Methodenartikel

Isolatie van intermediaire filamentproteïnen uit meerdere muisweefsels om te bestuderen veroudering-geassocieerde post-translationele modificaties

DOI:

10.3791/55655

⸱

18 mei 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, School of Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze methode presenteren wij biochemische procedures voor snelle en efficiënte isolatie van intermediaire filament (IF) eiwitten uit meerdere muisweefsels. Geïsoleerde IF's kunnen worden gebruikt om veranderingen te onderzoeken in post-translatie modificaties door massaspectrometrie en andere biochemische analyses.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Intermediaire filamenten (IF's), samen met actinfilamenten en microtubules, vormen het cytoskelet - een kritisch structureel element van elke cel. Normaal functioneren IF's leveren cellen met mechanische en spanningsbestendigheid, terwijl een dysfunctioneel IF-cytoskelet de cellulaire gezondheid compromiseert en met veel mensenziekten is geassocieerd. Post-translationele modificaties (PTM's) regelen de IF-dynamiek kritiek op fysiologische veranderingen en onder stressomstandigheden. Daarom kan het vermogen om veranderingen in de PTM-handtekening van IF's te volgen, bijdragen aan een beter functioneel begrip en uiteindelijk conditioneren van het IF-systeem als een stressrespons tijdens cellulaire verwondingen. Het grote aantal IF-eiwitten, die door meer dan 70 individuele genen worden gecodeerd en op weefselafhankelijke wijze worden uitgedrukt, is echter een grote uitdaging om het relatieve belang van verschillende PTM's te sorteren. Daartoe zijn methoden die de controle op PTM's op IF-eiwitten mogelijk makenOp organisme-breed niveau, in plaats van voor geïsoleerde leden van de familie, kan de vooruitgang op het gebied van onderzoek op dit gebied versnellen. Hier presenteren we biochemische methoden voor het isoleren van de totale, detergensoplosbare en detergensbestendige fractie van IF-eiwitten uit 9 verschillende muisweefsels (hersenen, hart, long, lever, dunne darm, dikke darm, pancreas, nier en milt). We tonen verder een geoptimaliseerd protocol voor snelle isolatie van IF-eiwitten door gebruik te maken van lysende matrix en geautomatiseerde homogenisatie van verschillende muisweefsels. Het geautomatiseerde protocol is nuttig voor het profileren van IF's in experimenten met een hoog monstervolume (zoals bij ziektemodellen waarbij meerdere dieren en experimentele groepen betrokken zijn). De resulterende monsters kunnen worden gebruikt voor verschillende downstream analyses, met inbegrip van massaspectrometrie-gebaseerde PTM profilering. Met behulp van deze methoden geven wij nieuwe gegevens aan om te tonen dat IF-eiwitten in verschillende muizenweefsels (hersenen en leveren) parallelle veranderingen ondergaan met betrekking tot hun expressiesZioniveaus en PTM's tijdens veroudering.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IF's zijn een familie van eiwitten die bij mensen worden gecodeerd door 73 genen en zijn ingedeeld in zes hoofdvormen: typen I-IV zijn cytoplasmatisch ( bijv. Epitheliale en haarkeratinen (K), myocyt desmin, neurofilamenten, glialfibrillair zuur eiwit (GFAP), en anderen); Type V zijn de kernlamellen; En type VI zijn IF's in de ooglens 1 . In termen van hun moleculaire organisatie hebben IF-eiwitten drie gemeenschappelijke domeinen: een hoogwaardig geconsolideerd "spiraal" -domein, en bolvormige "hoofd- en" staartdomeinen. Als eiwittetrameren elkaar samenvoegen om korte filamentprecursoren te vormen, die uiteindelijk worden opgenomen in volwassen filamenten die dynamische cytoskeletale en nucleoskeletale structuren vormen die betrokken zijn bij mechanische bescherming 2 , stresswaarneming 3 , 4 , regulatie van transcriptie 5 en groei en andere kritische cellulaire functies"> 1 , 6 , 7 .

