Hele-cel patch-klem opnames van geïsoleerde primaire epitheliale cellen uit de epididymis

Samenvatting

Wij presenteren een protocol dat celisolatie en volledige cilinder patch-clamp opname combineert om de elektrische eigenschappen van de primaire gedissocieerde epitheelcellen van de rat cauda epididymiden te meten. Dit protocol maakt het mogelijk om de functionele eigenschappen van primaire epididymale epitheelcellen te onderzoeken om de fysiologische rol van de epididymis verder te verduidelijken.

Samenvatting

De epididymis is een essentieel orgaan voor de rijping van volwassenen en de voortplantingsgezondheid. Het epididymale epithelium bestaat uit ingewikkeld verbonden celtypen die niet alleen verschillen in moleculaire en morfologische eigenschappen maar ook in fysiologische eigenschappen. Deze verschillen weerspiegelen hun uiteenlopende functies, die samen de noodzakelijke micro-omgeving opbouwen voor de ontwikkeling van post-testiculaire sperma in het epididymale lumen. Het begrip van de biofysische eigenschappen van de epididymale epitheelcellen is cruciaal voor het onthullen van hun functies in sperma en voortplantingsgezondheid, zowel onder fysiologische als pathofysiologische omstandigheden. Hoewel hun functionele eigenschappen nog niet volledig moeten worden opgemerkt, kunnen de epididymale epitheliale cellen worden bestudeerd met behulp van de patch-clamp techniek, een hulpmiddel voor het meten van de cellulaire gebeurtenissen en de membraan eigenschappen van enkele cellen. Hier beschrijven we de methoden van celisolatie en full-cell patch-clamp opname naar meaZeker de elektrische eigenschappen van primaire gedissocieerde epitheliale cellen uit de rat cauda epididymiden.

Inleiding

De epididymis in het mannelijke voortplantingsstelsel is een orgaan gevoerd met een laag mosaïcepitheelcellen. Zoals bij andere epitheliale weefsels werken de verschillende celtypes van het epididymale epithelium, inclusief hoofdcellen, duidelijke cellen, basale cellen en cellen uit de immunologische en lymfatische systemen, op een gecoördineerde manier om de barrière aan de voorkant van de buis te functioneren en als Ondersteunende cellen voor sperma rijping en fysiologie ^{1 , 2 , 3} . Zo spelen deze epitheelcellen een essentiële rol in de reproductieve gezondheid.

Epitheliale cellen worden in het algemeen beschouwd als niet-excitabele cellen die niet in staat zijn om alle of geen actiepotenties te genereren in reactie op depolariserende stimuli, door gebrek aan spanningsgated Na ⁺ of Ca ²⁺ kanalen ^{4 , 5} . Echter, epitheelcellen drukken uni uitQue sets van ionkanalen en transporteurs die hun gespecialiseerde fysiologische rollen regelen, zoals secretie- en voedingsvervoer ⁶ . Verschillende epitheelcellen beschikken over karakteristieke elektrische eigenschappen. De hoofdcellen drukken bijvoorbeeld de CFTR uit voor vloeistof- en chloridevervoer en expressie de TRPV6 voor calciumreabsorptie, terwijl de duidelijke cellen de protonpomp V-ATPase uitdrukken voor luminale verzuring ^{1 , 7 , 8 , 9} . Sommige transporters en ionenkanalen die de fysiologische eigenschappen van de epididymale epitheelcellen regelen, zijn gemeld, maar de functionele eigenschappen van epididymale epitheelcellen zijn grotendeels nog niet begrepen ^{10 , 11 , 12 , 13} .

