Breinmembraanfractie: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aanpak om de subsynaptische eiwit lokalisatie te beoordelen

Samenvatting

Hier presenteren wij een breukmembraan fractioneringsprotocol dat een robuuste procedure voor het isoleren van eiwitten uit verschillende synaptische compartimenten vertegenwoordigt.

Samenvatting

Het beoordelen van de synaptische eiwit samenstelling en functie vormt een belangrijke uitdaging in de neurowetenschappen. Het is echter niet makkelijk om neurotransmissie die binnen synapses optreedt te evalueren omdat het sterk gereguleerd wordt door dynamische eiwit-eiwit interacties en fosforylatie gebeurtenissen. Bijgevolg, wanneer een methode wordt gebruikt om synaptische transmissie te bestuderen, is een belangrijk doel om deze transiënte fysiologische veranderingen te behouden. Hier presenteren wij een breukmembraan fractioneringsprotocol dat een robuuste procedure voor het isoleren van eiwitten uit verschillende synaptische compartimenten vertegenwoordigt. Met andere woorden, het protocol beschrijft een biochemische methode om eiwitverrijking uit presynaptische, postsynaptische en extrasynaptische compartimenten uit te voeren. Ten eerste worden synaptosomen of synaptische terminals verkregen uit neuronen die alle synaptische compartimenten bevatten door middel van een discontinuous sucrose gradiënt. Van op de hoogte is de kwaliteit van deze initiële synaptische membraanbereiding critical. Vervolgens wordt de isolatie van de verschillende subsynaptische compartimenten bereikt met lichte solubilisatie onder gebruikmaking van milde detergentia bij verschillende pH-omstandigheden. Dit zorgt voor scheiding door gradiënt en isopycnische centrifugaties. Tenslotte wordt eiwitverrijking bij de verschillende subsynaptische compartimenten ( dat wil zeggen pre-, post- en extrasynaptische membraanfracties) gevalideerd door middel van immunoblot-analyse met behulp van goed gekenmerkte synaptische eiwitmarkers ( dwz SNAP-25, PSD-95 en synaptofysine, Respectievelijk), waardoor een directe beoordeling van de synaptische verdeling van een bepaald neuronal eiwit mogelijk wordt gemaakt.

Inleiding

Synaptische transmissie berust op de fysieke integriteit van de synaps, een concept dat al in 1897 door Foster and Sherrington ^{1 was} overwogen. Zo is het begrip van de verdeling van belangrijke neurotransmissiecomponenten (bijvoorbeeld ionkanalen, receptoren, enz. ) Essentieel om de synaptische functie te verklaren, zowel in normale als pathologische omstandigheden. Elektronenmicroscopie (EM) heeft enorm bijgedragen aan de huidige ultrastructurele opvatting van synaptes van het prototypische zenuwstelsel (CNS). Zo heeft EM de fijne verschillen tussen pre- en postsynaptische dichtheden goed bepaald, die gescheiden zijn door een spleet van een vrij gelijkmatige afstand (~ 25 nm) ² . Interessant genoeg toont het postsynaptische apparaat een relatief continue, elektrondichte verdikking onder het plasmamembraan, de zogenaamde postsynaptische dichtheid of PSD ² . Omgekeerd, bij de presynaptische inrichting, een opschriftablEen discontinue cytomatrix netwerk is net onder het plasmamembraan geregeld, wat essentieel is voor het uitlijnen en docking van synaptische blaasjes aan de actieve plasmazone 3 van het plasmamembraan. Daarom vormt EM de gouden experimentele aanpak om de verdeling van eiwitten in structurele bewaarde CNS-synaptes te onderzoeken. De informatie die door elektronenmicrofotografieën wordt verstrekt is echter statisch. Inderdaad, accumulerende bewijzen tonen aan dat in vivo synapses extreem dynamisch zijn, waardoor dramatische structurele veranderingen ondervinden bij aanhoudende synaptische transmissie. Daarnaast kan de morfologie en de samenstelling van synapsen veranderen in verschillende CNS-gebieden en op ontwikkeling, rijping, veroudering en de ontwikkeling van neuropathologische aandoeningen. Over het geheel genomen is een protocol gericht op het isoleren van eiwitten die behoren tot verschillende synaptische compartimenten in fysiologische omstandigheden een waardevol instrument voor een meer uitgebreide studie van synaptische werking.

