Isolatie Murine vetweefsel afgeleide microvasculaire fragmenten als Vascularisatie eenheden voor Tissue Engineering

Samenvatting

Wij presenteren een protocol voor vetweefsel afgeleide microvasculaire brokken belovend vascularisatie eenheden vertegenwoordigen isoleren. Ze kunnen snel worden geïsoleerd, vereisen geen in vitro verwerking en kunnen aldus worden gebruikt voor één-stap prevascularization op verschillende gebieden van weefselengineering.

Samenvatting

Een functionele microvasculaire netwerk van centraal belang voor de overleving en integratie van gemanipuleerde weefselconstructen. Voor dit doel zijn verscheidene angiogene en prevascularization strategieën vastgesteld. De meeste cel-gebaseerde benaderingen omvatten tijdrovende stappen in vitro voor de vorming van een microvasculaire netwerk. Ze zijn daarom niet geschikt voor intraoperatieve eenstaps werkwijzen. Vetweefsel afgeleide microvasculaire fragmenten (ad-MVF) vertegenwoordigen veelbelovende vascularisatie eenheden. Ze kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd uit vetweefsel en vertonen een functionele microvaatje morfologie. Bovendien zijn ze snel weer in elkaar in nieuwe microvasculaire netwerken na implantatie in vivo. Daarnaast zijn er ad-MVF aangetoond dat lymfangiogenese induceren. Tenslotte ze een rijke bron van mesenchymale stamcellen, die verder kunnen bijdragen tot hun hoge vascularisatie potentieel. In eerdere studies hebben we de opmerkelijke vascularizati aangetoondop de capaciteit van de ad-MVF in engineered bot en huid substituten. In de huidige studie, doen we verslag van een gestandaardiseerd protocol voor de enzymatische isolatie van ad-MVF uit muizen vetweefsel.

Inleiding

Weefselmanipulatie is gericht op de vervaardiging van weefsels en organen vervangingsmiddelen die de functie van inoperabele handhaven herstellen of versterken in vivo tegenhangers ^{1, 2.} Het lot van gemanipuleerde weefselconstructen cruciaal afhangt van een adequate vascularisatie ^3. Microvasculaire netwerken binnen deze constructies moeten hiërarchisch worden georganiseerd met kleine slagaders, haarvaten en venulen efficiënte doorbloeding na inoculatie aan het vaatstelsel van de ontvanger ⁴ mogelijk te maken. Het genereren van dergelijke netwerken is een van de belangrijkste uitdagingen in tissue engineering. Voor dit doel heeft een breed spectrum van experimentele vascularisatie strategieën geïntroduceerd in de afgelopen twee decennia ^{5, 6.}

Angiogene benaderingen stimuleren de ingroei van de ontvanger microvaten in gemanipuleerde tissUES via structurele of fysicochemische modificatie stellage, zoals de opname van groeifactoren ^7. Echter, voor de vascularisatie van grote driedimensionale constructies, angiogenese-afhankelijke strategieën sterk beperkt door de langzame groei van het ontwikkelen van microvaten ^8.

Daarentegen het begrip prevascularization richt voor het genereren van functionele microvasculaire netwerken binnen weefselconstructen vóór de implantatie ^9. Gebruikelijke prevascularization omvat de co-kweek van vat vormende cellen, bijvoorbeeld endotheelcellen, mural cellen of stamcellen ¹⁰ binnen steigers. Na de vorming microvasculaire netwerk, kan de prevascularized constructen vervolgens worden geïmplanteerd in weefseldefecten. Opmerkelijk, dit prevascularization aanpak is moeilijk toe te passen in een klinische setting, omdat het is gebaseerd op complexe en tijdrovende in vitro </ em>, welke zijn beperkt door grote obstakels in de regelgeving ^9. Derhalve is er nog steeds behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe prevascularization strategieën die meer geschikt zijn voor een brede klinische toepassing zijn.

