Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

Summary

Hier wordt aangetoond hoe de in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan worden gebruikt om de directe eiwit-eiwit interacties tussen ATM en p53 te detecteren en visualiseren in suspensiecellen die blootgesteld zijn aan genotoxische stress.

Abstract

De DNA schade respons respondeert de reparatie van DNA letsels die spontaan optreden, worden veroorzaakt door genotoxische stress, of verschijnen in het kader van geprogrammeerde DNA-breuken in lymfocyten. De Ataxia-Telangiectasia Mutated Kinase (ATM), ATM- en Rad3-gerelateerde kinase (ATR) en de katalytische subeenheid van DNA-afhankelijke Protein Kinase (DNA-PKcs) behoren tot de eerste die geactiveerd worden bij inductie van DNA-schade en zijn Centrale regulatoren van een netwerk dat de reparatie van DNA, apoptose en celoverleving regelt. Als onderdeel van een tumoronderdrukkende weg activeert ATM en ATR p53 door fosforylering, waardoor de transcriptieve activiteit van p53 wordt geregeld. DNA schade resulteert ook in de vorming van zogenaamde ioniserende straling geïnduceerde foci (IRIF) die complexen van DNA schade sensor en reparatie eiwitten vertegenwoordigen die accumuleren op de sites van DNA schade, die worden weergegeven door fluorescentie microscopie. Co-lokalisatie van eiwitten in IRIF's impliceert echter niet noodzakelijkerwijs dIrect eiwit-eiwit interacties, aangezien de resolutie van fluorescentiemicroscopie beperkt is.

In situ Proximity Ligation Assay (PLA) is een nieuwe techniek die de directe visualisatie van eiwit-eiwit interacties in cellen en weefsels mogelijk maakt met ongekende specificiteit en gevoeligheid. Deze techniek is gebaseerd op de ruimtelijke nabijheid van specifieke antilichamen die binden aan de eiwitten van belang. Wanneer de ondervraagde eiwitten binnen de 40 nm liggen, wordt een amplificatiereactie geactiveerd door oligonucleotiden die zijn geconjugeerd aan de antilichamen en het amplificatieproduct wordt door fluorescerende etikettering weergegeven, waardoor een signaal komt dat overeenstemt met de subcellulaire locatie van de interactieproteïnen. Met behulp van de gevestigde functionele interactie tussen ATM en p53 als voorbeeld, wordt hier aangetoond hoe PLA kan worden gebruikt in suspensiecelculturen om de directe interacties tussen eiwitten die integrale delen van de DNA-schaderespons zijn te bestuderen.

Introduction

DNA schade leidt tot een zeer gereguleerde reeks gebeurtenissen waarbij eiwit-eiwit interacties en post-translationele modificaties betrokken zijn die de efficiënte en snelle reparatie van DNA waarborgen, waardoor de genomische integriteit ^{1 wordt} gewaarborgd. Typisch wordt DNA reparatie bestudeerd in cellen blootgesteld aan ioniserende straling door de vorming van zogenaamde ioniserende straling geïnduceerde foci (IRIF) door (confocale) fluorescentiemicroscopie te monitoren. Veel DNA-reparatie en DNA-schadebepalende eiwitten vormen IRIF's, die eiwitcomplexen vertegenwoordigen die nucleïneeren op chromatineplaatsen die DNA-schade ^{2 , 3} onderhouden. De locatie en de oplossing van IRIF's over de tijd geeft belangrijk inzicht in de spatiotemporale organisatie van DNA-reparatie, en kan de betrokkenheid van verschillende DNA-reparatiewegen aanduiden. De aard van de DNA-schade en het celcyclus stadium waarin de schade wordt bereikt, bepaalt welk DNA herstelpad wordt geactiveerd. fo In de cellen die actief betrokken zijn bij DNA-replicatie (S-fase) is homologe recombinatie (HR) de dominante DNA-herstelweg, terwijl in de cellen in de G1- of G2 / M-fase van de celcyclus de niet- Homologe end-joining (NHEJ) reparatiebaan overheersen. Een van de vroegste gebeurtenissen na DNA-schade is de activatie van de DNA-schade-senserende kinasen Ataxia Telangiectasia-Mutated Protein (ATM), die meestal actief is in de G1- en G2 / M-fasen van de celcyclus en NHEJ reguleert, En Ataxia Telangiectasia en Rad3-gerelateerde eiwitten (ATR), die in S-fase optreden door HR te activeren. Zowel ATM als ATR zijn zeer pleiotropische kinasen die veel proteïnen fosforyleren die betrokken zijn bij DNA-reparatie, celdood en overleving ⁴ . Beide kinasen zijn aangetoond dat het tumor-suppressor eiwit p53 fosforyleren en activeren na de blootstelling aan genotoxische stress, wat aangeeft dat deze kinasen stroomopwaartse mediators zijn van een zwenkende tumor onderdrukkende signaalas"Xref"> 5 ^{, 6} .