WhOle-cel patch-klem opname is een goed gevestigde techniek om de intrinsieke eigenschappen van beide excitabele en niet-excitabele cellen te onderzoeken en is bijzonder nuttig voor het bestuderen van de functies van hoofdzakelijk gedissocieerde cellen in heterogene celmonsters; De spanningsclamp wordt gebruikt voor het meten van de passieve membraan eigenschappen en de ionische stromen van enkele cellen ^{14 , 15} . De passieve membraan eigenschappen omvatten input weerstand en capaciteit. De voormalige parameter geeft de intrinsieke membraanconductie aan, terwijl de laatste het oppervlak van het celmembraan impliceert (een fosfolipide bilayer, waar ionkanalen en transporteurs zich bevinden, die dienen als een dunne isolator die extracellulaire en intracellulaire media scheidt). De membraancapaciteit is direct evenredig aan het oppervlak van het celmembraan. Samen met de membraanweerstand die wordt weerspiegeld door de invoerweerstand, is de membraan tijdconstante, wWat aangeeft hoe snel het celmembraanpotentieel reageert op de stroom van ionenkanaalstromen, kan worden bepaald. In dit verband wordt door de combinatie van de huidige responseigenschappen van een reeks spanningstappen toegepast op de cellen, de biofysische kinetiek en eigenschappen van de cellen bepaald ^{15 , 16 , 17 , 18} .

In het onderhavige document beschrijven we de procedures voor het isoleren van epitheliale cellen uit de rat cauda epididymis en de stappen voor het meten van de membraan eigenschappen van verschillende celletypes in het gedissocieerde celmengsel met behulp van de gehele cel patch-klem. We tonen aan dat de epididymale hoofdcellen verschillende membraanelektrophysiologische eigenschappen vertonen en dat de geleiders gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd uit andere celsoorten.

Protocol

Alle dierproeven worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee van de ShanghaiTech University, die voldoen aan de lokale en internationale eisen.

1. Experimentele dieren

1. Gebruik volwassen mannelijke Sprague-Dawley ratten (~ 300-450 g) tussen 8-12 weken oud. Op deze leeftijd in de ratten zijn de sperma in de cauda-epididymiden aangekomen.

2. Isolatie van epitheliale cellen uit Rat Cauda Epididymiden

OPMERKING: De volgende stappen worden uitgevoerd onder niet-aseptische omstandigheden, tenzij anders vermeld.