Het functionele belang van het IF-systeem wordt gemarkeerd door het bestaan ​​van vele menselijke ziekten veroorzaakt door missense-mutaties in IF-genen, waaronder neuropathieën, myopathieën, huidverstoringsstoornissen, metabolische disfuncties en vroegtijdige verouderende syndromen 8 . Sommige IF-genmutaties veroorzaken niet, maar veronderstellen hun dragers op ziekteprogressie, zoals de eenvoudige epitheliale keratinen bij de leverziekte 9 . Deze laatste is te danken aan de kritische stress-beschermende functies van IF's in epithelia. IF's in het algemeen behoren tot de meest voorkomende cellulaire eiwitten onder basale condities, maar worden verder sterk geïnduceerd tijdens verschillende soorten stress 10 . Bijvoorbeeld, recente studies die de eiwitbreedse veranderingen in de nematode C. elegans hebben aangetoond, aangetoond dat meerdere IF's sterk geherreguleerd en gevoelig zijn voor aggregatieAan tijdens organismeveroudering 11 , 12 . Aangezien het behoud van een juiste IF-structuur essentieel is voor cellulaire resistentie tegen verschillende vormen van stress 10 , kan IF aggregatie ook bijdragen aan de functionele daling tijdens veroudering. Echter, organismen op het niveau van studies die meerdere zoogdier IF-eiwitten onderzoeken over verschillende weefsels die stress ondervinden, ontbreken.

IF's zijn zeer dynamische structuren die zich aanpassen aan mobiele eisen. Keratinen ondergaan bijvoorbeeld een biosynthese-onafhankelijke cyclus tussen oplosbaar (niet-filamente) en onoplosbaar (filamentvormig) eiwitpool 13 . Bij normale fysiologische omstandigheden kan ongeveer 5% het totale K8 / K18-pool worden geëxtraheerd in detergentvrije buffer, in vergelijking met ongeveer 20% die kan worden opgelost in het nonionische wasmiddel Nonidet P-40, dat biochemisch vergelijkbaar is met Triton- X100 14 , 15 . Tijdens mitose is er een opmerkelijke toename van de oplosbaarheid van enkel-type epitheel K8 en K1814, die minder zichtbaar is in epidermale keratinen, maar meer duidelijk in vimentine en andere type III IF-eiwitten 15 , 16 . Oplosbaarheidseigenschappen van IF-eiwitten worden strikt gereguleerd door fosforylering, een sleutel post-translationele modificatie (PTM) voor filamentherrangschikking en oplosbaarheid 17 , 18 , 19 , 20 . De meeste IF's ondergaan uitgebreide regelgeving door een aantal PTM's op geconserveerde locaties, wat resulteert in functionele veranderingen 17 .

Het doel van deze methode is om onderzoekers te introduceren die nieuw zijn op het IF-gebied naar biochemische extractie en analytische methoden voor de studie van IF-eiwitten over meerdere muisweefsels. SpecifiekBondgenoot, concentreren we ons op isolatie van IF-eiwitten door gebruik te maken van een extractiemethode met hoge zout en beoordeling van veranderingen in PTM's via massaspectrometrie en door PTM-targetende antilichamen. Deze werkwijzen zijn gebaseerd op eerder gepubliceerde procedures 21, maar omvatten wijzigingen voor het extraheren van verschillende IF-eiwitsoorten om gemeenschappelijk mechanisme voor regulering over de IF-familie te ontdekken. Bijvoorbeeld reguleert K8-acetylering bij een specifiek lysine-residu filamentorganisatie, terwijl hyperacetylatie K8-onoplosbaarheid en aggregaatvorming 22 bevordert. Recent recente wereldwijde proteomische profileringsstudies hebben bovendien aangetoond dat de meeste weefselspecifieke IF-eiwitten ook doelstellingen voor acetylering zijn en dat de meeste IF-acetyleringsplaatsen beperkt zijn tot het sterk geconserveerde staafdomein. Dit wijst op de noodzaak van methoden die geschikt zijn voor wereldwijde profilering van het IF-systeem. We introduceren ook een snelle methode om IF-eiwitten van meerdere weefsels te isoleren met behulp van geautomatiseerde homogenisatie in optiGematiseerde lysingsmatrix. De resulterende preparaten zijn geschikt voor stroomafwaartse PTM analyse via massaspectrometrie en andere methoden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol is goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met het Institutioneel Diervoeder- en Gebruikskomitee (IACUC) aan de Universiteit van Noord-Carolina.