Hier beschrijven we dit soort complementaire experimentele aanpak, die de voorbereidende biochemische verrijking van de verschillende synaptische membraancompartimenten mogelijk maakt, namelijk extra-, pre- en postsynaptische membraan domeinen. Deze membraan fractioneringswerkwijze, eerst beschreven door Philips et al . (2001) ⁴ , is gebaseerd op een pH-verschuiving die de adhesieve interacties die zich voordoen binnen de pre- en postsynaptische inrichting verzwakken. Ten eerste, door middel van milde schoonmaakmiddelen bij pH 6,0, is het mogelijk om de hechtingskoppeling te onderscheiden die het pre- en postsynaptische apparaat bevat en dat wordt gehandhaafd uit het extrasynaptische membraan domein, dat is opgelost en kan derhalve uit de synaptische contacten worden geëxtraheerd. Vervolgens verzwakt de pH van 6,0 tot 8,0 in aanwezigheid van milde detergentia de sterkte van de hechtingskoppeling die de presynaptische actieve zone strikt bindt aan de postsynaptische dichtheid. Vandaar dat het presynaptische compartiment zo isGesmoliseerd en kan worden gescheiden van de postsynaptische dichtheid, die voornamelijk wordt bewaard omdat de concentratie van het gebruikte detergent geen solubilisatie bevordert ⁴ . Interessant genoeg kan de fractioneringsefficiëntie, uiteindelijk hoger dan 90%, worden bevestigd door verschillende subsynaptische markers: i ) synaptosomaal geassocieerd eiwit 25 (SNAP-25), uit de presynaptische actieve zone; Ii ) synaptofysine, van de extrasynaptische fractie ( dwz buiten de actieve zone en met inbegrip van microsomen); En iii ) postsynaptische dichtheid eiwit 95 (PSD-95), uit de postsynaptische dichtheid. Met name is deze methode van breinmembraan fractionering succesvol gebruikt. Dienovereenkomstig is het mogelijk om de subsynaptische lokalisatie van verschillende receptoren nauwkeurig te bepalen, zoals alfa-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoolpropionzuur (AMPA) receptoren ⁵ , adenosine A1 receptor (A1R) ⁶ ,Adenosine A _2A receptor (A _2A R) ⁷ , adenosine trifosfaat (ATP) P2 receptoren ⁸ , nicotine acetylcholine receptor subunits ⁹ en Parkinson's geassocieerde receptor GPR37 ¹⁰ . Een aantal beperkingen kunnen echter de juiste beoordeling van de synaptische verdeling van een bepaald neuronale eiwit belemmeren. Dus in deze procedure beschrijven we niet alleen het gehele protocol, maar we beschrijven ook enkele kritische punten die overwogen moeten worden, zoals de vrij grote hoeveelheid weefsel nodig, de lage eiwitopbrengst en de verplichte eis om de efficiëntie van Elke scheiding voor het uitvoeren van het definitieve experiment.

Protocol

Alle dierproefprocedures werden goedgekeurd door het Comité voor diergeneeskunde en zorg van de Universiteit van Barcelona (CEEA), in overeenstemming met de richtlijnen beschreven in de Gids voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren ¹¹ en na de Europese Gemeenschap, wet 86/609 / CCE, FELASA en ARRIVE richtlijnen. Zo worden muizen gehuisvest in standaardkooien, met ad libitum toegang tot voedsel en water, en worden onder gecontroleerde standaardomstandigheden gehandhaafd (12 uur donker / licht cyclus vanaf 7:30, 22 ° C en 66% vochtigheid).

1. Verkrijgen van Synaptosomen van de Muishersenen met behulp van een Discontinuous Sucrose Gradient

Opmerking: deze methode is eerder gemeld ¹⁰ .