De vorming en samenstelling van IRIF's wordt typisch beoordeeld door co-lokalisatie van verschillende eiwitten te bepalen met behulp van dubbelkleurige immunofluorescentie-kleuring en microscopie. Niet alle eiwitten die deel uitmaken van reparatie-eiwitcomplexen vormen IRIF's, die de toepasbaarheid van deze aanpak beperken. Bovendien wordt (confocale) immunofluorescentiemicroscopie beperkt door de diffractie-eigenschappen van licht, wat resulteert in een vrij slechte ruimtelijke resolutie van ongeveer 200-300 nm, die de grootte van de meeste subcellulaire structuren overschrijdt, die in wezen de directe ondervraging van eiwit-eiwitinteracties op Het moleculaire niveau Als zodanig is de co-lokalisatie van immunofluorescentiefleuringpatronen zoals gedetecteerd door (confocale) fluorescentiemicroscopie niet noodzakelijk indicatief voor directe eiwit-eiwitinteracties. Onlangs zijn nieuwe superresolutie technologieën ontwikkeld, zoals driedimensionale strucTured illumination microscopy (3D-SIM) ⁷ , die succesvol werd gebruikt om 53BP1- en BRCA1 IRIF-vorming op nano-schaaldetails te bestuderen, waarbij de ruimtelijke verdelingseigenschappen van deze eiwitten werden onthuld die niet door confocale laserscanningsmicroscopie ⁸ gedetecteerd werden.

Verschillende andere methoden kunnen worden gebruikt om eiwit-eiwitinteracties in vivo te detecteren, zoals co-immunoprecipitatie, aftrekmethoden en gist-tweehybride screeningsbenaderingen. Echter, deze technieken zijn nogal omslachtig, vereisen grote hoeveelheden cellen of eiwitten of betrekken overexpressie van eiwitten, die experimentele artefacten introducereert. Meer recent is een nieuwe techniek ontwikkeld die de visualisatie en kwantificering van eiwit-eiwitinteracties in situ mogelijk maakt ( dat wil zeggen in cellen en in weefsels), die wordt aangeduid als Proximity Ligation Assay (PLA) ^{9 , 10} . PrImary antilichamen die twee eiwitten van belang herkennen worden gedetecteerd door secundaire antilichamen die zijn geconjugeerd aan oligonucleotiden (zogenaamde PLA probes). Als de twee verschillende secundaire antilichamen dicht genoeg zijn door de interacties tussen de eiwitten die door de primaire antilichamen worden herkend, hybridiseren de geconjugeerde oligonucleotiden en kunnen zij gelaten worden om een ​​gesloten circulaire DNA-substraat te vormen. Dit cirkelvormige substraat wordt vervolgens geamplificeerd door rollende cirkel amplificatie, en geconfigureerd met fluorochroom-geconjugeerde complementaire oligonucleotiden. Met behulp van PLA wordt de subcellulaire lokalisatie van de eiwit-eiwit-interactie bewaard, aangezien het fluorescently gemerkte rollende cirkel amplificatieproduct aan de PLA probes gehecht blijft. De resolutie van deze analyse is <50 nm, gebaseerd op de bevinding dat de diameter van een antilichaam ongeveer 7-10 nm is. Rolcirkel amplificatie kan alleen plaatsvinden in geval twee paren antilichamen (primaire + seconDary) fysiek interactie binnen de omtrek die door hun grootte wordt gedefinieerd (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). De signaalversterkingstap verhoogt de gevoeligheid van de PLA-analyse en maakt het detecteren van interacties van nauwelijks uitgedrukte proteïnen mogelijk. PLA genereert punctate, foci-achtige signalen die kunnen worden gekwantificeerd op per celbasis, waardoor de intra- en intercellulaire variatie in eiwit-eiwitinteracties kan worden beoordeeld.

