Vul een 1,0 ml spuit met gedestilleerd water en plaats deze aan een van de glazen capillaire openingen met een kleine rubberen slang.Vul het capillair halverwege met gedestilleerd water.
   2. Kies een embryo met een penseel en plaats het op de binnenzijde van de andere glazen capillaire opening. Ga snel naar de volgende stap voor de embryo uitdroogt.
   3. Plak het capillair in de vloeistof agarose en langzaam trek een paar ul vloeibare agarose naast het embryo in het capillair. Vervolgens snel verhogen de trekkracht, zodat de embryo meegesleept de agarose. Uiteindelijk dienen sommige pi agarose boven en onder de embryo. Stel de capillaire opzij voor een paar minuten en laat de agarose stollen.
   4. Verkorten van de capillair met een diamant glassnijder tot een lengte van ongeveer 5 mm. De overblijvende fragment moet volledig gevuld met agarose en het embryo moet binnen het tweede kwartiel.
   5. Plaats de stalen cilinder met de pen in de monsterkamer en plak de capillaire fragment bovenop de pen. De agarosekolom uitsteken enkele millimeters from het capillair fragment met het deel dat het embryo bevat.
2. Optie 2: Agarose hemisfeer (Figuur 3A-C, tweede kolom, tabel 3, derde kolom)
   1. Trek 200 gl vloeibare agarose in een 1,0 ml spuit vervolgens gebruikt om de stalen pijp vanaf de top met agarose vullen tot een halve bol vormt aan de bodemopening. De halve bol diameter moet gelijk zijn aan de diameter van de buizen. Wacht een paar minuten tot de agarose is gestold.
   2. Kies een embryo met een penseel en herschikken op het uiteinde van de borstel, zodat het voorste uiteinde toegankelijk wordt. Dompel de agarose halfrond in vloeibare agarose te bedekken met een dunne film.
   3. Plaats de embryo met zijn voorste einde rechtop op de paal van de agar halfrond. Draai de stalen pijp rond en corrigeer de positie van het embryo met de borstel. Eventueel stabiliseren van de embryo agarose door toevoeging van 2 pi aan het embryo / halfrond grens. ideaally, moet kleiner zijn dan de helft van de embryo oppervlak bedekt met agarose en de flanken moet zo hoog mogelijk zijn.
   4. Plaats de stalen pijp met de halve bol en embryo langzaam in de monsterkamer.
3. Optie 3: Spinneweb houder (figuur 3A-C, derde kolom, tabel 3, vierde kolom)
   1. Kies een embryo met een penseel en opzij leggen.
   2. Bedek het sleufgat van het spinnenweb houder met 5-8 gl vloeibare agarose, dan de meeste van de agarose te verwijderen totdat er slechts een dunne agarose film achter.
   3. Plaats de embryo op de agarose film en zijn positie aan te passen. Beweeg voorzichtig het embryo aan de x-as centrum van het sleufgat en stapel hem langwerpige anterior-posterior as de langsas van het sleufgat.
   4. Plaats de houder spinnenweb met gemonteerde embryo langzaam in de monsterkamer. Positioneer het spinnenweb houder, zodat het niet interfereert met de excitatie en emissielicht, dus 45 ° ten opzichte van de x- en z-as.

8. Light Sheet-gebaseerde fluorescentie microscopie

1. Beslis samen hoeveel richtingen (en waarlangs oriëntaties) het embryo moet worden afgebeeld. Vier richtingen (langs de oriëntaties 0 °, 90 °, 180 ° en 270 °) gewoonlijk een goede trade-off tussen dekking en energiebelasting.
2. Stel het aantal fluorescentiekanalen. De belangrijkste parameters voor elk kanaal de laserlijn, de fluorescentie filter, het laservermogen en de belichtingstijd. Voor de lange termijn live-imaging, is het belangrijk dat de geïntegreerde energiebelasting de tolerantie van het embryo niet overschrijdt. Een belichtingstijd van 25-50 ms zorgt voor snelle beeldvorming, terwijl een laservermogen van 100 tot 300 pW afbreuk doet aan de levensvatbaarheid van de embryo. Voor vaste monsters, belichtingstijd en laservermogen kan ten minste worden verdubbeld.
3. Voor live imaging tests, het configureren van de time lapse. de complete embryogenese van Tribolium duurt ongeveer zeven dagen bij kamertemperatuur (23 ± 1 ° C) en iets minder dan drie dagen bij 32-35 ° C ^64. Definieert het tijdsinterval volgens de morfogenetische gebeurtenissen die genomen moeten worden. Voor korte tijd intervallen, overweeg dan het verlagen van de blootstelling tijd en laservermogen (zie 8.2).
4. Positioneer het embryo in doorgelaten licht stand langs de x- en y-assen in het midden van het gezichtsveld zonder bloot te stellen aan de laser. Roteer het embryo 360 ° in 90 ° stappen voor het embryo voor schade die tijdens het montageproces kunnen plaatsvinden onderzoeken.
5. Draai de embryo geschikte wijze rond de y-as om de embryonale as af te stemmen op de microscoop assen, bijvoorbeeld de horizontale as de x-as, dat wil zeggen de dorsoventrale as de z-as. Bij gebruik van de houder spinnenweb techniek kan aanpassing niet mogelijk.
6. In de fluorescentiemodus Definieer de z-stack for elke richting. Voeg 25-50 urn ruimtelijke buffer voor en achter het embryo. Waaronder de buffer, de typische z-stack omvat ongeveer 350-400 urn voor een Tribolium embryo. Bepaal tevens de z-afstand, die vier keer de laterale afstand moet zijn, dat wil zeggen de afstand langs de x- en y-assen ^66.
7. Als twee of meer embryo's worden afgebeeld parallel herstarten op 8.4 met de volgende embryo.
8. Voor langdurige beeldvorming voor dat de monsterkamer gevuld met voldoende PBS pH 7,4 of andere beeldvormende buffer. Ook de monsterkamer opening.
9. Start het beeldvormingsproces. Voor de lange termijn live-imaging, toezien op de correcte overname langs alle kanten in alle kanalen voor alle embryo's. Controleer regelmatig de komende dagen dat de embryo's in leven zijn en in de juiste positie.