1. Voorbereidingen

  1. Bereid Triton-X buffer (1% Triton X-100, 5 mM ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA) op, haal volume op in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4). Om 500 ml te maken: roer 5 ml elk van Triton X-100 en 500 mM EDTA in 490 ml PBS, pH 7,4. Bewaar Triton-X buffer oplossing bij 4 ° C.
  2. Bereid een hoge zoutbuffer op (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 140 mM NaCl, 1,5 M KCl, 5 mM EDTA, 0,5% Triton X-100, haal volume in dubbel gedestilleerd (dd) H20) op. Om 500 ml te maken: roer 10 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 7,6), 14 ml 5 M NaCl, 55,9 g KCl, 5 ml 0,5 M EDTA en 2,5 ml Triton X-100, stel volume aan op 500 ML met dubbel gedistilleerd water). Bewaar de hoge zoutbufferoplossing bij 4 ° C.
  3. Net voor gebruik, vul een passende hoeveelheid Triton-X en High Salt Buffer ( Bijv. 1 ml voor elk 25 mg weefselmonster) met een protease- of protease- / fosfataseremmerscocktail en weggooien elke ongebruikte buffer die de remmers bevat.
  4. Bereid 5 mM EDTA in 1x PBS, pH 7,4. Om 500 ml te maken: roer 5 ml 0,5 M EDTA in 495 ml 1x PBS, pH 7,4.
  5. Isolatie van verschillende muisorganen (hersenen, hart, long, lever, pancreas, dikke darm, darm, nier, milt) met behulp van goedgekeurde protocollen die voldoen aan veterinaire richtlijnen en institutionele normen 23 . De weefselinzamelprocedure moet maximaal 5 minuten duren om RNA en eiwitintegriteit van protease-rijke weefsels te behouden ( bijv. Moet de eerste alvleesklier worden verwerkt).
  6. Knip een klein stukje weefsel (~ 5-20 mg) en plaats in RNA-opslagoplossing voor latere RNA-extractie, cDNA-synthese en kwantitatieve real-time PCR analyse voor IF-expressie. Plaats RNA-opslagoplossingsbuizen met weefsel bij 4 ° C overnacht en volg fabrikant protocol voor verdere sTorage en isolatie stappen.
  7. Snijd de rest van het weefsel in kleinere fragmenten ( bijv. 0,5 cm) en plaats in cryovial. Snap-freeze en houd flesjes op -80 ° C of vloeibaar stikstof voor langere opslag.

2. Als genexpressieanalyse

  1. Extract RNA uit weefsels bewaard in het RNA opslagoplossingsreagens. Gebruik een geschikte / geprefereerde RNA-extractie methode volgens het protocol van de fabrikant.
  2. Kwantificeer RNA concentratie en gebruik 2 μg RNA om cDNA te genereren met behulp van een geschikte reverse transcriptie kit volgens het protocol van de fabrikant.
  3. Met behulp van de gegenereerde cDNA en muis IF-gen-specifieke primers zetten qPCR reacties op, waaronder drie technische replicaten van elk monster, evenals blanco controle volgens het protocol van de fabrikant.
  4. Bepaal IF-genuitdrukking als vouwverandering, waarbij verschillende condities worden vergeleken ( bijv. Jong versus oud weefsel).

3. PReparatie van Total Tissue Lysates voor Immunoblot

  1. Homogeniseer 25 mg weefsel in 1 ml 2x niet-reducerende SDS monsterbuffer. Verwijder bromfenol blauwe kleurstof uit de monsterbuffer indien een colorimetrische eiwitassay moet worden uitgevoerd om eiwitconcentratie te kwantificeren.
  2. Voeg 5% (v / v) 2-mercaptoethanol (2-ME) toe om verminderde monsters te maken. Voeg 200 μL van de niet-reducerende monsters toe, voeg 10 μL 2-ME toe.
  3. Bepaal eiwitconcentratie met behulp van detergent- en reductiemiddel-compatibele eiwitanalyse. Als kleurstof al in de monsterbuffer is opgenomen, kan de eiwithoeveelheid geschat worden na het uitvoeren van een gel via een aantal technieken, waaronder Coomassie-gebaseerde vlek 24 .
  4. Vortex alle monsters en verhit bij 95 ° C gedurende 5 minuten.
  5. Voer westerse blotting uit onder zowel reducerende als niet-reducerende omstandigheden. Blootstelling membraan kort (<1 min) om monomere soorten te onthullen en langer (> 1 min) om complexen met hoge molecuulmassa te onthullen bevattenNg IF eiwitten. Controleer bij aggregatie aggregatie hele gel / membraan (inclusief de bodem van de gelputten).
  6. Doe een parallelle gel en vlek met een eiwitvlek als een laadbeheersing 24 . Bij ziektebeelden of letselonderzoeken moet totale eiwitvlek worden gebruikt als laadbeheersing, in tegenstelling tot immunoblots voor 'huishoudelijke' eiwitten ( bijv. Actine, GAPDH) omdat deze onder verschillende stressomstandigheden veranderen.