De vorming en samenstelling van DNA-reparatiecomplexen en IRIF's wordt meestal bestudeerd in aanhechtende cellijnen, zoals de menselijke bot osteosarcoma epitheliale cellijn U2OS, de menselijke embryonale niercel lijn HEK293 en de retinale pigment epitheliale cellijn RPE-1, die snel- Groeiend en makkelijk te transfecteren. Suspensiecelculturen zoals een lymfoïde en myeloïde cellijnen worden minder vaak gebruikt, aangezien deze minder vatbaar zijn voor transfectie en in het algemeen niet aan de deklijsten hechten, waardoor aanvullende / alternatieve stEps voor beeldvorming. De resolutie van DNA-schade is echter zeer relevant in het kader van lymfoïde en myeloïde maligniteiten, aangezien het DNA-schaderespons vaak wordt beïnvloed door genomische (bestuurder) aberraties in deze tumoren, een cruciale rol spelen bij de kwaadaardige transformatie van normale lymfoïde en myeloïde Stamvader) cellen ^{12 , 13 , 14} .

Dit protocol beschrijft hoe PLA kan worden gebruikt om eiwit-eiwitinteracties te beoordelen en te kwantificeren na de inductie van DNA-schade in suspensiecellenculturen. Hier wordt PLA uitgevoerd om de interacties tussen ATM en p53 te bepalen en te visualiseren bij DNA-schade in humane B-cel leukemacellen die geïnduceerd zijn om een ​​G1-fase celcyclus arrestatie te ondergaan. Opgelet, het hier gepresenteerde protocol is niet beperkt tot het bestuderen van ATM- en p53-interacties in G1-gearresteerde leukemacellen, maar kan ook gebruikt worden om andere eiwit-eiwit interac te visualiserenIn verschillende celsoorten en suspensiecelculturen.

Protocol

1. Behandeling van cellen en DNA-inductie

1. Cultuur de humane BCR-ABL + B-cel acute lymfoblastische cellijnen BV173 of SUP-B15 in IMDM aangevuld met 20% FCS, 50 μM p-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2. Tel cellen en plaat bij 2 x 106 cellen / ml in 6-putjes platen, bij 5 ml / putje.
   OPMERKING: Optioneel kunnen suspensie cellijnen van verschillende oorsprong gebruikt worden.
2. Om de BCR-ABL + B-ALL cellen in de G1-fase van de celcyclus te arresteren, voeg 5 μM imatinib methaansulfonaat (STI571) toe en incubeer overnacht.
   1. Optioneel, laat deze stap weg tijdens het bestuderen van eiwit-eiwitinteracties gedurende de celcyclus of in BCR-ABL-negatieve celtypes.
3. DNA-schade toebrengen door 50 ng / ml neocarzinostatine (NCS) toe te voegen aan de cultuur en gedurende 2 uur te incuberen.
   1. Alternatief,DNA-schade induceren door de cellen te bestralen met behulp van een radioactieve bron [ ¹³⁷ Cs] bij 0,5 Gy / min, bij een dosis van 5 Gy. Na bestraling laat de cel gedurende 2 uur bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO ₂ herstellen.
4. Optioneel, om de betrokkenheid van ATM kinase activiteit in reactie op DNA schade te beoordelen, voeg 5 μM van de ATM kinase remmer KU55933 toe vóór toevoeging van NCS of de bestralingsbehandeling.
5. Bereid 1x PBS + 10% BSA aan door 5 g fractie-V BSA op te leggen boven 50 ml 1x PBS in een beker of Erlenmeyer-fles, en laat zitten bij RT totdat BSA is opgelost. Schud niet of roer, aangezien dit schuimende schuim veroorzaakt. Filter langzaam door een 0,22 μm filter en houd ijs op.
6. Oogstcellen en was twee keer met ijskoude 1x PBS. Tel de cellen en resuspendeer bij 2 x 10 ⁶ / ml in 1x PBS + 10% BSA. Bewaar cellen op ijs.

