Methodenartikel

Isolatie van de side population in Myc-geïnduceerde T-cel acute lymfatische leukemie in zebravis

6.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55711

⸱

4 mei 2017

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Section of Hematology-Oncology, The University of Chicago, 2Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een techniek om de zijkant populatie cellen te isoleren uit een zebravis model van myc-geïnduceerde T-cel acute lymfoblastische leukemie (T-ALL). Deze side population test is zeer gevoelig en beschreven voor zebravis T-ALL, maar kan toepasbaar zijn op andere maligne en niet-maligne types zebravis cel.

Samenvatting

Heterogene celpopulaties, afkomstig van gezonde en kwaadaardige weefsels, kan een celpopulatie gekenmerkt door een differentiële vermogen om de DNA-bindende kleurstof Hoechst 33342. Deze "side population" cellen uitstroming bevatten kunnen worden geïdentificeerd met behulp flowcytometrische werkwijzen na de Hoechst 33342 kleurstof wordt geëxciteerd door een ultraviolet (UV) laser. De side population van vele soorten cellen bevat stam- of voorlopercellen-achtige cellen. Echter, niet alle celtypen hebben een identificeerbare side population. Danio rerio, zebravis, hebben een robuust in vivo model van T-cel acute lymfatische leukemie (T-ALL), maar of deze zebravis T lekbakken hebben een side population is onbekend. De hier beschreven methode beschreven hoe opzij populatie cellen in de zebravis T-ALL isoleren. Om te beginnen, wordt de T-ALL in de zebravis gegenereerd via microinjectie van tol2 plasmiden in een cel embryo's. Zodra de tumoren gegroeid tot een stadium waarin zij breiden tot meer dan de helft van de animal lichaam, kan de T-ALL-cellen worden geoogst. De cellen worden vervolgens gekleurd met Hoechst 33342 en onderzocht met behulp van flow cytometrie side population cellen. Deze methode heeft brede toepassingen in de zebravis T-ALL onderzoek. Hoewel er geen bekende celoppervlak markers in de zebravis die bevestigen of deze bijwerkingen populatie cellen kankercellen zijn stamcelachtige in vivo transplantatie functionele assays mogelijk. Bovendien kan eencellig transcriptomics worden toegepast op de genetische kenmerken van deze bijwerkingen populatie cellen te identificeren.

Inleiding

De zijpopulatie analyse maakt gebruik van het verbeterde vermogen van bepaalde cellen in een weefsel om de DNA bindende kleurstof Hoechst 33342 uit te vloeien als gevolg van hoge niveaus van de ATP bindende cassette (ABC) transporteur eiwitten op het celmembraan. De cellen die de Hoechst 33342-kleurstof uitstromen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van dual-wavelengte-cytometrische analyse nadat de kleurstof opgewonden is door een UV-laser. Deze test werd eerst gebruikt om muizen hematopoietische stamcellen (HSCs) 1 te identificeren, maar is sindsdien gebruikt om stam- / stamcellenpopulaties in veel weefsels en kanker te identificeren (in referentie 2 onderzocht). Echter, niet alle populaties van cellen hebben een zijpopulatie, en niet alle zijpopulaties zijn verrijkt voor stam- / stamcellen.

De zebravis is een krachtig vertebrat genetisch model systeem voor het bestuderen van menselijke kanker 3 , 4 , met een aantal voordelen boven de traditionele murine moDelen van kanker. Zebravis embryo's zijn extern bevrucht en zijn optisch duidelijk, het faciliteren van transgenese en de in vivo waarneming van pathologische processen, waaronder kankerinitiatie en progressie. Tot op heden is de zijkampbevestiging om potentiële stam- of stamcellen te detecteren alleen toegepast op de niermerg in zebravis om HSC's te identificeren, en niet voor zebraviskankermodellen 5 , 6 .