1. Bereid verse isolatiebuffer (IB) op, pH 7,4; 2 M sucrose; 1 M sucrose / 0,1 mM CaCl2; En 0,1 mM CaCl2 (zie tabel 1 ). Chill de oplossingen op ijs.
2. SaSnijd vijf muizen door cervicale dislocatie. Dekapiteer en verwijder snel de hersenen van elk dier. Dissecteer het hersengebied van belang (dat wil zeggen de hippocampus, 0,25-0,35 g vers weefsel) en plaats het in een 5 ml Potter-Elvehjem glazen buis op ijs met 1 ml IB.
3. Homogeniseer het weefsel met behulp van een homogeniserende roerder (10 slagingen bij 700-900 rotaties per minuut), bij voorkeur in een ijsbad om het opwarmen van het monster te voorkomen.
4. Plaats het gehomogeniseerde weefsel (1 ml) in een 15 ml buis die 6 ml 2 M sucrose en 2,5 ml 0,1 mM CaCl2 bij 4 ° C bevat. Meng langzaam door de buis om te keren.
   Opmerking: De toevoeging van calcium is essentieel voor het handhaven van de lijminteracties tussen organellen en derhalve om de structuur van de verschillende "dichtheden" te behouden.
5. Plaats de oplossing in een 12 ml centrifugebuis en voeg langzaam 2,5 ml 1 M sucrose / 0,1 mM CaCl2 bovenop elke buis toe om de sucrosegradiënt te vormen.
   Opmerking: label de positie oF de gradiëntinterface op de centrifugebuis met behulp van een permanente marker.
6. Weeg en evenwicht de centrifugebuizen met IB-oplossing in hun bijbehorende stalen steunen en met hun afsluitkleppen.
7. Centrifugeer de buizen gedurende 3 uur bij 100.000 x g en 4 ° C met behulp van een roterende centrifuge Vul de rotor volledig met alle stalen steunen (zelfs leeg, indien nodig).
8. Verwijder de bovenste laag die myeline bevat. Met een Pasteurpipet verzamelt u de witte ring tussen de 1.25-M en 1-M sucrose interfase die overeenstemt met de synaptosome fractie.
9. Verdun de synaptosomen met 9X hun volume met behulp van IB in een centrifugebuis.
10. Weeg en evenwicht de centrifugebuizen met IB-oplossing in hun bijbehorende stalen steunen en met hun afsluitkleppen.
11. Centrifugeer de buizen gedurende 30 minuten bij 15.000 x g en 4 ° C met behulp van een roterende centrifuge
12. Gooi de supernatant weg en verwijder de thE pellet met 1,1 ml IB oplossing. Verzamel 100 μL van deze synaptosomale oplossing en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 11.000 x g en 4 ºC.
13. Resuspendeer de synaptosomale pellet in 5% natriumdodecylsulfaat (SDS) en sla dit monster op -20 ºC op.
    Opmerking: dit monster komt overeen met de totale synaptosome fractie voor verdere Western-blot analyse. De resterende synaptosomale fractie (~ 1 ml) kan ofwel bij -20 ºC worden bevroren tot gebruik of verwerkt voor de daaropvolgende subsynaptische fractionering. De synaptosomen of gezuiverde synapsen vertegenwoordigen tussen 1 en 2% van het totale hippocampale volume ¹² .