9. Embryo Retrieval en Quality Control

1. Zodra beeldvorming is voltooid, verwijdert de monsterhouder metde embryo's uit de monsterkamer. Alleen embryo's van live-imaging tests moeten worden opgehaald. Gefixeerd en gekleurd embryo kan worden weggegooid.
2. Indien een levend beeldvorming werd uitgevoerd, breng de embryo een objectdrager. Voor het agarosekolom techniek pak het embryo van de omringende agarose met een scalpel, micro-mes of scheermes. Voor de agarose halfrond techniek dragen de halve bol met de platte kant naar de objectdrager. Embryo verwijdering is niet nodig. Voor het spinnenweb houder techniek voorzichtig demonteren het embryo uit de agarose film met een penseel. Incubeer de objectdrager in een kleine glazen schaal in verzadigde luchtvochtigheid atmosfeer onder standaardomstandigheden tot de larven uitkomen.
3. Na het uitkomen, dragen de larven individuele putjes van een 24-wells plaat en voeg 500 mg groeimedium aan elk putje. Incubeer onder normale omstandigheden. Vergelijk de totale ontwikkelingstijd en morfologie van de afgebeelde larven aan niet-afgebeeld WT en transgene larvae (zie bespreking). In assays die kenmerkend WT ontwikkeling, mag geen duidelijke morfologische aberraties idealiter merkbaar.
4. Zodra de larven ontwikkelen zich tot gezonde volwassenen, hen de nodige WT partners van dezelfde achtergrond stam. Na twee weken te controleren op nageslacht productie. Ook interessant om de vruchtbaarheid van het nageslacht controleren door te koppelen inter pares. Alleen wanneer het afgebeelde embryo's ontwikkelen tot vruchtbare volwassenen die vruchtbaar nageslacht te produceren, kan de beeldvorming procedure worden beschouwd als niet-invasieve.

10. Image Data Processing

LET OP: Voor de beeldgegevens verwerkt, is de open-source software voor beeldverwerking ImageJ ⁶⁷ of haar derivaat FIJI ⁶⁸ worden aanbevolen. Beide versies evenals uitgebreide documentatie zijn te vinden op www.imagej.net. De standaard bestandsformaat voor LSFM data is de Tagged Image File Format (TIFF). De intrinsieke container optie kan de stowoede van afbeeldingsstapels zoals z-stacks of tijdreeksen van z maximale verhogingen in één bestand in ImageJ of FIJI te openen drag-and-drop.