4. Bereiding van detergentoplosbare en hoogzoutextracten van weefselspecifieke IF's

  1. Voeg 1 ml ijskoude Triton X-100 buffer in een glazen buishomogenizer toe en plaats het op ijs.
  2. Verwijder een klein stukje weefsel (~ 25 mg) uit vloeibare stikstofopslag en plaats direct in de glazen homogenisator. Gebruik een polytetrafluorethyleenpestel om homogeniseren (50 slag) en vermijd bellen. Houd de homogenisator en koude koud te allen tijde.
  3. Breng lysaat over naar een 1,5 ml micrOcentrifuge-buis op ijs en centrifuge bij 20.000 xg gedurende 10 minuten in een voorgekoelde centrifuge (4 ° C).
  4. Verzamel de supernatantfractie in een aparte buis. Dit is de Triton X-oplosbare fractie, die kan worden gebruikt voor immunoprecipitatie (ip) en analyse van het detergensoplosbare pool van IF-eiwitten. Merk op dat stap 4.1-4.4 herhaald kan worden om een ​​reiniger IF-extract uit breinweefsel te bereiken.
  5. Voeg 1 ml High Salt Buffer toe aan het weefselpelletje, overbrengen naar een schone homogenisator en doei 100 strepen. Breng het homogenaat terug naar de microcentrifugebuis en plaats de buis gedurende 1 uur op een roterende shaker in de koude ruimte.
  6. Centrifugeer de homogenaten bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Gooi de supernatant weg.
  7. Voeg 1 ml ijskoude PBS / EDTA buffer aan de pellet toe en laat de pellet (20 slag) in een schone homogenisator homogeniseren als een laatste opruimingsstap *. Vervoer naar een nieuwe buis en centrifuge bij 20.000 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C om de IF-eiwit-Rijk hoog zoutextract (HSE).
    * Optioneel vortex in plaats van homogenisatie in deze stap.
  8. Verwijder de supernatant en ontbind de pellets in 300 μL niet-reducerende SDS monsterbuffer die vooraf verwarmd is. Breng de pellet aanvankelijk door pipettering en vortexing, en verhit daarna de monsters gedurende 5 minuten bij 95 ° C.
  9. Vortex en pipet als nodig om ervoor te zorgen dat de pellet is opgelost. Het kan enkele minuten duren om de pellets volledig op te lossen.
  10. Bewaar alle monsters bij -20 ° C tot analyse.

5. Geautomatiseerde Weefsel Lysis voor IF Proteïne Extractie in Experimenten met grote hoeveelheden

  1. Voor RNA-extractie, plaats lysisbuffer (600 μL buffer per 25 mg weefsel) in een buis die lyseringsmatrix D bevat (gebruikt kleine keramische bolle) en puls twee keer gedurende 25 s in de weefsellyser. Afzonderlijk lysaat uit de matrix door centrifugeren bij 20.000 xg en ga door naar de volgende stap in isolatie.
  2. Voor eiwit extractie, plaats TritOp X-100 (of SDS monsterbuffer bij het bereiden van totaal lysaat) in een lyserbuis met lysende matrix SS (gebruik een enkele roestvrijstalen kralen). Na het testen van meerdere matrices, werd dit geselecteerd omdat het IF-eiwit extracten produceert die in gelijke kwaliteit zijn als de traditionele dotsmethode. Merk op dat de geautomatiseerde methode niet optimaal is voor pancreas en milt, en het standaard homogenisatieprotocol dient voor deze weefsels te worden gebruikt.
  3. Om verder te gaan met de bereiding van High Salt Extract, verwijder de roestvrijstalen kralen uit de buis met een magneet en centrifugeer de buizen bij 20.000 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
  4. Ga verder met stap 4.4 (boven) van het handmatig protocol.
  5. Bewaar alle monsters bij -20 ° C tot analyse.