1. Voorbereiding van dissectie instrumenten en reagentia
   1. Desinfecteer de dissectie gereedschappen door onderdompeling in 70% ethanol en laat ze lucht drogen.
   2. Zet het verwarmingsbad (32 ° C) aan; Bereid en pre-warm 500 ml 1x Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI) aangevuld met 1% (v / v) antibioTics (100 U / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycin-eind) en gemerkt als "RPMI (+ P / S 1: 100)". Voer deze stap uit in een schoon luchtgestuurd werkstation.
   3. Bereid en pre-warm 1 x 500 ml Medium van het Iscove's Modified Dulbecco (IMDM) dat niet essentiële aminozuren bevat (0,1 mM) en natriumpyruvaat (1 mM) en aangevuld met 5-a-dihydrotestosteron (1 nM), 10% foetale runder Serum, 1% (v / v) antibiotica (100 U / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine-eind) en gemerkt als "Full-IMDM". Maak 50 ml porties en zegel met parafilm; Opslaan bij 4 ° C. Gebruik aseptische omstandigheden.
   4. Bereid een collageenzympresentieoplossing op door collagenase type I en collagenase type II op te lossen in RPMI (+ P / S 1: 100), wat resulteert in 1 mg / ml van elk collagenase in de oplossing. Filter door een 0,22 μm membraan en markeer als "Collagenase Solution". Houd bij kamertemperatuur (RT) tot gebruik. Pas het volume van de enzymoplossing opOp het gewicht van het enzym; Het minimale volume dat nodig is voor beide cauda-epididymiden van een enkele rat is 2 ml.
   5. Vul een 35 mm schotel met RPMI (+ P / S 1: 100).
2. Dissectie van rat cauda epididymiden
   1. Het dier opofferen door het gebruik van natriumpentobarbital 85 mg / kg ip of het gebruik van een isofluranekamer tot het dier niet reageert op staartknijpende stimulatie; Volg door cervicale dislocatie.
   2. De onderbuik desinfecteren door 70% ethanol te wrijven, duw de twee testes voorzichtig naar de onderbuik en open vervolgens de onderbuik bij het scrotum.
   3. Pak het epididymale vet op, ontleed de hele voortplantingsorganen (testes, epididymiden en vasdeferens) en doei met RPMI (+ P / S 1: 100) in de schotel.
   4. Breng de voortplantingsorganen in de schotel met RPMI (+ P / S 1: 100) naar een aseptisch werkstation.
   5. Ontleed de cauda epididymiden uit de bindweefsels en vetweefsels en de epiDidymale capsule. Plaats één epididymis met ~ 0,2 ml Collagenase Oplossing in een 1,5 ml buis.Performeer deze stap in een schoon luchtstroom besturingsstation.
3. Dissociatie van enkele cellen uit rat cauda epididymiden
   1. Snijd de epididymiden in de Collagenase Oplossing door middel van fijne scharen totdat het weefsel een pastaachtige vloeistof wordt. Spoel de schaar voorzichtig met de rest van (~ 0,8 ml) enzymoplossing in de 1,5 ml buis.
   2. Plaats de buis op een metalen thermomixer gedurende 30 minuten bij 37 ° C met een schudspoed van 1.000 rpm.
   3. Centrifugeer het enzym-weefsel mengsel bij 30 xg bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten en dek de kleverige supernatant die meestal het sperma bevat.
   4. Resulteer de pellet in 1 ml Full-IMDM om alle enzymatische activiteit uit te schakelen. Breng de cel suspensie over naar een 50 ml buis die 49 ml RPMI (+ P / S 1: 100) bevat.
      OPMERKING: Filter de celvering eventueel door een 100 μm maas membraan met constante trituratIon om grote, celaggregaten te vermijden. Gebruik echter geen maasfilter als celvering nodig is voor het groeien van celmonolagen.
   5. Centrifugeer het cellulaire mengsel bij 30 xg bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten; Dekant de supernatant af.
   6. Resulteer de pellet in 1 ml Full IMDM met zachte trituratie gedurende tenminste 5 minuten om enkele cellen van de enzymatische behandelde epididymale weefselmengsels te dissociëren.
4. Separatie van epitheliale cellen uit andere cellen onder aseptische omstandigheden
   1. Kweek de celsuspensie op een 10 cm petrischaal met grote IMDM gedurende ten minste 8 uur of overnacht in een incubator bij 32 ° C in 5% _CO2.
   2. Prepareer steriele deklips vooraf door onderdompeling in 100% alcohol. Luchtdroog en doop in een klein volume van het kweekmedium. Plaats de dekglazen in 6 cm kweekschotels of in enkele putjes van een 24-putjesplaat.
   3. De volgende ochtend, oogst de gedissocieerde epitheliale cellen door de cell suspen zachtjes te verzamelenZion uit de Petri schotel, die hoofdzakelijk bestaat uit epitheliale cellen. Centrifugeer de cel suspensie bij 30 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en dek het supernatant vervolgens af.
   4. Resuspendeer de celpellet in ~ 2 ml Full-IMDM.
   5. Zaai 0,2 ml van de geoogste cel suspensie in het midden van elke steriele deklaag.
   6. Laat de celsuspensie gedurende tenminste 10 minuten in de vloeibare druppel vestigen om de cellen los te houden aan de glazen deklagen. Voeg 1 ml Full-IMDM voorzichtig toe aan de rand van 10 cm schotel of 0,3 mL Full IMDM aan elke put van een 24-putjes plaat; Versteur de cellen niet.
   7. Houd de geïsoleerde enkele cellen op de deklips in de incubator bij 32 ° C in 5% CO ₂ totdat de patch-clamp experimenten.

3. Opnamen Oplossingen en Micropipetten

OPMERKING: Gebruik de beste kwaliteit chemicaliën en oplossingen voor de patch-clamp experimenten.