2. Cytocentrifugatie, Fixatie en Permeabilisatie

1. Bereid de4% paraformaldehyde oplossing in 1x PBS vers. Voeg 2 g PFA toe aan 50 ml 1x PBS en incubeer in een 55 ° C schudwaterbad tot de oplossing helder is. Filter de oplossing door een 0,22 μm filter en berg bij RT tot gebruik.
   OPMERKING: Eventueel kan 4% PFA-fixatief worden opgeslagen bij -20 ° C. Na het bevriezen, ontdooien slechts één keer voor gebruik. Anders kan de 4% PFA oplossing in PBS direct worden gekocht.
2. Polijst 76 mm x 26 mm dia's met een lintvrij weefsel voorzichtig en ontvette ze door 5 minuten in 96% ethanol in een Coplin-pot te plaatsen. Laat de microscopie gedurende 10 minuten luchtdrogen glijden.
3. Monteer de microscopische dia's in de cytospin / cytology trechters met een oppervlakte van 6 mm. Pre-coat glijbanen door 50 μl 1x PBS + 10% BSA in elke trechter te pipetteren en centrifuge gedurende 1 minuut bij 500 rpm.
4. Voeg 100 μl van de celsuspensie (gelijk aan 0,2 x 106 cellen) aan elke trechter en centrifuge gedurende 5 minuten bij 500 rpm. Voor elke antilichaamcombinatie, bij leAst 4 preparaten zijn vereist (dubbel-antilichaam experiment, twee single-antilichaam controles, geen antilichamen controle).
5. Demonteer de trechters voorzichtig en zorg ervoor dat u de vlekken niet aanraakt. Ga onmiddellijk naar de monsterfixatie.
   1. Optioneel laat de dia's gedurende 30 minuten luchtdrogen. Na luchtdrogen, schuif de glijbanen individueel in aluminiumfolie en opslaan bij -20 ° C tot aan het gebruik. Bij het gebruik van bevroren preparaten, zorg ervoor dat u de glijbanen verpakt in een handdoek om het openen van condensatie op de glijbanen te voorkomen, ontdooien.
6. Teken een cirkel (ongeveer 15-20 mm diameter) rond de plaats met een PAP pen vloeistofblokker (5 mm tip).
7. Voeg 50 μl 4% PFA-fixatieoplossing toe aan elke plek en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
8. Was de cellen 3 keer gedurende 5 minuten met 1x PBS in een Coplin pot bij RT met zachte agitatie.
9. Droog de glijbanen rond de plekken met een lintvrij weefsel en verwijder zoveel mogelijk vloeistof uit de plaats met behulp van een piHuisdier zonder aan te raken, of door de dia te kantelen. Voeg 50 μL 0,25% Triton-X in 1x PBS toe aan elke plek en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur zonder agitatie.
10. Was de glijbanen 3 keer gedurende 5 minuten in ~ 50-60 ml 0,05% Tween-20 in TBS (TBS-T) in een Coplin pot bij RT met zachte agitatie. 10 slides kunnen tegelijkertijd op deze manier worden verwerkt.

3. Blokkering en primaire antilichaam incubatie

1. Tap TBS-T af en droog de glijbanen rond de plekken met een pluisvrije weefsel. Verwijder zoveel mogelijk vloeistof uit de plaats met behulp van een pipet zonder de plaats aan te raken, of door de dia te kantelen. Vortex de blokkerende oplossing kort en voeg een druppel (~ 40 μL) toe aan elke plek. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C in een voorverwarmde bevochtigde kamer.
2. Bereid de antilichaamcocktail door het geiten-anti-ATM bij 1: 1000 en het konijn-anti-fosfo-Ser15-p53 bij 1: 100 in een commercieel antilichaam verdunningsmiddel, vortex antilichaam verdunningsmiddel voor gebruik te mengen. Voor controle experimentTs, verdunning van antilichamen die alleen de geiten-anti-ATM bevatten en alleen het konijn-anti-fosfo-Ser15-p53-antilichaam (enkel-antilichaam controles).
3. Tap de blokkerende oplossing af, maar zorg ervoor dat de cellen niet drogen voordat de antilichaamverdunningen worden toegevoegd. Voeg 30 μl van elke antilichaamcocktailverdunning toe en incubeer in een bevochtigde kamer 's nachts bij 4 ° C.
4. Bereid in situ Washbuffer A en Wasbuffer B door de inhoud van een zakje Buffer A en Buffer B-mengsel op te lossen in een uiteindelijk volume van 1.000 ml water.
   1. Alternatief, bereid de wasbuffer A op door 8,8 g NaCl op te lossen, 1,2 g Tris-base en 0,5 ml Tween-20 in 800 ml water. Pas de pH aan op 7,4 met behulp van HC1 en voeg toe aan een eindvolume van 1000 ml.
   2. Alternatief, bereide Wash Buffer B door 5,84 g NaCl, 4,24 van Tris-base en 26,0 g Tris-HCI in 500 ml water op te lossen. Pas de pH aan op 7,5 met behulp van HC1. Voeg water toe aan een eindvolume van 1000 ml.
   3. FilterBeide oplossingen via een 0,22 μm filter.
5. Was de slides 2 keer gedurende 5 minuten met 1x in situ wasbuffer A in een Coplin pot bij RT met zachte agitatie.