2. Pre-, post- en extrasynaptische isolatie

1. Bereid 2x verse solubilisatiebuffer, pH 6,0; 1x solubiliseringsbuffer, pH 6,0; Oplosbare buffer, pH 8,0; En 0,1 mM CaCl2 (zie tabel 1 ). Chill de oplossingen op ijs.
   Opmerking: de pH van deze oplossingen moet nauwkeurig zijnY aangepast om een ​​goede subsynaptische fractionering te bereiken.
2. Verdun de 1 ml geresuspendeerde synaptosomale fractie langzaam (zie stap 1.12) met 5 ml 0,1 mM CaCl2.
3. Voeg hetzelfde volume (5 ml) ijskoude 2x solubiliseringsbuffer, pH 6,0 toe, en incubeer gedurende 50 minuten op ijs onder hoge roering in een beker op ijs.
   Opmerking: Terwijl 1% Triton X-100 bij pH 6,0 alle plasmamembraanproteïnen solubiliseert, behoudt het eiwitten in de synaptische contacten of kruispunten ( dwz pre- en postsynaptische structuren) ⁴ .
4. Plaats de oplossing in een centrifugebuis. Weeg en evenwicht de buizen met equivalente volumes van 0,1 mM CaCl2 en 2x oplosbare bufferoplossing, pH 6,0, in hun overeenkomstige stalen steunen en met hun afsluitlokken.
5. Centrifugeer de buizen gedurende 30 minuten bij 40.000 x g en 4 ° C met behulp van een roterende centrifuge Het resulterende supernatant vertegenwoordigt de extrasynaptische fractie,En de pellet komt overeen met de synaptische kruispunten ( dwz pre- en postsynaptische fracties).
6. Concentreer het supernatant dat de extrasynaptische fractie bevat tot een eindvolume van 200 μl onder gebruikmaking van een 15 ml 10K filterbuis gecentrifugeerd bij 4.000 xg en 4 ºC.
7. Precipiteer de resulterende geconcentreerde extrasynaptische fractie (200 μl) met 5 volumes (1 ml) vooraf gekoelde (-20 ° C) aceton gedurende de nacht bij -20 ° C.
8. De volgende dag centrifugeer de extrasynaptische fractie gedurende 30 minuten bij 18.000 x g en -15 ° C. Verwijder na het centrifugeren het aceton supernatant en droog de pellet om enig spoor van aceton te verwijderen.
9. Tenslotte resuspendeer de pellet die de extrasynaptische eiwitten bevat met 200 μl 5% SDS. Soniculeer de pellet, indien nodig.
10. Zonder het te storen, was de pellet zorgvuldig met de pre- en postsynaptische fracties met 2 ml 1x solubiliseringsbuffer, pH 6,0. Wis de buffer uit.
11. ResuspendeerDe pellet met 10 ml 1x solubiliseringsbuffer, pH 8,0, onder gebruikmaking van een glaspasteurpipet.
    Opmerking: Terwijl 1% Triton X-100 bij pH 8,0 de preynaptische specialisatie solubiliseert, behoudt het de onoplosbare postsynaptische dichtheid ⁴ .
12. Incubeer de suspensie gedurende 50 minuten op ijs onder hoge agitatie in een beker op ijs.
13. Plaats de oplossing in een centrifugebuis. Weeg en evenwicht de buizen met 1x oplosbare bufferoplossing, pH 8,0, in hun bijbehorende stalen steunen en met hun afsluitkleppen.
14. Centrifugeer de buizen gedurende 30 minuten bij 40.000 x g en 4 ° C met behulp van een roterende centrifuge Het resulterende supernatant komt overeen met de presynaptische fractie en de pellet naar de postsynaptische fractie.
15. Verwerk de supernatant die de presynaptische fractie bevat, zoals beschreven in stappen 2.6-2.9.
16. Resuspendeer de pelletsbevattende postsynaptische fractie met 200 μl 5% SDS. Soniculeer de pellet, iF vereist.

3. Analyseer de monsters door immunoblot om de membraanfractie te valideren

1. Bepaal de hoeveelheid eiwit in elke fractie ( dwz de totale, extra-, pre- en postsynaptische fracties) met behulp van de bicinchoninezuur eiwit analyse.
2. Neem 20 μg eiwit uit elke fractie en verdun het tot een eindvolume van 50 μl in SDS-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) monsterbuffer. Kook gedurende 5 minuten bij 100 ºC.
3. De eiwitten scheiden met SDS-PAGE elektroforese 10%, met een 4% concentratie gel onder verminderende omstandigheden. Elektroforese bij constante spanning van 80 V tot de kleurstof de onderste gel binnentreedt en dan de spanning verhogen tot 120 V.
4. Breng de eiwitten over op een PVDF membraan en blokkeer met IB blokkeringsoplossing gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur onder continu schudden.
5. Incubeer het membraan 's nachts bij 4 ºC met het aangegeven primaire antilichaam ( dat wil zeggen anti-SNAP-25,Anti-PSD-95, anti-synaptofysine of anti-GPR37) verdund in IB blokkerende oplossing onder continue schudding.
6. Was het membraan drie maal (10 min elk) met IB wasoplossing om ongebonden primair antilichaam te elimineren.
7. Incubeer met het aangegeven secundaire antilichaam gedurende 90 minuten bij donkere omstandigheden bij kamertemperatuur onder continu schudden.
8. Was het membraan driemaal (10 min elk) met IB wasoplossing om ongebonden secundair antilichaam te elimineren.
9. Incubeer het membraan met chemiluminescerend substraat (bereiding van de mix onder donkere omstandigheden en volg de verhouding 1: 1 van de oplossing A en B door de fabrikant).
10. Analyseer het membraan in een chemiluminescerende detectie-inrichting.