1. Bereiding van voorraadoplossingen
   1. Autoclaaf alle flessen voor voorraadopslag en filter alle voorraadoplossingen (behalve de corrosieve oplossingen) en filter voor 0.22 μm membranen voor gebruik.
   2. Bereid alle voorraadoplossingen vooraf bij de RT op en houd deze bij 4 ^° C: 5 M NaCl op; 1 M KCl; 100 mM _MgCl2; 100 mM _CaCl2; 200 mM NaH _{2PO 4;} 100 mM EGTA (pH 7,0 met KOH). Hanteer 5 M NaOH, 1 M HC1 en 1 M KOH voorraden als corrosieve oplossingen.
2. Voorbereiding van standaard externe opname fysiologische zoutoplossing (PSS)
   1. Warm de voorraadoplossingen op RT op de ochtend van de patch-klem opname.
   2. Pipetteer de ingrediënten van elk bestand volgens de gewenste eindvolume, met uitzondering _CaCl2, bijvoorbeeld voor het bereiden van 500 ml PSS: 140 mM NaCl = 14 ml 5 M; 5 mM KCl = 2,5 ml 1M; 1,2 mM _MgCl2 = 6 ml 100 mM; 1,2 mM NaH _{2PO 4} = 3 ml 200 mM.
   3. Voeg dubbel toe-gedistilleerde water (DDH ₂ O) om het uiteindelijke volume van 400 ml en equilibreren.
   4. Weeg 0,9 g glucose en 1,19 g HEPES en los volledig op in het oplosmengsel.
   5. Voeg de _CaCl2 voorraad (2,5 mM = 12,5 ml 100 mM) toegevoegd.
   6. Voeg maximaal 99% van het uiteindelijke volume toe.
   7. Stel de pH op 7.4 met behulp van NaOH of HCI.
   8. Controleer de osmolariteit en pas zo nodig 5 M NaCl of glucose aan.
   9. Voeg DDH ₂ O tot het eindvolume van 500 ml in een cilinder.
3. Bereiding van micropipette interne oplossingen (lage EGTA K ⁺ -gebaseerde oplossingen)
   1. Weeg of pipet het juiste volume van de reagentia uit elke voorraad volgens het gewenste eindvolume en de concentratie, bijv. Voor het bereiden van 50 ml lage EGTA K ⁺ -basis intracellulaire oplossing tot een volume van ~ 30 ml ddH ₂ O: 100 mM K-gluconaat = 1,17 g; 35 mM KCl = 1,75 ml 1 M; 2 mM _MgCl2 = 1 mLVan 100 mM; 0,1 mM EGTA = 0,05 ml 100 mM; 10 mM HEPES = 0,072 g.
   2. Voeg genoeg water toe voor ~ 95% van het uiteindelijke volume en laat de oplossing bij RT gelijkwaardigen. Zorg dat de oplossing helder is.
   3. Terwijl u de oplossing constant roert, pas de pH op met 7,2 met behulp van KOH.
   4. Weeg en voeg 0,078 g Mg-ATP toe aan de oplossing tot het volledig is opgelost.
   5. Plaats de oplossing op ijs en gebruik een kleine aliquot voor het meten van osmolariteit; Meestal meet de oplossingen ~ 290 mOsmol en hoeft geen aanpassing. Als de osmolariteit significant verschilt van 280-295 mOsmol, bereidt u een nieuwe oplossing voor.
   6. Voeg DDH ₂ O tot de uiteindelijke volume.
   7. Verdeel de oplossing in 500 μl alikvoten, filter met een 0,2 μm spuitfilter, stevig dicht en onmiddellijk opslaan bij ≤ -20 ° C.
   8. Op de datum van het patch-clamp-experiment ontdooien één aliquot van de intracellulaire oplossing op ijs en blijf gekoeld tijdens het patch-klem experiment totVoorkoming van afbraak.
4. Trek de patchpipetten uit glazen capillairen (volgens de gebruiksaanwijzing van de pipettrukker) om micropipetgroottes met een weerstand van 5-10 M te verkrijgen wanneer deze worden gevuld met een intracellulaire oplossing.