Het zebravismodel van T-cel acute lymfoblastische leukemie (T-ALL) is morfologisch en genetisch vergelijkbaar met de menselijke T-ALL 7 , 8 , 11 . T-ALL is een agressieve maligniteit die bij mensen 10-15% van de pediatrische en 25% van de volwassen ALLE gevallen 9 vertegenwoordigt. Terwijl de behandeling van T-ALL is verbeterd, is de terugval nog steeds gebruikelijk en wordt er gepaard gegaan met een slechte prognose. T-ALL tumoren zijn heterogeenOus en bevatten veel verschillende tumorcel subpopulaties, waaronder leukemie initiatiefcellen (LIC's). LIC's worden gedefinieerd door hun vermogen om de gehele tumor van een enkele cel te hergroeien en de frequentie van LIC's binnen een tumorcelpopulatie kan worden berekend door verschillende celdoses in recipiënten te transplanteren via een limietverdunningstransplantatie-analyse (LDA). Terwijl LDA-experimenten zijn uitgevoerd in zebravis om de frequentie van LICs 8 , 10 , 11 te berekenen, wordt deze bepaling achteraf gemaakt en staat de toekomstige isolatie van LIC's niet toe. Daarom ontbreekt een methode voor het prospectief isoleren van een populatie verrijkt voor kankercellen. Het identificeren en isoleren van bevolkingscellen van zebravis T-ALL's is de eerste stap om deze tekort aan te pakken.

Het hier beschreven protocol beschrijft hoe T-ALL tumoren efficiënt kunnen worden genereerd in zebrVerdovende gebruik maken van tol2-gemedieerde transgenese, oogst de T-ALL tumorencellen, en vlek ze met Hoechst 33342 om de zijbevolking van cellen te identificeren. Toekomstige in vivo experimenten met zebravis T-ALL kunnen omvatten of de zijbevolkingscellen verrijkt zijn voor LIC's of andere stam- of stamvaderachtige eigenschappen hebben.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures met zebravis zijn goedgekeurd door het Institusionele Diervoeder- en Gebruikskomitee (IACUC) aan de Universiteit van Chicago. De Universiteit van Chicago is geaccrediteerd door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC).