4. PLA Probes, Ligation en Amplification

1. Bereid PLA probes door het verdunnen van de anti-geiten PLUS en anti-konijn MINUS, beide 1: 5 in het commerciële antilichaam verdunningsmiddel. Tik 1x in situ wasbuffer A uit de glijbanen en voeg 30 μL van het PLA sonde-mengsel op elke plek. Incubeer 1 uur bij 37 ° C in een voorverwarmde bevochtigde kamer.
   OPMERKING: elke combinatie van secundaire antilichamen PLUS en MINUS PLA probes kan worden gebruikt (anti-muis, anti-konijn, anti-geiten), zolang de toegepaste primaire antilichamen in verschillende soorten worden verhoogd en de combinatie van PLA probes moet altijd Bevat een PLUS sonde en een MINUS sonde.
2. Was de slides 2 keer gedurende 5 minuten met ~ 50-60 ml 1x in situ wasbuffer A in een Coplin pot bij RT met zachte agitatie.
3. Bereid de Ligation-Ligase oplossing op ijs door 1 μL Ligase toe te voegen aan 39 μL Ligation oplossing en voeg 40 μL Ligation-Ligase oplossing op elke plek toe. Incubeer 30 min bij 37 ° C in een voorverwarmde bevochtigde kamer.
4. Was de dia's 2 keer gedurende 5 minuten met ~ 50-60 ml 1x in situ wasbuffer A in een Coplin pot bij RT met zachte agitatie.
5. Bereid het Versterking-Polymerase mengsel op ijs door de Amplification stock oplossing 1: 5 in water te verdunnen. Voeg dan 0,5 μl polymerase toe aan 39,5 μl 1x versterkingsoplossing voor elke plek.
   OPMERKING: De versterkingsreagentia zijn lichtgevoelig en moeten beschermd worden tegen directe blootstelling aan licht. Het versterkingsreagens komt in vier verschillende kleuren (RED: excitatie 594 nm, emissie 624 nm, FarRED: excitatie 644 nm, emissie 669 nm; ORANGE: excitatie 554 nm, emissie 576 nm; GREEN: excitatie 501 nm, emissie 523 nm) Zorg ervoor dat de beschikbare microscopie-instelling s heeftUitstekende excitatie eigenschappen en filters om deze kleuren af ​​te beelden.
6. Tik 1x in situ wasbuffer A af en voeg 40 μL Amplification-Polymerase-mengsel per punt toe. Incubeer gedurende 100 minuten bij 37 ° C in een voorverwarmde bevochtigde kamer.

5. Montage en beeldvorming

1. Bereid 0,01x in situ wasbuffer B door 1 ml 1x Wash Buffer B toe te voegen aan 99 mL water.
2. Tap het Amplification-Polymerase-mengsel af en doe de slides 2 keer gedurende 10 minuten met 1x in situ wasbuffer B in een Coplin pot bij RT met zachte roering.
3. Was de glijbanen 1 minuut in 0,01x wasbuffer B.
4. Tap de overtollige 0,01x wasbuffer B af en droog de glijbanen rond de plekken met een pluisvrij weefsel. Verwijder zoveel mogelijk vloeistof uit de plaats met behulp van een pipet zonder de plaats aan te raken, of door de dia te kantelen.
5. Verdun DAPI-bevattende montage medium 1: 5 in montage medium zonder DAPI om te voorkomen dat de nuclei worden overschreden.
6. Voeg 25-30 μL 1: 5 DAPI-houdend montagemedium toe aan een 24 mm x 24 mm deklaag en haal de afdekplaatje op met de glijbaan, gebruik een kleine druk om ervoor te zorgen dat er geen gevangen luchtbellen zijn. Verzegel de deklaag met nagellak en wacht minstens 15 minuten voor afbeeldingen.
7. Analyseer de dia's met behulp van een (confocale) fluorescentiemicroscoop.
   1. Tel het aantal punctate PLA signalen per cel in ten minste 4 verworven beeldvelden (20x objectief, tel tenminste 20 cellen per conditie of antilichamencombinatie, op basis van een vermogensberekening met een verwachte gemiddelde van 7 ± 5 signalen in de behandelde cellen, En 2 ± 2 signalen in de onbehandelde cellen, met een kans op een type I fout van 0,05 en een vermogen van 80%, zoals eerder gemeld ¹⁵ ).
      OPMERKING: De beste oplossing wordt bereikt door een Z-stack en deconvolutie te verkrijgen met behulp van softwarepakketten ( bijv . ImageJ, de Leica Acquisition Suite (LAS)). De signaIk zou duidelijk moeten worden herkend binnen de kernomtrek, zoals gedefinieerd door de DAPI-kleuring.
   2. Tel geen signalen die duidelijk buiten de kernen voorkomen. Normaal gesproken resulteert NCS-behandeling of γ-bestraling in ongeveer 5-10 phosho-p53 / ATM PLA signalen per cel. De 'single-antilichaam' controles kunnen wat achtergrondsein geven, maar dit mag niet meer dan 1-2 PLA signalen per 1 uit elke 20 cellen overschrijden.
   3. Voor publicatie en presentatie doe je beelden op met een 40x of 63X onderdompeling olie doelstelling. Slides kunnen bij 4 ° C worden opgeslagen en beschermd tegen blootstelling aan licht.