Prevascularization dergelijke strategie kan de toepassing van vetweefsel afgeleide microvasculaire fragmenten (ad-MVF) zijn. ad-MVF vertegenwoordigen krachtige vascularisatie eenheden die in grote hoeveelheden uit het vetweefsel van ratten ^{11, 12} en ¹³ muizen worden geoogst. Ze bestaan uit arteriolaire, capillaire en venulaire vat segmenten die een fysiologisch microvaatje morfologie vertonen met een lumen en stabiliserende perivasculaire cellen ^{14, 15.} Deze unieke functie kan de onmiddellijke implantatie van ad-MVF geplaatste steigers in het weefsel gebreken zonder precultivation. Er is de ad-MVF snel weer in elkaar inom functionele microvasculaire netwerken. Bovendien ad-MVF vormen een rijke bron van mesenchymale stamcellen ^16, die bovendien kunnen bijdragen tot hun opvallende regeneratievermogen. Dienovereenkomstig worden ad-MVF meer gebruikt in verschillende gebieden van weefselengineering ^{14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.}

De isolatie van ad-MVF is oorspronkelijk opgericht in ratten ^{11, 12.} Hierin beschrijven we een protocol, dat de gestandaardiseerde isolatie van muizen ad-MVF maakt van epididymale vetkussentjes. Dit kan verder inzicht in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan ad-MVF functie door het gebruik van transgene muismodellen te bieden.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd volgens de National Institute of richtlijnen Health voor het gebruik van proefdieren en volgde institutionele richtlijnen (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Saarbrücken, Duitsland).

1. Bereiding van chirurgische instrumenten

1. Houden om de dissectie scharen, chirurgische pincet, kleine bereiding scharen, fijne pincet en een steriele Petrischaal met 15 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM, 10% foetaal kalfsserum (FCS), 100 U / ml penicilline, 0,1 mg / ml streptomycine ) voor het oogsten epididymale vetkussentjes.
2. Bloot chirurgische instrumenten om een ​​desinfecterende oplossing gedurende 5 min. Alternatief steriliseren (stoomsterilisatie, 121 ° C, 20 min).

2. Dieren en anesthesie

1. Kies zorgvuldig de stam van de muizen, zoals aangegeven voor de studie en de onderwerp in onderzoek.
   LET OP: In deze studie hebben we gebruik gemaakt mannelijke wild-type C57BL / 6-muizen als donor voor het oogsten van epididymale vet. Van belang is kan ad-MVF ook worden geïsoleerd uit transgene green fluorescent protein (GFP) -positieve donor dieren (C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) 1Osb / J) ^22. Dit draagt het grote voordeel dat de fragmenten gemakkelijk door immunohistochemische kleuring van GFP na implantatie in GFP-negatieve wild-type muizen ^14.
2. Verdoven dieren een intraperitoneale injectie van xylazine (15 mg / kg) en ketamine (75 mg / kg). Zorg ervoor dat de dieren diep verdoofd door het uitvoeren van een teen knijpen met geen antwoord. smeermiddel oog wordt niet aangeduid als donordieren worden gedood na vetafname.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat analgesie en chirurgische steriliteit zijn in overleg met de betrokken richtlijnen van het land en de instelling waaraan de experimenten zijn gepland.

le "> 3. Het oogsten van Epididymal vetkussentjes

1. Breng het dier naar een operatietafel. Plaats het dier in liggende positie onder een chirurgische stereomicroscoop en bevestig diepe anesthesie met behulp van teen knijpen.
2. Blokkeer de poten met tape op een chirurgisch laken en desinfecteren de buik met desinfecterende oplossing.
3. Scheid de buikhuid vrij van het onderliggende spierlaag met dissectie scharen.
4. Voer een middellijn laparotomie met dissectie scharen en zijdelings vouw de flappen van de buikwand.
5. Bilateraal identificeren testis, epididymis en de epididymis vetkussentje met de fijne pincet (Figuur 1). Niet schadelijk voor de intestinale structuren om fecale besmetting van de vetkussentjes te voorkomen.
6. Oogst de epididymale vetkussentjes met de kleine voorbereiding schaar en de fijne tang onder de stereomicroscoop. Houd een veiligheidsmarge van enkele mm tussen de bijbal en het vetverminderen het risico van accidentele epididymis oogsten.
   LET OP: Deze procedure kan ook worden uitgevoerd zonder een stereomicroscoop. Echter, dit kan verder het risico van ongewilde verwondingen van de bijbal en zaadstrengen verhogen.
7. Breng de epididymale vetkussentjes in een petrischaal met 15 ml DMEM voorverwarmd bij 37 ° C gedurende het transport naar het laboratorium cel.
8. Offeren dierlijke insnijding van de abdominale aorta of cervicale dislocatie.

