Murine Korte As Ventriculaire Hartschijven voor Elektrofysiologische Studies

Samenvatting

Hier beschrijven we de voorbereiding van levensvatbare ventriculaire plakjes van volwassen muizen en hun gebruik voor scherpe elektrodeactiepotentiële opnamen. Deze multicellulaire preparaten leveren een geconserveerde in vivo weefselstructuur, waardoor ze in vitro een waardevol model vormen voor elektrofysiologische en farmacologische studies.

Samenvatting

Murine cardiomyocyten zijn uitgebreid gebruikt voor in vitro studies van hartfysiologie en nieuwe therapeutische strategieën. Echter, multicellulaire preparaten van gedissocieerde cardiomyocyten zijn niet representatief voor de complexe in vivo structuur van cardiomyocyten, niet-myocyten en extracellulaire matrix, die zowel mechanische als elektrofysiologische eigenschappen van het hart beïnvloedt. Hier beschrijven we een techniek om levensvatbare ventriculaire plakjes volwassen muisharten te bereiden met een behoud van in vivo weefselstructuur en hun geschiktheid voor elektrofysiologische opnamen aan te tonen. Na afscheiding van het hart worden ventrikels gescheiden van de atria, geperfumeerd met Ca2 ⁺ -vrije oplossing die 2,3-butaandionmonoxime bevat en ingebed in een 4% laagsmelt agarose blok. Het blok is op een microtome geplaatst met een trillend mes en weefselschijfjes met een dikte van 150-400 μm zijn bereid om de vibratie vrij te houdenFrequentie van het mes bij 60-70 Hz en beweeg het mes zo langzaam mogelijk naar voren. De dikte van de plakjes hangt af van de verdere toepassing. Plakjes worden opgeslagen in ijskoude Tyrode's oplossing met 0,9 mM Ca ²⁺ en 2,3-butandiolmonoxime (BDM) gedurende 30 minuten. Daarna worden plakken over 30 minuten overgebracht naar 37 ° C DMEM om de BDM uit te spoelen. Plakjes kunnen worden gebruikt voor elektrofysiologische studies met scherpe elektroden of micro-elektrode arrays, voor krachtsmetingen om contractiele functie te analyseren of om de interactie van getransplanteerde stamcel-afgeleide cardiomyocyten en gastheerweefsel te onderzoeken. Voor scherpe elektrode opnames wordt een plak in een 3 cm celcultuurschotel geplaatst op de verwarmingsplaat van een omgekeerde microscoop. De plak wordt gestimuleerd met een unipolaire elektrode, en intracellulaire actiepotenties van cardiomyocyten in de plak worden opgenomen met een scherpe glaselektrode.

Inleiding

Weefselschijfjes zijn vaak gebruikt in de basiswetenschap, aangezien Yamamot en Mcllwain in 1966 toonden dat de elektrische activiteit van hersenschijfjes in vitro ¹ wordt behouden. Sindsdien zijn elektrofysiologische en farmacologische studies uitgevoerd op plakjes van hersenen ² , lever ³ , long ⁴ en myocardiaal weefsel ^{5 , 6 , 7} . Eerste patch-clamp opnames in ventriculaire plakjes van neonatale rat harten werden beschreven in 1990 ⁸ , maar deze techniek viel al een tijdje in vergetelheid. Meer dan een decennium later vestigde onze groep een nieuwe methode om muizen embryonale ⁹ , neonatale ¹⁰ en volwassen ¹¹ hartschijven te bereiden. Deze levensvatbare weefselplakken kunnen worden gebruikt voor acute experimenten (volwassen plakS kunnen meerdere uren worden gekweekt) of korte-termijncultuur experimenten (embryonale en neonatale plakjes kunnen enkele dagen worden gekweekt). Plakjes tonen in vivo zoals elektrofysiologische kenmerken en een homogene excitatieverspreiding zoals beoordeeld door scherp elektrode-actiepotentieel en micro-elektrode-opnamen ¹¹ . Door hun "tweedimensionale" morfologie bieden ze rechtstreekse toegang tot opnameelektroden aan alle gebieden van de ventrikel, waardoor ze een interessant instrument zijn voor elektrofysiologische onderzoeken en nieuwe experimentele opties opbouwen in vergelijking met Langendorff-perfuse gehele harten. Drugrespons van de plakjes naar ionenkanaalblokkers zoals verapamil (L-type Ca ²⁺ -kanaalblokker), lidocaïne (Na ⁺ -kanaalblokker), 4-aminopyridine (niet-selectieve spanningsafhankelijke K ⁺ -kanaalblokker) en linopirdine (KCNQ K ⁺ -kanaalblokkeraar) ^{9 , 11} correspondeerde met bekende effecten op gedissocieerde cardiomyocyten. Isometrische krachtmetingen onthulden een positieve krachtfrequentieverhouding en stelden sterk intacte contractiele functie ^{10 voor} . Deze bevindingen aangetoond dat murine ventriculaire plakjes geschikt zijn als een in vitro weefselmodel voor fysiologische en farmacologische studies. Bovendien zijn ventriculaire snijpunten van ontvanger harten in combinatie met scherpe elektrode opnames een zeer behulpzaam hulpmiddel om elektrische en mechanische integratie te identificeren, evenals rijping van transplantaat van ^{12 , 13 , 14} en stamcellen afgeleide ¹⁵ cardiomyocyten.