1. Het genereren en isoleren van fluorescerend gelabelde T-ALL cellen in Zebrafish

  1. Microinjectie in syngeneuze zebravis embryo's
    1. Gebruik commercieel verkrijgbare kits, isoleer circulaire rag2 : c-myc en rag2 : groen fluorescent eiwit ( rag2 : GFP) plasmide DNA dat omgekeerde terminale herhalingen herkent door tol2 transposase (zie de tabel van materialen voor bron van plasmide DNA) 12 en eluteer het DNA In steriel water.
      OPMERKING: GFP wordt gebruikt in deze studie, maar elk fluorescerend eiwit zal werken.
    2. Bereid pCS2-transposase (tol2) RNA op
      1. Isoleer tol2 plasmide DNA met gebruik van commercieel verkrijgbare kits (zie tHij Tabel van Materialen voor de bron van plasmide DNA) 12 en eluteer het DNA in steriel water.
      2. Incubeer 1 μg tol2 DNA bij 37 ° C gedurende 1 uur met 5 eenheden NotI-restrictie-enzym in de geschikte buffer om het plasmide te lineariseren. Hitte-inactiveren de NotI bij 20 ° C gedurende 20 minuten.
      3. Transcripteer het tol2 RNA met SP6 RNA polymerase van het gelineariseerde DNA onder gebruikmaking van een in de handel verkrijgbare RNA transcriptie kit 13 . Bewaar het RNA bij eenmalig gebruik bij -80 ° C.
    3. Bereid de injectiemengsel op ijs door 250 ng rag2 : c-myc plasmide DNA, 250 ng rag2 : GFP plasmide DNA, 150 ng tol2 RNA en 0,5 μl fenol rood toe te voegen. Pas het volume aan op 10 μL met nuclease-vrij water.
    4. Injecteer ~ 1 nl injectiemengsel in de cel van een zenfeneuze zebravis embryo van een celcilinder met behulp van een microinjector en naald getrokken uit een glazen capillaire buis, in navolging van eerder estabGepaste methoden 8 , 14 .
      OPMERKING: Syngeneuze zebravis die door parthenogenese 15 wordt gegenereerd, worden hier gebruikt om genetische heterogeniteit en immuunafstoting na transplantatie te elimineren. Echter, wildtype zebravis of enige gewenste stam kan ook worden gebruikt.
    5. Verwijder dode, onderontwikkelde of misvormde embryo's bij 24 uur en 48 uur na injectie 16 .
    6. Plaats de geïnjecteerde vis op het vissysteem op 6 dagen na de injectie en verhoog ze volgens standaardprotocol 6 .
  2. Screening geïnjecteerde zebravis en het volgen van tumorgroei
    1. Plaats op 21 dagen na de injectie een enkele injecteerde larve in een druppel embryo-medium op een Petri-schotel en scherm voor GFP-fluorescentie met behulp van een epifluorescerende microscoop (excitatiebandpas: 470/40, emissie bandpas: 525/50) 8 .
      OPMERKING: Zebravis larven die hAve geïntegreerde zowel rag2 : c-myc en rag2 : GFP zal een groene fluorescerende thymus (positieve vis) hebben en kan de uitbreiding van kwaadaardige groene fluorescerende cellen verder vertonen dan de thymus. Alle vis met een GFP + thymus zullen verder gaan met het ontwikkelen van een GFP + T-ALL. De larven die de integratie van de plasmiden niet aantonen, zullen geen groene fluorescerende cellen hebben (negatieve vis).
    2. Scheep de negatieve vis (gebaseerd op een gebrek aan fluorescentie) in een andere tank en controleer de vis nog eens op 28 en 35 dagen na de injectie. Bij 28 en 35 dagen na de injectie verdovken de vis met 0,02% gebufferde tricaïne (MS-222) in viswaterwater voorafgaand aan het screenen.
    3. Plaats elke zebravis larve die positief is voor een fluorescent gelijmde thymus of een fluorescent gelabelde tumor in een individuele tank om drie keer per week tumorgroei te monitoren.
  3. Inzameling van fluorescent gelabeld T-ALL cellen van de primaire tumor vis
    1. Bereid ten minste 20 ml 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runder serum in 0,9x fosfaat gebufferde zoutoplossing (FBS / PBS).
    2. Voeg 1 ml FBS / PBS toe aan één injectieflacon heparine natriumzout (300 eenheden).
    3. Selecteer visdraag tumoren in meer dan 50% van het lichaam, of die vissen hebben moeite met eten of zwemmen. Offer de vis door ze te overdrijven met trica of door ijswater onderdompeling. Bevestig de dood door een gebrek aan beweging en hartslag.
    4. Gebruik een scheermesje om het hoofd van de vis te verwijderen.
    5. Was de holte van de vis met de heparineoplossing om overtollige rode bloedcellen te verwijderen.
      1. Gebruik een pipet, injecteer 100 μl heparine oplossing (bereid in stap 1.3.2) in de lichaamsholte van de vis. Verwijder alle vloeistof die uitmondt (het bevat bloedcellen) en pipet het in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
      2. Gebruik een verse pipettip om het lichaam weer te wassen. Voer ten minste drie wasjes uit, of tot de vloeistof die uitspoelt, verschijnt vrij van blood.
      3. Verwijder alle vloeistof uit de was in stappen 1.3.5.1 en 1.3.5.2, aangezien deze niet in verdere analyses wordt gebruikt.
    6. Verzamel de leukemacellen.
      1. Spuit 100 μL FBS / PBS in de lichaamsholte van de vis.
      2. Breng zachte druk aan de buitenkant van het lichaam van de vis met de pipettip om de tumorcellen te drukken / uit te drukken.
        OPMERKING: Als deze stap wordt uitgevoerd met behulp van een dissectiemicroscoop, zullen de tumorcellen die uit de lichaamsholte vallen, duidelijk zijn.
      3. Verzamel de vloeistof en cellen van elke was in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
      4. Herhaal stappen 1.3.6.1-1.3.6.3 tot de meeste tumorcellen worden verzameld (meestal 5-10 keer). Verzamel alle tumorcellen in dezelfde 1,5 ml microcentrifugebuis. Houd de cellen bij kamertemperatuur.
    7. Meng de verzamelde tumorcellen van stap 1.3.6 door ze zachtjes te pipetteren om de klompen cellen te dissociëren. Filter de cel suspensie door een 40-μm maasfilter. Was het filter 1-2 keer met 100 μL FBS / PBS. Houd de cellen bij kamertemperatuur.
    8. Meng 2 μL cel suspensie met 18 μl trypanblauw (0,4%, verdund 1:10 en gefiltreerd) in een nieuwe buis. Laad 10 μL op een hemocytometer en tel het aantal levende (niet-blauwe) fluorescerende cellen om het aantal geïsoleerde tumorcellen te berekenen.
      OPMERKING: Niet-blauwe GFP-negatieve cellen zijn waarschijnlijk normale, niet-maligne T-cellen en mogen niet worden geteld. Er zijn minstens 2 x 106 cellen nodig om de cellen te vleken met Hoechst 33342.

