Wij presenteren een software oplossing voor semi-geautomatiseerde tracking van relatieve eiwitconcentratie langs de lengte van dynamische cellulaire uitsteeksels.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een grafische gebruikersinterface voor software-assisted tracking van eiwitconcentratie in dynamische cellulaire protrusies
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Filopodia zijn dynamische, vingerachtige cellulaire uitsteeksels die verband houden met migratie en celcelcommunicatie. Om de complexe signaleringsmechanismen die onderliggende filopodiale initiatie, verlenging en daaropvolgende stabilisatie of terugtrekking beter te begrijpen, is het cruciaal om de spatio-temporale eiwitactiviteit in deze dynamische structuren te bepalen. Om de eiwitfunctie in filopodie te analyseren, hebben we onlangs een semi-geautomatiseerd tracking algoritme ontwikkeld dat zich aanpasst aan filopodiale vormveranderingen, waardoor parallelle analyse van protrusiedynamiek en relatieve eiwitconcentratie langs de gehele filopodiale lengte mogelijk is. Hier presenteren we een gedetailleerd stap-voor-stap protocol voor geoptimaliseerde celverwerking, beeldverzameling en software analyse. We geven verder instructies voor het gebruik van optionele functies tijdens beeldanalyse en data weergave, evenals richtlijnen voor het oplossen van problemen voor alle kritische stappen onderweg. Tot slot omvatten we ook een vergelijking van de dBeschadigde beeldanalysesoftware met andere programma's die beschikbaar zijn voor filopodia kwantificering. Samen biedt het gepresenteerde protocol een kader voor nauwkeurige analyse van eiwitdynamiek in filopodiale uitsteeksels met behulp van beeldanalysesoftware.
Inleiding
Spatio-temporale controle van actin regulerende eiwitten is geassocieerd met filopodium dynamics 1 , 2 . Het volgen van ruimtelijk opgeloste eiwitconcentratie langs de hele filopodiale lengte door de tijd is dus van cruciaal belang om ons te begrijpen van de mechanismen die onderliggende initiatie, verlenging, stabilisatie of ineenstorting van deze dynamische structuren 3 , 4 liggen . In tegenstelling tot eiwitanalyse in de cytosol, waar veel veranderingen in de celvorming op grotere schaal optreden, zijn filopodia dynamische microstructuren die voort....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Celcultuur
- Cultuur HeLa of COS cellen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) die 4,5 g / L D-glucose, L-alanine-L-glutamine dipeptide, pyruvaat, 10% foetaal runder serum en 10 eenheden / ml penicilline / streptomycine bevat. Cultuurneuronen in cultuurmedia zonder L-glutamine, glutaminezuur of asparaginezuur, aangevuld met 0,5 mM L-alanine-L-glutamine dipeptide, serumvrije neuronale supplementen en 10 eenheden / ml penicilline / streptomycine.
- Zodra 40% samenvloeiing bereikt is, transfecteer cellen met gewenste constructies met behulp van een transfectie-reagens volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar getransfecteerde cellen in ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van COS-cellen getransfecteerd met een marker voor filamenteuze actine (f-tractine 18 , rood) en een cytosolische referentie (groen), vonden we actinrijke filopodiale uitsteeksels ( figuur 3A , bovenpaneel). Tijdreeksen toonden aan dat filopodia snel uitstrekken en terugtrekken ( Figuur 3A , middenpaneel). Met behulp van de beeldanalysesoftware traceerden we individuele filopodia. Vergelijking .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het bijhouden van filopodiale groeidynamiek en analyse van relatieve eiwitconcentraties in deze dynamische structuren via het convex-rompalgoritme. Met behulp van de software kunnen maximaal 3 kanalen in een enkele run worden vergeleken, waarbij de relatieve concentraties van twee kanalen (dat wil zeggen eiwitten) door de extensie / terugtrekkingscyclus worden vastgelegd en opgeslagen worden als beeld- en gegevensbestanden in afzonderlijke mappen. Naast de rou.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen financiering van de DFG (EXC-1003 naar MG).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies | 31966-021 | |
| 10% Fetal bovien serum | Biochrom AG | L11-044 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-027 | |
| 1% penicillin/streptomycin | Biochrom AG | 12212 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| HEPES (1M stockoplossing) | Life Technologies | 15630 | |
| Citrine-N1 | Addgene | 54593 | |
| Labtech | Thermo | 155411 | |
| Glutamax-I | Thermo | 35050-061 | |
| Hela | Leibniz Institute DSMZ | ACC-57 | |
| COS 7 | Leibniz Institute DSMZ | ACC-60 | |
| 3T3 cellen | Leibniz Institute DSMZ | ACC-59 | |
| Microscoop | Nicon Eclipse | ||
| Camera | Andor | DU888 Ultra | |
| Confocal Unit | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Pyruvate | Gibco | 31966-021 |
Referenties
- Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (23), 13438-13443 (1999).
- Matus, A., Brinkhaus, H., Wagner, U.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
