Hele-cel patch-klem opnames van geïsoleerde primaire epitheliale cellen uit de epididymis

Summary

Wij presenteren een protocol dat celisolatie en volledige cilinder patch-clamp opname combineert om de elektrische eigenschappen van de primaire gedissocieerde epitheelcellen van de rat cauda epididymiden te meten. Dit protocol maakt het mogelijk om de functionele eigenschappen van primaire epididymale epitheelcellen te onderzoeken om de fysiologische rol van de epididymis verder te verduidelijken.

Abstract

De epididymis is een essentieel orgaan voor de rijping van volwassenen en de voortplantingsgezondheid. Het epididymale epithelium bestaat uit ingewikkeld verbonden celtypen die niet alleen verschillen in moleculaire en morfologische eigenschappen maar ook in fysiologische eigenschappen. Deze verschillen weerspiegelen hun uiteenlopende functies, die samen de noodzakelijke micro-omgeving opbouwen voor de ontwikkeling van post-testiculaire sperma in het epididymale lumen. Het begrip van de biofysische eigenschappen van de epididymale epitheelcellen is cruciaal voor het onthullen van hun functies in sperma en voortplantingsgezondheid, zowel onder fysiologische als pathofysiologische omstandigheden. Hoewel hun functionele eigenschappen nog niet volledig moeten worden opgemerkt, kunnen de epididymale epitheliale cellen worden bestudeerd met behulp van de patch-clamp techniek, een hulpmiddel voor het meten van de cellulaire gebeurtenissen en de membraan eigenschappen van enkele cellen. Hier beschrijven we de methoden van celisolatie en full-cell patch-clamp opname naar meaZeker de elektrische eigenschappen van primaire gedissocieerde epitheliale cellen uit de rat cauda epididymiden.

Introduction

De epididymis in het mannelijke voortplantingsstelsel is een orgaan gevoerd met een laag mosaïcepitheelcellen. Zoals bij andere epitheliale weefsels werken de verschillende celtypes van het epididymale epithelium, inclusief hoofdcellen, duidelijke cellen, basale cellen en cellen uit de immunologische en lymfatische systemen, op een gecoördineerde manier om de barrière aan de voorkant van de buis te functioneren en als Ondersteunende cellen voor sperma rijping en fysiologie ^{1 , 2 , 3} . Zo spelen deze epitheelcellen een essentiële rol in de reproductieve gezondheid.

Protocol

Alle dierproeven worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee van de ShanghaiTech University, die voldoen aan de lokale en internationale eisen.

1. Experimentele dieren

1. Gebruik volwassen mannelijke Sprague-Dawley ratten (~ 300-450 g) tussen 8-12 weken oud. Op deze leeftijd in de ratten zijn de sperma in de cauda-epididymiden aangekomen.

2. Isolatie van epitheliale cellen uit Rat Cauda Epididymiden

OPMERKING: De volgende stappen worden uitgevoerd onder niet-aseptische omstandigheden, tenzij anders vermeld.....

Results

De beschreven enzymatische spijsvertering procedure voor de isolatie van epitheliale cellen uit de rat cauda epididymiden is een gemodificeerd protocol uit onze eerdere studies ^{9 , 12} . Deze methode produceert een mengsel van enkelvoudige cellen met meer dan 90% levensvatbaarheid en zonder oppervlakte blaren of gezwollen celvolume. Het heterogene celmengsel bestaat voornamelijk uit hoofdcellen, duidelijke cellen en basale cellen,.......

Discussion

In dit protocol leverde de enzymatische dispersie van de rat-cauda-epididymiden consistente gezonde epitheelcellen. De kwaliteit van de epididymale epitheelcellen voor de patch-clamp experimenten is afhankelijk van een paar kritieke stappen in het protocol. Bijvoorbeeld, de centrifugatie van het celmengsel bij een lage centrifugale kracht (30 xg) is belangrijk voor het verwijderen van de spermatozoa en het epididymale luminale gehalte; De epididymale epitheelcellen worden ongezond in aanwezigheid van de spermatozoa in d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument of AXON system
Computer controlled amplifier	Molecular Devices - Axon	Multiclamp 700B patch-clamp amplifier
Digital Acquisition system	Molecular Devices - Axon	Digidata 1550 converter
Microscope	Olympus	BX-61WI
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Recording chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-324C
Instrument of HEKA system
Patch Clamp amplifier	Harvard Bioscience - HEKA	EPC-10 USB double
Microscope	Olympus	IX73
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Recording chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-324C
Other Instrument
Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-1000
Recording Chamber	Warner Instruments	RC-26G or homemade chamber
Borosilicate capillary glass with filament	Sutter Instrument / Harvard Apparatus	BF150-86-10
Vibration isolation table	TMC	63544
Digital Camare	HAMAMASTU	ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
Reagents for isolation
RPMI 1640 medium	Gibco	22400089
Penicillin/Streptomycin	Gibca	15140112
IMDM	ATCC	30-2005
IMDM	Gibco	C12440500BT
Collagenase I	Sigma	C0130
Collagenase II	Sigma	C6885
5-α-dihydrotestosterone	Medchemexpress	HY-A0120
Fetal bovine serum	capricorn	FBS-12A
Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mM	Sigma/various	V900068
MgCl2 · 6H2O, 2mM	Sigma/various	M2393
EGTA, 0.1mM	Sigma/various	E4378
HEPES, 10mM	Sigma/various	V900477
K-gluconate, 100mM	Sigma/various	P-1847
Mg-ATP, 3mM	Sigma/Various	A9187
The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM	Sigma/various	V900058
KCl, 4.7mM	Sigma/various	V900068
CaCl2, 2.5mM	Sigma/various	V900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mM	Sigma/various	M2393
NaH2PO4, 1.2mM	Sigma/various	V900060
HEPES, 10mM	Sigma/various	V900477
Glucose, 10mM	Sigma/various	V900392
For pH adjustment
NaOH	Sigma/various	V900797	Purity >=97%
KOH	Sigma/various	60371	Purity >=99.99%