2. De fluorescente gelabelde T-ALL cellen met Hoechst 33342 plakken om de zijbevolking te identificeren

  1. Verdun Hoechst 33342 1:10 met nuclease-vrije H20 om de werkzame concentratie van 1 mg / ml te maken. Bewaar de kleurstof bij 4 ° C en in het donker.
  2. Bereid een 100 mM oplossing van verapamil door 49,1 mg in 1 ml dimethylsulfoxide (DMSO) op te lossen.
    OPMERKING: Verapamil is een remmer van ABC transporters en is een belangrijke controle voor side population experimenten. verapamil toevoegen aan monsters van het vermogen van de ABC-transporters om de Hoechst 33342 kleurstof uitstromen te remmen. Daarom zal een echte side population verdwijnen wanneer verapamil wordt toegevoegd aan het monster.
  3. Stel een waterbad tot 28 ° C.
  4. Bereid monsters en controles in het donker door het toevoegen van cellen en oplossingen voor fluorescentie geactiveerde celsorteerder (FACS) buizen.
    1. Bereid de monsters door 10 6 cellen, 15 pl 1 mg / mL Hoechst 33342 en 2,5 pl van DMSO tot een FACS buis. Stel het volume met 1 ml FBS / PBS.
    2. Bereid de controles door 10 6 cellen, 15 pl 1 mg / mL Hoechst 33342 en 2,5 pl 100 mM verapamil een FACS buis. Stel het volume met 1 ml FBS / PBS.
      OPMERKING: Minimaal 10 6 cellen / monster wordt aanbevolen, maar kleuren meer cellen de voorkeur, vooral als de zijde populatIonencellen worden gesorteerd voor verdere analyse. Niet meer dan 10 6 cellen / ml, en behoud de Hoechst 33342 concentratie bij 15 μg / ml. Als 10 x 106 cellen worden gekleurd, is het totale reactievolume 10 ml.
  5. Incubeer in een 28 ° C waterbad in het donker gedurende 120 minuten.
  6. Na de incubatie plaats de cellen onmiddellijk op ijs en houd ze in het donker.
  7. Pellet de cellen bij 4 ° C gedurende 6 min bij 300 x g. Verwijder de supernatant. Was met 1 ml FBS / PBS.
  8. Pellet de cellen bij 4 ° C gedurende 6 min bij 300 x g. Verwijder de supernatant. Resuspendeer de cellen in 1 ml FBS / PBS.
  9. Blijf bij 4 ° C tot cel sorteren.
  10. 15 minuten voorafgaand aan celsortering, voeg 2 μL propidiumjodide (PI) -voorraad (1 mg / ml) toe aan elke 1 ml FBS / PBS (uiteindelijke concentratie: 2 μg / ml). Goed mengen.