6. Immuno-verrijking van post-translationeel gemodificeerde IF-eiwitten

  1. Bereid PBST buffer (0,02% Tween-20 in PBS) op. Om 50 ml te maken, voeg 10 μL Tween-20 tot 50 ml PBS toe, pH 7,4.
  2. Bereid PTM antilichaam opOplossing (1-10 μg antilichaam in 200 μl PBST). In het algemeen is 3 μg antilichaam / reactie een goede startconditie die eventueel verder geoptimaliseerd kan worden.
  3. Voor elke reactie, plaats 50 μL magnetische kralen in een microcentrifugebuis, plaats op de magneet en aspireer de kraalopslagoplossing.
  4. Conjugate de kralen aan het immunoprecipitatie antilichaam door opnieuw suspensie in de antilichaamoplossing en incubatie op rotator (eind-over-end, om te zorgen voor het mengen van kleine volumes) bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
  5. Plaats de buizen op de magneet en haal de antilichaamoplossing aan.
  6. Spoel de antilichaam-geconjugeerde kralen eenmaal in 200 μl PBST en verwijder wasbuffer.
  7. Voeg 0,6-1 ml van het weefsellysaat toe aan de kralen, meng door zacht pipetten en incubeer gedurende 3 uur op de rotator in een koude kamer.
  8. Plaats buizen op de magneet, verwijder lysaat, en doe de kralen vijf keer met 200 μL PBST. Na de laatste wasstap verzamelen de kralen in 100 _6; L van PBS (geen Tween-20) en overbrengen naar een schone nieuwe buis. Plaats de buis op de magneet.
  9. Aspireren PBS en voeg 100 μL niet-reducerende monsterbuffer toe. Verwijder 50 μL en voeg 2-ME (5%) toe aan het reduceren van monsters. Verhit de monsters tot 95 ° C gedurende 5 minuten.
  10. Scheid de ip fractie van de kralen op de magneet en pak het in een nieuwe buis.
  11. Bewaar monsters bij -20 ° C tot analyse.

7. Bereiding van IF-eiwitmonsters voor massaspektrometrie-analyse

  1. Scheduleer een raadpleging met een proteomics expert voorafgaand aan het starten van een studie, aangezien er significante tijd en kosten betrokken zijn bij massaspectrometrie analyse.
  2. Neem speciale voorzorgsmaatregelen om besmetting te vermijden. Hanteer alle gels met schone handschoenen en incubeer in schone houders, alleen wassen met ddH 2O (vermijd zeep).
  3. Run 20-50 μL van het HSE-monster (uit secties 4 en 5) op een SDS-PAGE gel volgens de standaard omstandigheden.
  4. Vlek met een eiwitvlek gedurende 1 uur. Spoel meerdere keren af ​​en ontvlam overnacht in ddH 2 O. De IF-eiwitbanden moeten gemakkelijk na het ontkleuren zichtbaar zijn.
  5. Plaats de gel tussen de plastic beschermers, scan en markeer de bands die worden uitgesneden en verzonden voor analyse.
  6. Accijns de IF-eiwitbanden met behulp van een nieuwe schone scheermes.
  7. Plaats de gelbanden in schone microcentrifugebuizen en overbrengen naar een massaspectrometrie faciliteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een nieuwe snelle methode voor het op hoge zout gebaseerde extractie van IF-eiwitten uit meerdere muisweefsels met behulp van lyseringsmatrix.