4. Het patch-clamp-experiment instellen en een volledige celconfiguratie instellen met cellen

1. Het patch-clamp-experiment instellen
   1. Zet de patch-klem opstelling (computer, computer gestuurde versterker, digitizer, etc. )
   2. Open de patch-klem software ( bijvoorbeeld AXON pCLAMP10 of HEKA PatchMaster) en stel de protocollen voor elektrofysiologische opnamen op. Zet het filter voor het signaal naar een lage pas bij 1-3 kHz en de digitizer bij 10-20 kHz.
   3. Zet de camera, micromanipulator en lichtbron aan.
   4. Wanneer de computer gestuurde versterker aan is, gemalen het lichaam van de experimentator door met de handen aan te raken de patch-clamp rig die is geaard,Voordat u de hoofdtoon aanraakt, om deze te beschermen tegen elektrische schokken.
   5. Breng de cultiverende epitheelcellen op de glazen deklaag naar de opnamekamer gevuld met ~ 1 ml standaard PSS bij RT. Zorg dat u het PSS voorzichtig twee keer voorzichtig wijzigt met behulp van een pipet voor elke patch-clamp-experiment.
      OPMERKING: Optioneel vul het perfusiesysteem met standaard PSS of een andere externe oplossing volgens het geplande experiment. Perfuseer de microscopische opnamekamer (RC-26G of RC-26GLP) met PSS enkele malen met een snelheid van ~ 2 mL / min voordat u de patch-clamp experimenten begint. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn die langs het perfusiesysteem worden gevangen.
   6. Bekijk en selecteer de cellen onder een omgekeerde microscoop met behulp van 10X en 40X doelen die zijn uitgerust met een differentieel interferentie contrast optisch systeem. Zoek naar grote enkele geïsoleerde cellen voor opname. Identificeer de geïsoleerde epididymale epitheelcellen door hun bolvormige vorm met ruwe mIcrovilli aan het ene uiteinde van de membranen en gepolariseerde verdeling van intracellulaire inhoud ( Figuur 1 ).
   7. Vul een micropipet met de interne oplossing met een 1 ml spuit (een zelfgemaakte nonmetallic microsurve naald) op (lage EGTA K ⁺ -basis oplossing, zie stap 3.3). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de micropipet zijn, wat de weerstand van de micropipet kan verhogen. Gebruik voldoende oplossing zodat de interne oplossing de chloride-coated zilverdraadelektrode onderdompelt in de micropipethouder.
   8. Monteer de micropipet in de elektrodehouder en gebruik een lage positieve druk (~ 0,2 ml spuitvolume). Houd de lage positieve druk continu totdat u het celmembraan in de latere stappen aanraakt.
2. Het instellen van de volledige celconfiguratie met cellen voor opnames
   1. Dompel de pipet in de badoplossing met de hoogste snelheid van de micromanipulator. Zoek de pipetTip in het scherm dat is aangesloten op de digitale camera; Verlaag de micromanipulatorsnelheid naar de medium-hoge modus.
   2. Controleer snel de micropipetweerstand (5-10 MΩ) met behulp van de data acquisition interface commando ( bijv. "Membrane Test" in het AXON-systeem) door een spanningsstap ( bijv. 5 mV voor 100 ms) op te zetten die wordt gegenereerd door de computer gestuurde versterker. Vervang naar een nieuwe micropipette als de weerstand aanzienlijk buiten dit bereik ligt.