3. Gebruik FACS om de zijbevolking te vinden binnen de Fluorescently Labeled T-ALL Cell Population

  1. Analyseer de gekleurde zebravis T-ALL celsuspensies Op een celsorteerder voorzien van een UV-laser voor Hoechst 33342 kleurstof excitatie en een 488 nm laser voor PI excitatie en voor detectie van GFP + T-ALL-cellen.
  2. Bepaal een poort voor de live, GFP + T-ALL-cellen.
    1. Gebruik voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) vlak voor de poort puin.
      LET OP: FSC wordt gebruikt om celgrootte te onderscheiden en SSC wordt gebruikt om de granulariteit van de cel te onderscheiden.
    2. Gebruik FSC en SSC breedte doubletten discrimineren.
      OPMERKING: Er zijn drie componenten die door de stromingscytometer detectoren: gebied, hoogte en breedte. De omgeving wordt meestal gebruikt om de fluorescentie van de cel te meten. Breedte meet de vluchttijd en tweemaal zo groot als twee cellen elkaar zijn samengeklonterd.
    3. Voor levende tumorcellen, trek een hek rondom de cellen positief voor GFP en negatief voor PI met de juiste detectoren (bijvoorbeeld FITC voor GFP en PerCP Cy5-5 PI).
  3. In de live-cell gate, het meten van de Hoechst 33342 fluorescentie door de Hoechst Blue en Hoechst Red banddoorlaatfilters (450/50 en 670/30, respectievelijk).
    OPMERKING: De side population, indien aanwezig, zal duidelijk zijn nadat deze is ingesteld. Van belang is dat de side population verdwijnen in de controle verapamil, zodat zij beschouwd worden als een echte side population.
  4. Wanneer het sorteren van de kant populatie cellen voor verdere experimenten gebruikt grote mondstukpunt (100 pm) en het verzamelen van de cellen in een FACS buis met 3 ml 100% FBS. Met een grotere mondstukpunt (100 um) in plaats van het kleinere uiteinde (70 urn) tot cellevensvatbaarheid after sortering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Efficiënt genereren van fluorescentie-myc-geïnduceerde T-ALL tumoren in zebravis, circulaire DNA-constructen geflankeerd door tol2 transposase sites kunnen gelijktijdig worden geïnjecteerd met tol2 RNA. Eerdere studies uit de injectie van gelineariseerd DNA in zebravis embryo's verslag van een 5% transgenese tarief 8. Het protocol aangepast tol2-gemedieerde transgenese omvatten, kunnen transgenese variërend 10-44% worden waargenomen (tabel 1)....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De zijbevolkingsassay is zeer gevoelig; Daarom kunnen kleine wijzigingen in het protocol leiden tot problemen bij het detecteren van zijbevolkingscellen. Ten eerste is de temperatuur tijdens de kleuringstap specifiek voor elk dier / celsysteem. Voor zoogdier systemen wordt de zijkantbevolkingsassay typisch uitgevoerd bij 37 ° C2. Wanneer de zebravis T-ALL-cellen werden geïncubeerd bij 37 ° C, sterven veel van de cellen, waardoor deze incubatietemperatuur onaanvaardbaar was (data niet getoond). Toen Kobayashi en collega&...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het College van Vrouwen van de Universiteit van Chicago, het Wendy Will Case Fund, en de Universiteit van Chicago Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30 CA014599). We willen de Flow Cytometry Core aan de Universiteit van Chicago bedanken voor hun hulp bij het opzetten van dit experiment, evenals andere leden van de de Jong Lab, met name Leslie Pedraza en Sean McConnell.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Syngeneic zebrafish (CG2)Zie Mizgireuv et al., 2006
rag2:c-myc plasmidLangenau Laboratory
rag2:GFP plasmid geconstrueerd in de Jong Labrag2 promotor van Langenau Laboratory
pCS2-transposase plasmidChien Laboratory
NotI -HF restrictie-enzymNew England Bio-Labs Inc.R3189S500 units in 25 µL
mMessage Machine SP6 Transcriptie KitAmbionThermo Fisher Scientific - AM134025 reacties
QIAGEN Plasmid Midi KitQiagen, Inc.12643
SteREO Discovery V8 MicroscoopCarl Zeiss Microscopy495015-0008-000
Digitale micro-injectorTritech ResearchMINJ-D
Messing recht-arm naaldhouderTritech ResearchMINJ-4
Magneetbasis en standaardTritech ResearchMINJ-HBMB
MicromanipulatorNarishige InternationalMN153
Glazen capillairenSutter Instrument Co.B100-50-1010 cm zonder filament
Flaming/Brown micropipettrekkerSutter Instrument Co.P-97
Microloader pipettenpuntenEppendorf North America Inc.930001007
Phenol Red oplossingSigma Life ScienceP02900,5% concentratie 100 mL
Kunststof Transfer pipettenFisherbrand137119Dgegradueerde 7,5 mL kop
Tricaine methaansulfonaat (MS-222)Western Chemical, Inc.Fisher Scientific - NC0342409100 g
Fetaal bovien serum (FBS)HyClone Laboratories, Inc.Fisher Scientific - SH3007103500 mL
Fosfaat-Buffered Saline (PBS)Gibco by Life Technologies1001-023pH 7,4 (1x) - 500 mL
Heparine natriumzoutSigma-Aldrich210615 - 300 eenheidsflacons
40 µm maasfilterFalcon Corning Brand352340Doos van 50
Trypan blauwSigma Life ScienceT815420 mL - Oplossing (0,4%)
Hoechst 33342Life TechnologiesH357010 mL
VerapamilSigma Life ScienceV46291 g
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma Life ScienceD8418100 mL
Propidium JodideLife TechnologiesP356610 mL
FACSAria Fusion celsorteerderBD Biosciences
BD FACSDiva 8.0.1BD Biosciences
FlowJo v10.2FlowJo, LLC

Referenties

  1. Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
  2. Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).
  3. Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
  4. White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
  5. Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).
  6. Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties. Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).
  7. Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299, 887-890 (2003).
  8. Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. , e2790(2011).
  9. Martelli, A. M., et al. Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells. Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).
  10. Smith, A. C. H., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
  11. Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation. Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).
  12. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
  13. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
  14. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  15. Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
  16. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregan Press. (1993).
  17. Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).
  18. Komuro, H., et al. Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines. J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).
  19. Moshaver, B., et al. Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia. Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

FlowcytometrieHoechst 33342Zebravis T ALLkankerstamcellencelisolatiefluorescentie geactiveerde cel sorteringverapamil inhibitiepropidiumjodideT celleukemie

Gerelateerde artikelen