1. Draai zo nodig de z-stacks aan de voorste-achterste as van het embryo met de y-as (Image → Transformeren → Roteren) sluiten. Houd er rekening mee dat de rotatie parameters moeten afzonderlijk worden ingesteld voor elke richting, maar niet voor het tijdsverloop en de fluorescentie-kanalen.
2. Snijd de z-stacks langs de x-, y- en z-assen, zodat slechts minimale achtergrond (20-40 pixels langs de x- en y-assen, 5-10 vlakken langs de z-as) blijft (voor x - en y-assen gebruikt Rechthoekig selectiegereedschap, vervolgens Afbeelding → gewas, de z-as, gebruik Afbeelding → Stacks → Extra → Slice Keeper). Houd er rekening mee dat het bijsnijden parameters moeten afzonderlijk worden ingesteld voor elke richting, maar niet voor de tijdstippen en de fluorescentie-kanalen.
3. Bereken de z maximale projectie voor elke z-stack(Afbeelding → Stacks → Z Project, kiezen Max Intensity). Intensiteitsprojectiewerkwijze berekeningen procedures data vereenvoudigen dat één ruimtelijke dimensie verwijderen.
4. Voor langdurige levende beeldgegevens, overwegen een ImageJ of FIJI script uitvoert bewerkingsstappen 10,1-10,3 alle richtingen, alle tijdstippen en alle fluorescentiekanalen ^65. Idealiter samenvoegen alle z maximum uitsteeksels per kanaal en richting en opslaan als een tijdreeks in een TIFF container. Alternatief kan de plug-BigDataViewer ⁶⁹ voor FIJI worden gebruikt om door Terabyte grote datasets navigeren.
5. Afhankelijk van de transgene lijn en beeldvormingsmodaliteiten, kan dynamische intensiteit aanpassing van de tijd stapels wenselijk als gevolg van foto-bleking en / of fluorofoor expressie fluctuaties. Ofwel de ImageJ- of FIJI-intrinsieke Bleach Correction-functie (Afbeelding → Pas → Bleach Correctie, kiezen Histogram Matching) of Dedicated software ⁶⁵ worden voorgesteld.
6. Als het embryo werd genoteerd en / of langs meerdere richtingen en met verschillende fluorescentiekanalen, horizontale combinatie van de richtingen (Image → Stacks → Extra → combineren) en kanaal samenvoegen (Afbeelding → kleur samenvoegen → Channels) aanbevolen.
7. Registratie en fusie van z-stacks langs meerdere richtingen ⁷⁰ verkregen, eventueel in combinatie met deconvolutie ^71, maakt de berekening van superieure driedimensionale beelden van dezelfde kwaliteit en isotrope resolutie. Zowel plug-ins zijn open source en vooraf geïnstalleerd FIJI, maar zij vereisen de aanwezigheid van mijlpalen (fluorescerende microbolletjes, bijvoorbeeld korrels) rond het monster.
8. Open-source framework voor grootschalige kwantitatieve data-extractie en analyse zijn ook beschikbaar, bijvoorbeeld voor segmentatie en tracering van celkernen ⁷² of cell vormherkenningsmiddelen ^73.

Resultaten

Dit protocol beschrijft een experimenteel kader voor fluorescentie beeldvorming van levende of gefixeerd en gekleurd Tribolium embryo's met LSFM. Vanwege de lage foto-bleken en foto-toxiciteit, een direct gevolg van de optische sectie vermogen, LSFM bijzonder geschikt voor langdurig leven beeldvorming.

De nieuwe AGOC {ATub'H2B-mEmerald} nr.1 transgene lijn brengt een histone2B mEmerald-fusie-eiwit onder contro...

Discussie

Kwaliteitscontrole

In levende beeldvormende assays, moet het preparaat en registratieprocedure niet-invasief, dat wil zeggen noch de mechanische en chemische hanteren (verzamelen, dechorionation, montage op de monsterhouder) noch de geïntegreerde lading energie tijdens de waarneming de levensvatbaarheid van het preparaat moeten beïnvloeden. Voor studies die kenmerkend WT ontwikkeling, is het raadzaam om alleen gegevens uit experimenten waarin het embryo overleeft he...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
full grain wheat flour	Demeter e.V.	1.13E+08	US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour	Demeter e.V.	1.13E+08	US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast	Flystuff / Genesee Scientific	62-106
Phosphate-buffered Saine (PBS), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl	Sigma Aldrich	425044-250ML	Opgelet: natriumhypochloriet is corrosief
low-melting agarose	Carl Roth	6351.2
6-well plate	Orange Scientific	4430500
24-well plate	Orange Scientific	4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm	Brand GmbH + Co KG	7087 09
SYTOX Green	Thermo Fisher Scientific	57020	De voorbereiding van de kleuroplossing wordt uitgelegd in Tabel 2
YOYO-1 Iodide	Thermo Fisher Scientific	Y3601	De voorbereiding van de kleuroplossing wordt uitgelegd in Tabel 2
BOBO-3 Iodide	Thermo Fisher Scientific	B3586	De voorbereiding van de kleuroplossing wordt uitgelegd in Tabel 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	De voorbereiding van de kleuroplossing wordt uitgelegd in Tabel 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22283	De voorbereiding van de kleuroplossing wordt uitgelegd in Tabel 2
sieve, 800 µm mesh size	VWR International	200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size	VWR International	200.025.222-050	voor de bereiding van groeimedium (stap 1.1)
sieve, 300 µm mesh size	VWR International	200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size	VWR International	200.025.222-038	voor de bereiding van eilegmedium (stap 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm	Sigma Aldrich	CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size	BD Biosciences	352360
paint brush, head Ø 2 mm	VWR International	149-2121
syringe, 1.0 mL	B. Braun Medical AG	9166017V
scintillation vials	Sigma Aldrich	M1152-1000EA
paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	158127	Opgelet: paraformaldehyde is giftig en corrosief
n-heptane ≥99%	Carl Roth	8654.1	Opgelet: n-heptaan is ontvlambaar en giftig
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML	Opgelet: Trition X-100 is corrosief