Resultaten

De beschreven methodologie is grotendeels gebruikt voor de subsynaptische analyse van neuronale eiwitten in het algemeen en voor de isolatie en biochemische karakterisering van synaptische receptoren ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9} in het bijzonder. Interessant genoeg toont het hier weergegeven representatieve resultaat de bruikbaarheid van...

Discussie

Het hier gepresenteerde protocol vormt een krachtig biochemisch hulpmiddel voor de studie van de subsynaptische verdeling van specifieke eiwitten binnen elke hersenregio. Er zijn echter enkele nadelen die inherent zijn aan de techniek en die hier benadrukt moeten worden. Bijvoorbeeld, een van de belangrijkste beperkingen is de relatief grote hoeveelheid weefsel die nodig is om een redelijke hoeveelheid eiwit te zuiveren om de immunoblot-analyse van alle subsynaptische fracties uit te voeren. Dit probleem kan samenhangen ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Sucrose	Pancreac Química SL, Barcelona, Spanje	1.316.211.211
CaCl2	Pancreac Química SL, Barcelona, Spanje	2.112.211.210
MgCl2·6H2O	Pancreac Química SL, Barcelona, Spanje	1.313.961.210
Protease inhibitor cocktail Set III	Millipore, Darmstadt, Duitsland	535140
Trizma Base	Sigma, St. Louis, MO, VS	T1503
Tris-HCl	Pancreac Química SL, Barcelona, Spanje	1.236.541.209
Triton X-100	Sigma, St. Louis, MO, VS	X100
SDS	Sigma, St. Louis, MO, VS	L3771
Glycerol	Sigma, St. Louis, MO, VS	G5516
Bromofenol Blauw	Pancreac Química SL, Barcelona, Spanje	1.311.651.604
Dithiothreitol	Sigma, St. Louis, MO, VS	D0632
Tween 20	Sigma, St. Louis, MO, VS	P2287
Vetvrije droge melk
NaCl	Pancreac Química SL, Barcelona, Spanje	1.216.591.211
KCl	Pancreac Química SL, Barcelona, Spanje	1.314.941.210
KH2PO4	Merck	4873
Na2HPO4	Pancreac Química SL, Barcelona, Spanje	1.316.781.211
Basic 20 pH	Crison, Alella, Spanje
Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer	VWR, Radnor, PA, VS
Ultra-Clear Tubes (14x89mm)	Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona	344059	Buizen moeten bijna volledig worden gevuld om ineenstorting door ultracentrifugering te voorkomen.
Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K	Merck Millipore, Darmstadt, Duitsland	UFC901008
Centrifuge 5430R	Eppendorf, Hamburg, Duitsland
Optima L-90K Ultracentrifuge	Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona
Sonifier 250	Branson, Danbury, Connecticut
Amersham Imager 600	GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spanje
Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm	VWR, Radnor, PA, VS	612-1702
Compact Balance EK-610	A&D, Tokyo, Japan
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	Pierce Biotechnology, Rockford, IL, VS
SuperSignal west pico chemiluminescent substrate	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, VS
GR 200 Precision Balance	A&D, Tokyo, Japan
Anti-GPR37	Huisgemaakte antilichaam anti-GPR37 geproduceerd en gevalideerd in Francisco Ciruela Laboratorium.		Primaire antilichamen gebruikt bij een uiteindelijke concentratie van 0,250 μg/mL
Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin	Abcam, Cambridge, Verenigd Koninkrijk		Primaire antilichamen verdund 1:10.000
HRP-geconjugeerd geitenanti-muis IgG	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS.		Secundaire antilichamen verdund 1:10.000
HRP-geconjugeerd geitenanti-konijn IgG	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS.		Secundaire antilichamen verdund 1:30.000