4. Isolatie van ad-MVF

1. Bereid drie steriele petrischalen met 15 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), steriele 14 mL polypropyleen (PP) buizen een steriele 50-mL Erlenmeyer steriele 1,5 mL conische microcentrifugebuizen en gesteriliseerd fijne schaar.
2. Was de vetkussentjes driemaal in petrischalen met 15 ml PBS onder een laminaire stroming kap.
3. Breng het vet in een 14 ml buis PP. Bepaal de hoeveelheid geoogste vetweefsel (in mL) met behulp van tHij buis schaal. Gehakt het vetweefsel mechanisch met een fijne schaar tot een homogene weefselsuspensie wordt verkregen.
4. Transfer gehakt weefsel met twee volumina collagenase NB4G (0,5 U / ml PBS) in een 50-mL erlenmeyer met behulp van 10 ml pipet meten. Het totale volume wordt driemaal het volume van vetweefsel gemeten in stap 4.3. Voeren omzetting van weefsel in een incubator gedurende 10 min onder krachtig roeren door middel van een geautomatiseerd roerder (grootte van magnetische roerstaaf: 25 mm) bij 37 ° C en vochtige atmosferische omstandigheden met 5% _CO2.
5. Zich aan een kleine fractie (10 pi) van het gedigereerde weefsel onder een microscoop te beoordelen of de vertering kan worden. Nagaan of het digestaat bevat voornamelijk "vrije" ad-MVF naast enkele cellen, wat aangeeft het juiste punt op de enzymatische vertering (figuur 2) te stoppen.
   OPMERKING: Deze stap vereist ervaring met de procedure en is cruciaal voor de kwaliteitvan geïsoleerde ad-MVF. Langdurige vertering van vet resulteert in een single-cell suspensie zonder ad-MVF.
6. Neutraliseer het enzym met twee volumina PBS / 20% FCS. Het totale volume wordt driemaal het volume van de suspensie cel-vat in stap 4.4. Breng de cel-suspensie vat terug in nieuwe pp buizen.
7. Incubeer de suspensie gedurende 5 minuten bij 37 ° C tot ad-MVF scheiden van achtergebleven vet door zwaartekracht. Verwijder voorzichtig de fat supernatant met 1 mL precisiepipet. Herhaal deze cyclus meerdere malen met een 100-ul precisiepipet tot de suspensie lijkt vetvrij zijn.
8. Zet een 500 pm filter op een 50-ml conische centrifugebuis. Breng de cel-suspensie vat met 10 ml pipet meten van het 14-mL PP buizen op het filter membraan achtergebleven vet stolsels te verwijderen. Breng de gefilterde suspensie in nieuwe 14-mL PP buizen naar het aantal individuele ad-MVF isoleert de geplande experimenten.
   LET OP: Voor in vitro assays gericht op de vorming van microvasculaire netwerk kan het gunstig zijn om verder te zuiveren van de cel-suspensie vat de beeldkwaliteit bij microscopische analyse te verbeteren. Daartoe kan de suspensie worden bovendien eenmaal gefilterd met een 20 urn filter om enkele cellen van de ad-MVF verzameld op het filter te verwijderen.
9. Centrifugeer de cel-suspensie vat (600 xg, 5 min, kamertemperatuur) om een ​​pellet die ad-MVF verkrijgen.
10. Na centrifugeren de bovenstaande vloeistof tot 1 ml overblijft. Resuspendeer de pellet met ad-MVF in deze 1 ml en breng de suspensie in een 1,5-ml conische microcentrifugebuis.
11. Centrifugeer de ad-MVF suspensie in de microcentrifugebuis (600 xg, 5 min) om een ​​pellet te verkrijgen.
12. Verwijder het supernatant van de pellet in de vereiste uiteindelijke volume van PBS / 20% FCS hersuspenderen.
    OPMERKING: Het aantal ad-MVF per isolaat kan worden beoordeeld door microscopisch tellen. Voor dit doel, 1/10 van de uiteindelijke cel-vessel suspensie wordt verdund 1:10 in PBS en 100 pi van deze verdunning wordt overgebracht in een putje van een plaat met 96 putjes. Het gehele aantal ad-MVF vertoont een vat morfologie wordt vervolgens geteld en geëxtrapoleerd naar de gehele isolaat. De vereiste ad-MVF concentratie en zuivering kan individueel worden afgestemd op de betreffende in vitro of in vivo toepassing van de ad-MVF. Dit kan de inbedding van ad-MVF collageen gels voor de in vitro analyse van de vorming microvasculaire netwerk of het enten van ad-MVF op draagstructuren voor in vivo implantatie in weefseldefecten.