   3. Begin het doel op de microscoop te bewegen; Geleid geleidelijk de micropipette naar de geselecteerde cel. Verlaag eerst eerst het doel en laat de micropipette vervolgens naar het scherpvlak liggen totdat de micropipet boven het middenoppervlak van de geselecteerde cel ligt.
   4. Kanselleer het vloeibare koppelingspotentieel tussen de pipet- en badoplossingen op nul met behulp van de opdracht "pipette offset" in de commando-interface van software.
   5. Stel de computer gestuurde versterker commAnder aan de spanningsklem en de membraan test naar de "bad" modus.
   6. Fijne focus voor een duidelijker zicht op de cel, en verminder dan geleidelijk de micropipette met behulp van de micromanipulator bij de lage-gemiddelde snelheid.
   7. Wanneer de micropipet dicht bij de cel staat (aangetoond door een verminderde stroom bij het membraan test commando), verwijder de lage positieve druk onmiddellijk en gebruik een zwakke negatieve druk (0,1 ml spuitvolume) om de gigaseale (> 1 GΩ) te vormen .
   8. Monitor de weerstand met de membraan test. Als de weerstand> 500 MΩ maar <1 GΩ is, gebruik dan een negatief potentieel (meestal als het vasthoudpotentieel dat ingesteld is op -60 mV), die de gigaseal kan vormen. Vergoed de transiënte capacitieve stroom van de micropipet.
   9. Als de afdichting> 1 GΩ en stabiel is (zoals aangegeven in de softwareinterface), dient u een korte en sterke zuigkracht toe te passen om het celmembraan te breken. Vergoed geen vergoeding voor de verzekeringRies weerstand en de cel capaciteit.
   10. Onmiddellijk na het behalen van een succesvolle volledige celconfiguratie, gebruik een 10 mV hyperpolariserende stap (5 sporen met minimale tijdsintervallen, 20 ms duur, signaalmonster bij 20 kHz) van een vasthoudpotentieel van -60 mV.
   11. Zet de spanningsmodus in de nulstroommodus en merk de aflezingen van de softwareinterface af of voer een spleetloze opname (10-60 s) voor de membraanpotentiële aflezingen van de cel.
   12. Schakel snel terug en blijf in de spanningsmodus en pas de spanningsprotocollen aan volgens de geplande experimenten en meet de huidige reacties. Aftrekking wordt niet toegepast op de intrinsieke lekstroom tijdens de opnamen.
   13. Monitor de stabiliteit van de reacties tijdens de opnames, of de verschillende parameters van de cel. Gebruik bijvoorbeeld de "Membraanstest" commando-interface om de invoerweerstand (R _i ), de serieweerstand (R _s ) en de cel te controlerenMembraancapaciteit ( _Cm ) in de membraantest bij de "Cell" -modus tijdens de switching of protocols.
       OPMERKING: Plotselinge druppels in invoerresistentie geven gewoonlijk een losse patch aan, en een dramatische toename van de serieweerstand kan indicatief zijn voor de verstopping van de micropipette door de intracellulaire organellen of membraanfragmenten. Controleer tijdens de opname regelmatig de plaats van de micropipette om te controleren of er drift optreedt, wat kan leiden tot het verlies van de patch. Als drijfwerk een probleem is, lig de micropipette en de patchcel zorgvuldig op de bodem van de opnamekamer. Deze stap kan soms leiden tot het verlies van de patch, in welk geval het nodig is om de gehele cel patch-klem procedure te herhalen.