Results

Fosforylering van p53 bij residu Ser15 bleek afhankelijk te zijn van ATM kinase activiteit ¹⁶ . Om de specificiteit van de PLA techniek op cytospinpreparaten van suspensiecelkweken te demonstreren en te bevestigen wordt aangetoond dat inductie van DNA-schade door 2 uur NCS-behandeling van BCR-ABL + B-ALL-cellen die in de G1-fase van de celcyclus gearresteerd werden Resulteerde in de specifieke interactie tussen ATM en fosfo-Ser15-p53, zoals verwacht. Punctale PLA ...

Discussion

In dit rapport wordt aangetoond dat PLA kan worden gebruikt om de specifieke interactie tussen eiwitten in suspensiecelculturen te bepalen en te visualiseren. Opmerking, het hier beschreven protocol is niet beperkt tot de studie van DNA-reparatiecomplexen, maar is ook van toepassing op het visualiseren en kwantificeren van andere eiwit-eiwitinteracties in suspensiecelculturen. Er wordt aangetoond dat de ATM-kinase interfereert met gefosforyleerd p53 in G1-gearresteerde BCR-ABL + B-ALL-cellen wanneer blootgesteld aan een...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV173 cel lijn	DSMZ	AC-20	BCR-ABL+ B-ALL cel lijn
SUP-B15 cel lijn	DSMZ	ACC-389	BCR-ABL+ B-ALL cel lijn
Iscove's Gemodificeerd Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco (Life Technologies)	21980-032
Foetaal Runderserum	Sigma Aldrich	F7524	lot #: 064M3396
L-glutamine	Gibco (Life Technologies)	25030-024
penicilline/streptomycine	Gibco (Life Technologies)	15140-122
imatinib methaansulfonaat	LC Laboratories	I-5508	Oplossen in DMSO, bereid 10 mM stockoplossing
neocarzinostatine	Sigma Aldrich	N9162	Mutagen/teratogeen, zorgvuldig hanteren
KU55933	Selleckchem	S1092	Oplossen in DMSO, bereid 5 mM stockoplossing
Starfrost Microscoopslides	Waldemar Knittel	VA11200 003FKB
PAP pen vloeibare blocker	Sigma Aldrich	Z377821-1EA
Cytospin trechter	Q Path Labonord SAS	003411324
Duolink In Situ Red Starter Kit Geit/Konijn	Sigma Aldrich	DUO92105	Beschikbaar voor verschillende soorten/combinaties, ook verkrijgbaar in FarRED, Oranje en Groen
geit-anti-ATM	Bethyl Laboratories	A300-136A	PLA-kwaliteit; we hebben met succes lot#A300-136A-1 gebruikt in onze studies
konijn-anti-fosfo-Ser15-p53	Cell Signaling Technology	9284	We hebben met succes lot #9284-4 gebruikt in onze studies
Vectashield antifading montagemedium met DAPI	Vector Labs	H-1200
Vectashield antifading montagemedium	Vector Labs	H-1000
4% paraformaldehyde in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Ook verkrijgbaar bij verschillende andere leveranciers