De traditionele methode 25 , 26 van het isoleren van het grootste deel van de tussenliggende filament eiwitfractie uit epitheliaal weefsel werd hier gewijzigd om 9 verschil...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Methoden die biochemische karakterisering van IF-eiwitten mogelijk maken, kunnen nuttig zijn om talloze pathofysiologische verschijnselen in zoogdierstelsels te begrijpen, aangezien IF-eiwitten beide markers en modulatoren zijn van cellulair en weefselspanning 29 . Het principe achter de huidige methode is gebaseerd op de initiële procedures die in de jaren 1970 en 1980 zijn ontwikkeld om IF-eiwitten uit cellen en weefsels te isoleren, te scheiden en te reconstrueren, in het algemeen met lage en ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de NIH-subsidies NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] en P30 DK034987 [naar UNC-Chapel Hill]. De auteurs bedanken Deekshita Ramanarayanan voor hulp bij qPCR en western blot experimenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dynabeads Protein GThermoFisher Scientific10009immunoprecipitation beads
PBSThermoFisher Scientific10010049voor buffers
Purelink RNA mini kitThermoFisher Scientific12183018RNA extractie uit weefsel
Purelink DNAse setThermoFisher Scientific12185010ADNA-digestie op kolom
Dynamag-2ThermoFisher Scientific12321Dmagneet voor gebruik met Dynabeads
GelCode Blue Stain ReagentThermoFisher Scientific24592massaspectrometrie-compatibele gelkleurstof
Pierce ECL Western Blotting SubstrateThermoFisher Scientific32106voor gebruik in western blot
High Capacity cDNA reverse transcription kitThermoFisher Scientific4368813voor gebruik in genexpressieanalyse
Proflex 3 x 32-well PCR SystemThermoFisher Scientific4484073PCR-systeem
PVDF transfer membrane ThermoFisher Scientific88520voor western blot
Power Up SYBR master mixThermoFisher ScientificA25778voor qPCR-analyse
RNAlaterThermoFisher ScientificAM7020oplossing voor weefselopslag voorafgaand aan RNA-isolatie
Novex 4-20% Tris Glycine GelThermoFisher ScientificXP04205BOXVoorgevormd eiwitgel
Anti-Keratin 8 antibody (TS1)ThermoFisher ScientificMA514428voor western blot detectie van K8
Anti-VimentinThermoFisher ScientificMA511883voor western blot detectie van vimentin
Tris Glycine Transfer Buffer (25x)ThermoFisher ScientificLC3675voor natte overdracht van eiwitgels
2x SDS Sample BufferThermoFisher ScientificLC2676voor het bereiden van eiwitgel monsters
Tris Glycine SDS Running Buffer (10x)ThermoFisher ScientificLC26755voor het draaien van eiwitgels
Lysing beads - Matrix DMP Biomedicals116913100Lyse-kralen en matrixbuizen voor weefseldisruptie en RNA-extractie
Lysing beads - Matrix SSMP Biomedicals116921100Lyse-kralen en matrixbuizen voor weefseldisruptie en eiwitextractie
NanoDrop Lite SpectrophotometerThermoFisher ScientificND-LITEmeting van eiwit en nucleïnezuur
Precellys 24 homogenisatorBertin InstrumentsEQ03119Geautomatiseerde weefselhomogenisator