Resultaten

In dit onderzoek voerden we zes ad-MVF isolatie procedures vetweefsel van 7- tot 12-maanden oude mannelijke wild-type C57BL / 6 muizen (gemiddeld lichaamsgewicht: 35 ± 1 g). Figuur 1 toont het oogsten van murine epididymaal vetkussentjes latere mechanische en enzymatische ad-MVF isolatie. De tijd die nodig is voor het oogsten van vet was 30 minuten en voor de isolatie van ad-MVF bedroeg 120 min. In totaal heeft de procedure duurde 150 minuten.

Discussie

In deze studie presenteren we een gevestigde protocol voor de isolatie van ad-MVF. Het verkrijgen van ad-MVF uit muizen vetweefsel is een eenvoudige procedure met een paar kritische stappen. Muizen vertonen verschillende subcutane en intra-abdominale vet. Zoals eerder beschreven voor ratten, de meest geschikte vetbron voor de isolatie van ad-MVF de epididymale vetkussentjes door hun omvang, homogene structuur en minimale verontreiniging met grotere bloedvaten ^{11, 12.<...}

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5-mL conical microcentrifuge tube	VWR, Kelsterbach, Duitsland	700-5239
100-µL precision pipette	Eppendorf, Hamburg, Duitsland	4920000059
10-mL measuring pipette	Costar, Corning Inc., New York, USA	4488
14-mL PP tubes	Greiner bio-one, Frickenhausen, Duitsland	187261
1-mL precision pipette	Eppendorf, Hamburg, Duitsland	4920000083
500-µm filter (pluriStrainer 500 µm)	HISS Diagnostics, Freiburg, Duitsland	43-50500-03
50-mL conical centrifuge tube	Greiner bio-one, Frickenhausen, Duitsland	227261
50-mL Erlenmeyer flask	VWR, Kelsterbach, Duitsland	214-0211
96-well plate	Greiner bio-one, Frickenhausen, Duitsland	65518
cell detachment solution (Accutase)	eBioscience, San Diego, CA USA	00-4555-56
C57BL/6 mice	Charles River, Cologne, Duitsland	027
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA	003291
CD117-FITC	BD Biosciences, Heidelberg, Duitsland	553373
CD31-PE	BD Biosciences, Heidelberg, Duitsland	553354
Collagenase NB4G	Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Duitsland	17465.02	Lot tested by manufacturer for enzymatic activity
Dissection scissors	Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Duitsland	BC 601
DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342)	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Duitsland	B2261
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	PAN Biotech, Rickenbach, Duitsland	P04-03600
Fetal calf serum (FCS)	Biochrom GmbH, Berlin, Duitsland	S0615
Fine forceps	S&T AG, Neuhausen, Zwitserland	FRS-15 RM-8
Fine scissors	World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA	503261
Dermal skin substitute (Integra)	Integra Life Sciences, Sain Priest, Frankrijk	62021
Ketamine	Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Duitsland	7005294
M-IgG2akAL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-4724-80
Octeniderm (disinfecting solution)	Schülke & Mayer, Norderstedt, Duitsland	118211
Penicillin/Streptomycin	Biochrom, Berlin, Duitsland	A2213
Petri dish	Greiner bio-one, Frickenhausen, Duitsland	664160
Phosphate-buffered saline (PBS)	Lonza Group, Basel, Zwitserland	17-516F
pluriStrainer 20-µm (20 µm filter)	HISS Diagnostics, Freiburg, Duitsland	43-50020-03
Rat-IgG2akFITC	BD Biosciences, Heidelberg, Duitsland	553988
Rat-IgG2akPE	BD Biosciences, Heidelberg, Duitsland	553930
Small preparation scissors	S&T AG, Neuhausen, Zwitserland	SDC-15 R-8S
Surgical forceps	Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Duitsland	BD510R
Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm	Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Duitsland	1671801
Xylazine	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Duitsland	1320422
α-SMA-AL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-9760-82	Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Duitsland; #554722)