5. Analyse van passieve elektrofysiologische eigenschappen van cellen

1. Nadat u de gegevens van de patch-clamp-experimenten hebt verkregen, open de kloofvrije data in de Clampfit-software en meet de gemiddeldeWaarde voor het rustmembraanpotentieel voor elke cel. Als alternatief gebruik u de waarde zoals aangegeven uit de nulpastespanning in de huidige modus. Corrigeer de waarden met het vloeibare verbindingspotentieel (12,4 mV in deze studie).
2. Open de gegevens van de 10-mV hyperpolariserende stap (AV) die uit een cel is verkregen, meet het stroomverschil vóór en tijdens de stap (Δ I- _stap ) en bereken de invoerweerstand (R _i ) met de vergelijking als:
   
3. Bereken de celcapacitantie ( _Cm , in eenheid van pF) (gebruik dezelfde huidige data van de 10-mV hyperpolarisatiestap door het totale oppervlak onder de membraancondensatorstroom te integreren tijdens de initiële transient-decaystroom die op de spanningsstaptrekker wordt opgewekt) Om de waarde van de totale accumulatieve lading te verkrijgen (Q, in eenheid van pA • ms) van de cel. Gebruik de volgende vergelijking:
   
4. Bereken de waarde van de serieweerstand (R _s ) voor elke cel door de initiële transientstroom van de 10-mV negatieve stap te monteren met een standaard exponentieel algoritme om de tijdconstante vervalstroom ( T , in eenheid van ms) te verkrijgen en gebruik de Volgende vergelijking:
   

Resultaten

De beschreven enzymatische spijsvertering procedure voor de isolatie van epitheliale cellen uit de rat cauda epididymiden is een gemodificeerd protocol uit onze eerdere studies ^{9 , 12} . Deze methode produceert een mengsel van enkelvoudige cellen met meer dan 90% levensvatbaarheid en zonder oppervlakte blaren of gezwollen celvolume. Het heterogene celmengsel bestaat voornamelijk uit hoofdcellen, duidelijke cellen en basale cellen,...

Discussie

In dit protocol leverde de enzymatische dispersie van de rat-cauda-epididymiden consistente gezonde epitheelcellen. De kwaliteit van de epididymale epitheelcellen voor de patch-clamp experimenten is afhankelijk van een paar kritieke stappen in het protocol. Bijvoorbeeld, de centrifugatie van het celmengsel bij een lage centrifugale kracht (30 xg) is belangrijk voor het verwijderen van de spermatozoa en het epididymale luminale gehalte; De epididymale epitheelcellen worden ongezond in aanwezigheid van de spermatozoa in d...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Instrument van AXON systeem
Computergestuurde versterker	Molecular Devices - Axon	Multiclamp 700B patch-clamp versterker
Digitaal acquisitiesysteem	Molecular Devices - Axon	Digidata 1550 converter
Microscoop	Olympus	BX-61WI
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Opnamekamer en in-line verwarming	Warner Instruments	TC-324C
Instrument van HEKA systeem
Patch Clamp versterker	Harvard Bioscience - HEKA	EPC-10 USB double
Microscoop	Olympus	IX73
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Opnamekamer en in-line verwarming	Warner Instruments	TC-324C
Ander instrument
Micropipet Puller	Sutter Instrument	P-1000
Opnamekamer	Warner Instruments	RC-26G of zelfgemaakte kamer
Borosiliccaat capillair glas met filament	Sutter Instrument / Harvard Apparatus	BF150-86-10
Vibratie-isolatie tafel	TMC	63544
Digitale camera	HAMAMASTU	ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
Reagentia voor isolatie
RPMI 1640 medium	Gibco	22400089
Penicilline/Streptomycine	Gibca	15140112
IMDM	ATCC	30-2005
IMDM	Gibco	C12440500BT
Collagenase I	Sigma	C0130
Collagenase II	Sigma	C6885
5-α-dihydrotestosteron	Medchemexpress	HY-A0120
Fetaal bovien serum	capricorn	FBS-12A
Micropipet interne oplossingen (K+-gebaseerde oplossing) (pH 7,2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mM	Sigma/various	V900068
MgCl2 · 6H2O, 2mM	Sigma/various	M2393
EGTA, 0,1mM	Sigma/various	E4378
HEPES, 10mM	Sigma/various	V900477
K-gluconaat, 100mM	Sigma/various	P-1847
Mg-ATP, 3mM	Sigma/Various	A9187
De standaard externe fysiologische zout oplossing voor opname (PSS) (pH 7,4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM	Sigma/various	V900058
KCl, 4,7mM	Sigma/various	V900068
CaCl2, 2,5mM	Sigma/various	V900266
MgCl2 · 6H2O, 1,2mM	Sigma/various	M2393
NaH2PO4, 1,2mM	Sigma/various	V900060
HEPES, 10mM	Sigma/various	V900477
Glucose, 10mM	Sigma/various	V900392
Voor pH aanpassing
NaOH	Sigma/various	V900797	Zuiverheid >=97%
KOH	Sigma/various	60371	Zuiverheid >=99,99%