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eriksson, J. E., et al. Introducing intermediate filaments: from discovery to disease. J Clin Invest. 119 (7), 1763-1771 (2009).
  2. Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. J Biol Chem. 290 (28), 17145-17153 (2015).
  3. Perez-Sala, D., et al. Vimentin filament organization and stress sensing depend on its single cysteine residue and zinc binding. Nat Commun. 6, 7287(2015).
  4. Dialynas, G., et al. Myopathic lamin mutations cause reductive stress and activate the nrf2/keap-1 pathway. PLoS Genet. 11 (5), e1005231(2015).
  5. Hobbs, R. P., et al. Keratin-dependent regulation of Aire and gene expression in skin tumor keratinocytes. Nat Genet. , (2015).
  6. Chung, B. M., Rotty, J. D., Coulombe, P. A. Networking galore: intermediate filaments and cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 600-612 (2013).
  7. Gruenbaum, Y., Aebi, U. Intermediate filaments: a dynamic network that controls cell mechanics. F1000 Prime Rep. 6, (2014).
  8. Omary, M. B. "IF-pathies": a broad spectrum of intermediate filament-associated diseases. J Clin Invest. 119 (7), 1756-1762 (2009).
  9. Omary, M. B., Ku, N. O., Strnad, P., Hanada, S. Toward unraveling the complexity of simple epithelial keratins in human disease. J Clin Invest. 119 (7), 1794-1805 (2009).
  10. Toivola, D. M., Strnad, P., Habtezion, A., Omary, M. B. Intermediate filaments take the heat as stress proteins. Trends Cell Biol. 20 (2), 79-91 (2010).
  11. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging. C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
  12. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in. C. elegans. PLoS Biol. 8 (8), (2010).
  13. Windoffer, R., Beil, M., Magin, T. M., Leube, R. E. Cytoskeleton in motion: the dynamics of keratin intermediate filaments in epithelia. J Cell Biol. 194 (5), 669-678 (2011).
  14. Chou, C. F., Riopel, C. L., Rott, L. S., Omary, M. B. A significant soluble keratin fraction in 'simple' epithelial cells. Lack of an apparent phosphorylation and glycosylation role in keratin solubility. J Cell Sci. 105 ( Pt. 2, 433-444 (1993).
  15. Omary, M. B., Ku, N. O., Liao, J., Price, D. Keratin modifications and solubility properties in epithelial cells and in vitro). Subcell Biochem. 31, 105-140 (1998).
  16. Lowthert, L. A., Ku, N. O., Liao, J., Coulombe, P. A., Omary, M. B. Empigen BB: a useful detergent for solubilization and biochemical analysis of keratins. Biochem Biophys Res Commun. 206 (1), 370-379 (1995).
  17. Snider, N. T., Omary, M. B. Post-translational modifications of intermediate filament proteins: mechanisms and functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 163-177 (2014).
  18. Snider, N. T., Weerasinghe, S. V., Iniguez-Lluhi, J. A., Herrmann, H., Omary, M. B. Keratin hypersumoylation alters filament dynamics and is a marker for human liver disease and keratin mutation. J Biol Chem. 286 (3), 2273-2284 (2011).
  19. Eriksson, J. E., et al. Specific in vivo phosphorylation sites determine the assembly dynamics of vimentin intermediate filaments. J Cell Sci. 117 (Pt. 6, 919-932 (2004).
  20. Sahlgren, C. M., et al. Mitotic reorganization of the intermediate filament protein nestin involves phosphorylation by cdc2 kinase). J Biol Chem. 276 (19), 16456-16463 (2001).
  21. Snider, N. T., Omary, M. B. Assays for Posttranslational Modifications of Intermediate Filament Proteins. Methods Enzymol. 568, 113-138 (2016).
  22. Snider, N. T., et al. Glucose and SIRT2 reciprocally mediate the regulation of keratin 8 by lysine acetylation. J Cell Biol. 200 (3), 241-247 (2013).
  23. Danneman, P., Suckow, M. A., Brayton, C., Suckow, M. A. The laboratory mouse. , 2nd edn, CRC Press. (2013).
  24. Weiss, W., Weiland, F., Gorg, A. Protein detection and quantitation technologies for gel-based proteome analysis. Methods Mol Biol. 564, 59-82 (2009).
  25. Achtstaetter, T., Hatzfeld, M., Quinlan, R. A., Parmelee, D. C., Franke, W. W. Separation of cytokeratin polypeptides by gel electrophoretic and chromatographic techniques and their identification by immunoblotting. Methods Enzymol. 134, 355-371 (1986).
  26. Ku, N. O., et al. Studying simple epithelial keratins in cells and tissues. Methods Cell Biol. 78, 489-517 (2004).
  27. Julien, J. P., Mushynski, W. E. Multiple phosphorylation sites in mammalian neurofilament polypeptides. J Biol Chem. 257 (17), 10467-10470 (1982).
  28. Hubbard, B. D., Lazarides, E. Copurification of actin and desmin from chicken smooth muscle and their copolymerization in vitro to intermediate filaments. J Cell Biol. 80 (1), 166-182 (1979).
  29. Ku, N. O., Strnad, P., Bantel, H., Omary, M. B. Keratins: Biomarkers and modulators of apoptotic and necrotic cell death in the liver. Hepatology. 64 (3), 966-976 (2016).
