Method Article

Een grafische gebruikersinterface voor software-assisted tracking van eiwitconcentratie in dynamische cellulaire protrusies

DOI:

10.3791/55653

⸱

July 11th, 2017

 ,  , 
1DFG Cluster of Excellence 'Cells in Motion', (EXC 1003), Institute of Medical Physics and Biophysics, University of Muenster

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij presenteren een software oplossing voor semi-geautomatiseerde tracking van relatieve eiwitconcentratie langs de lengte van dynamische cellulaire uitsteeksels.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Filopodia zijn dynamische, vingerachtige cellulaire uitsteeksels die verband houden met migratie en celcelcommunicatie. Om de complexe signaleringsmechanismen die onderliggende filopodiale initiatie, verlenging en daaropvolgende stabilisatie of terugtrekking beter te begrijpen, is het cruciaal om de spatio-temporale eiwitactiviteit in deze dynamische structuren te bepalen. Om de eiwitfunctie in filopodie te analyseren, hebben we onlangs een semi-geautomatiseerd tracking algoritme ontwikkeld dat zich aanpasst aan filopodiale vormveranderingen, waardoor parallelle analyse van protrusiedynamiek en relatieve eiwitconcentratie langs de gehele filopodiale lengte mogelijk is. Hier presenteren we een gedetailleerd stap-voor-stap protocol voor geoptimaliseerde celverwerking, beeldverzameling en software analyse. We geven verder instructies voor het gebruik van optionele functies tijdens beeldanalyse en data weergave, evenals richtlijnen voor het oplossen van problemen voor alle kritische stappen onderweg. Tot slot omvatten we ook een vergelijking van de dBeschadigde beeldanalysesoftware met andere programma's die beschikbaar zijn voor filopodia kwantificering. Samen biedt het gepresenteerde protocol een kader voor nauwkeurige analyse van eiwitdynamiek in filopodiale uitsteeksels met behulp van beeldanalysesoftware.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spatio-temporale controle van actin regulerende eiwitten is geassocieerd met filopodium dynamics 1 , 2 . Het volgen van ruimtelijk opgeloste eiwitconcentratie langs de hele filopodiale lengte door de tijd is dus van cruciaal belang om ons te begrijpen van de mechanismen die onderliggende initiatie, verlenging, stabilisatie of ineenstorting van deze dynamische structuren 3 , 4 liggen . In tegenstelling tot eiwitanalyse in de cytosol, waar veel veranderingen in de celvorming op grotere schaal optreden, zijn filopodia dynamische microstructuren die voort....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Celcultuur

  1. Cultuur HeLa of COS cellen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) die 4,5 g / L D-glucose, L-alanine-L-glutamine dipeptide, pyruvaat, 10% foetaal runder serum en 10 eenheden / ml penicilline / streptomycine bevat. Cultuurneuronen in cultuurmedia zonder L-glutamine, glutaminezuur of asparaginezuur, aangevuld met 0,5 mM L-alanine-L-glutamine dipeptide, serumvrije neuronale supplementen en 10 eenheden / ml penicilline / streptomycine.
  2. Zodra 40% samenvloeiing bereikt is, transfecteer cellen met gewenste constructies met behulp van een transfectie-reagens volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar getransfecteerde cellen in ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van COS-cellen getransfecteerd met een marker voor filamenteuze actine (f-tractine 18 , rood) en een cytosolische referentie (groen), vonden we actinrijke filopodiale uitsteeksels ( figuur 3A , bovenpaneel). Tijdreeksen toonden aan dat filopodia snel uitstrekken en terugtrekken ( Figuur 3A , middenpaneel). Met behulp van de beeldanalysesoftware traceerden we individuele filopodia. Vergelijking .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het bijhouden van filopodiale groeidynamiek en analyse van relatieve eiwitconcentraties in deze dynamische structuren via het convex-rompalgoritme. Met behulp van de software kunnen maximaal 3 kanalen in een enkele run worden vergeleken, waarbij de relatieve concentraties van twee kanalen (dat wil zeggen eiwitten) door de extensie / terugtrekkingscyclus worden vastgelegd en opgeslagen worden als beeld- en gegevensbestanden in afzonderlijke mappen. Naast de rou.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen financiering van de DFG (EXC-1003 naar MG).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMLife Technologies31966-021
10% Fetal bovine serumBiochrom AGL11-044
Lipofectamine 2000Life Technologies11668-027
1% penicillin/streptomycinBiochrom AG12212
Neurobasal MediumLife Technologies21103-049
B27Life Technologies17504-044
HEPES (1M stock solution)Life Technologies15630
Citrine-N1Addgene54593
LabtechThermo155411
Glutamax-IThermo35050-061
HelaLeibniz Institute DSMZACC-57
COS 7Leibniz Institute DSMZACC-60
3T3 cellsLeibniz Institute DSMZACC-59
MicroscopeNicon Eclipse
CameraAndorDU888 Ultra
Confocal UnitYokagawaCSU-X1
PyruvateGibco31966-021

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (23), 13438-13443 (1999).
  2. Matus, A., Brinkhaus, H., Wagner, U.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Filopodia TrackingProtein ConcentrationImage Analysis SoftwareProtrusion DynamicsGraphical User InterfaceSpatial Temporal AnalysisProtein LocalizationCell MigrationActin FilamentsRatiometric Protein Analysis

Related Articles