  30. Huiatt, T. W., Robson, R. M., Arakawa, N., Stromer, M. H. Desmin from avian smooth muscle. Purification and partial characterization. J Biol Chem. 255 (14), 6981-6989 (1980).
  31. Zackroff, R. V., Goldman, R. D. In vitro assembly of intermediate filaments from baby hamster kidney (BHK-21) cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (12), 6226-6230 (1979).
  32. Franke, W. W., Schmid, E., Osborn, M., Weber, K. The intermediate-sized filaments in rat kangaroo PtK2 cells. II. Structure and composition of isolated filaments. Cytobiologie. 17 (2), 392-411 (1978).
  33. Small, J. V., Sobieszek, A. Studies on the function and composition of the 10-NM(100-A) filaments of vertebrate smooth muscle. J Cell Sci. 23, 243-268 (1977).
  34. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain. Purification and properties. Brain Res. 57 (2), 343-360 (1973).
  35. Steinert, P. M., Idler, W. W., Zimmerman, S. B. Self-assembly of bovine epidermal keratin filaments in vitro. J Mol Biol. 108 (3), 547-567 (1976).
  36. Goldman, R. D., Cleland, M. M., Murthy, S. N., Mahammad, S., Kuczmarski, E. R. Inroads into the structure and function of intermediate filament networks. J Struct Biol. 177 (1), 14-23 (2012).
  37. Oshima, R. G. Intermediate filaments: a historical perspective. Exp Cell Res. 313 (10), 1981-1994 (2007).
  38. Mashukova, A., Forteza, R., Salas, P. J. Functional Analysis of Keratin-Associated Proteins in Intestinal Epithelia: Heat-Shock Protein Chaperoning and Kinase Rescue. Methods Enzymol. 569, 139-154 (2016).
  39. Schinzel, R., Dillin, A. Endocrine aspects of organelle stress-cell non-autonomous signaling of mitochondria and the ER. Curr Opin Cell Biol. 33, 102-110 (2015).
  40. Taylor, R. C., Berendzen, K. M., Dillin, A. Systemic stress signalling: understanding the cell non-autonomous control of proteostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 211-217 (2014).
  41. Lemieux, G. A., et al. Kynurenic acid is a nutritional cue that enables behavioral plasticity. Cell. 160 (1-2), 119-131 (2015).
  42. Oosten-Hawle, P., Porter, R. S., Morimoto, R. I. Regulation of organismal proteostasis by transcellular chaperone signaling. Cell. 153 (6), 1366-1378 (2013).
  43. Ulgherait, M., Rana, A., Rera, M., Graniel, J., Walker, D. W. AMPK modulates tissue and organismal aging in a non-cell-autonomous manner. Cell Rep. 8 (6), 1767-1780 (2014).
  44. Aynardi, M. W., Steinert, P. M., Goldman, R. D. Human epithelial cell intermediate filaments: isolation, purification, and characterization. J Cell Biol. 98 (4), 1407-1421 (1984).
  45. Shea, J. M., et al. Purification of desmin from adult mammalian skeletal muscle. Biochem J. 195 (2), 345-356 (1981).
  46. Liao, J., Lowthert, L. A., Ghori, N., Omary, M. B. The 70-kDa heat shock proteins associate with glandular intermediate filaments in an ATP-dependent manner. J Biol Chem. 270 (2), 915-922 (1995).
  47. Liao, J., Omary, M. B. 14-3-3 proteins associate with phosphorylated simple epithelial keratins during cell cycle progression and act as a solubility cofactor. J Cell Biol. 133 (2), 345-357 (1996).
  48. Ku, N. O., Fu, H., Omary, M. B. Raf-1 activation disrupts its binding to keratins during cell stress. J Cell Biol. 166 (4), 479-485 (2004).
  49. Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. A comprehensive compilation of SUMO proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (9), 581-595 (2016).
  50. Agnetti, G., Lindsey, M. L., Foster, D. B. Manual of cardiovascular proteomics. , Springer. (2016).
  51. Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 536-550 (2014).
  52. Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Rep. 16 (9), 1071-1083 (2015).
  53. Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24 (5), 535-542 (2013).
  54. Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (6), 427-439 (2010).
  55. Creixell, P., Linding, R. Cells, shared memory and breaking the PTM code. Mol Syst Biol. 8, 598(2012).
  56. Minguez, P., et al. Deciphering a global network of functionally associated post-translational modifications. Mol Syst Biol. 8, (2012).
  57. Snider, N. T., Park, H., Omary, M. B. A conserved rod domain phosphotyrosine that is targeted by the phosphatase PTP1B promotes keratin 8 protein insolubility and filament organization. J Biol Chem. 288 (43), 31329-31337 (2013).
  58. Gorospe, J. R., et al. Molecular findings in symptomatic and pre-symptomatic Alexander disease patients. Neurology. 58 (10), 1494-1500 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Intermediate Filament ProteinsPost translational ModificationsMouse Tissue IsolationAging associated ChangesDetergent Soluble FractionHigh Salt ExtractionAutomated Tissue HomogenizationMass Spectrometry ProfilingImmunoprecipitation AssayWestern Blot Analysis

Gerelateerde artikelen