Samenvattend zijn ventriculaire plakjes een waardevol en goed vast te stellen multicellulair weefselmodel en moeten beschouwd worden als complementair aan gedissocieerde cardiomyocyten en Langendorff-geperfuseerde hartenIn het hart- en vaatonderzoek, met het grootste voordeel van het leveren van een in vivo- weefselstructuur (in tegenstelling tot dissociatiecellen), evenals de directe toegang van meettechnologieën zoals scherpe elektrodeopnamen naar alle hartstreken (in tegenstelling tot hartpreparaten).

Protocol

Dierbehandeling moet voldoen aan de richtlijnen van het lokale dierenwelzijnscomité en aan de Richtlijn 2010/63 / EU van het Europees Parlement.

1. Bereid Oplossingen voor

1. Bereid de oplossing van Tyrode zonder Ca ²⁺ (samenstelling in mM): NaCl 136, KCl 5.4, NaH ₂ PO ₄ 0,33, MgCl ₂ 1, glucose 10, HEPES 5, 2,3-butandiolmonoxime (BDM) Met NaOH bij 4 ° C.
2. Bereid Tyrode's oplossing met Ca2 ⁺ (samenstelling in mM): NaCl 136, KCl 5.4, NaH2P04 0,33, MgCl2 1, glucose 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl2 0,9. Pas de pH aan op 7,4 met NaOH bij 4 ° C.
3. Bereid 4% low-melt agarose: Zet 0,6 g laagsmelt agarose in 15 ml Tyrode's oplossing zonder Ca ²⁺ . Verhit het mengsel tweemaal bij 750 W gedurende 10-15 s tot de agarose opgelost is. Houd de oplossing bij een constante temperatuur van 37 &# 176; C en roer continu.
4. Bewaar Dulbecco's Gemodificeerde Eagle Medium (DMEM) zonder serum bij 37 ° C met carbogen (5% CO ₂ , 95% O ₂ ) geborreld.

2. Bereid de Microtome voor

1. Schakel de microtome in.
2. Vul de buitenste microtoomkamer met ijs.
3. Vul de innerlijke microtoomkamer met ijskoude Tyrode's oplossing zonder Ca ²⁺ en zet de oplossing voortdurend met 100% O ₂ .
4. Plaats een stalen mes in de meshouder van de microtome.

3. Muis Hart Isolatie

1. Injecteer 2.500 U heparine subcutaan. Wacht 15 minuten.
2. Offer het dier door cervicale dislocatie.
3. Open de borst door sternotomie.
4. Ontleed het pericardium zorgvuldig met behulp van een kleine schaar en een tang # 5.
5. Plaats een canule in de oplopende aorta en vul de kransslagaders in situ met ijskoude Tyrode'sOplossing zonder Ca ²⁺ tot het resterende bloed wordt verwijderd.
6. Zet het hart voorzichtig met een tang en een schaar en verplaats het hart in ijskoude Tyrode's oplossing is gereden zonder Ca ²⁺ .
7. Scheep de atria uit de ventrikels met een scalpel of een schaar.

4. Inbedding van de ventrikels in 4% Low-Melt Agarose

1. Plaats de ventrikels met de top naar boven in de agarosevorm ( Figuur 1 ). Plaats de pen in het midden van de mal in de linker ventrikelkamer.
2. Vul de mal met 4% lage smelt agarose bij 37 ° C tot het hart volledig is bedekt.
3. Leg de mal op ijs voor een snellere verharding van de agarose die het drijven van het weefsel voorkomt.
4. Verwijder het agarose blok dat de ventrikels uit de mal met een scalpel bevat.
5. Draai het blok ondersteboven en vul ventriculaire kamers en de spleet op de achterkant van het agarose blok, welke ikS gelaten door de speld van de molt, met 4% laagmelt agarose met behulp van een injectiespuit met een 20 G-naald.
6. Trim het agarose blok met een scalpel om een ​​platte bodem van het blok te bereiken en de rechtopstand van de harttap.

5. Snijden van de ventriculaire weefsel

1. Bevestig het blok op de specimenhouder van de microtome met een druppel cyanoacrylaatlijm. Ga naar de harttoppen omhoog.
2. Plaats de monsterhouder in de binnenste kamer van de microtome, die gevuld is met ijskoude Tyrode zonder Ca ²⁺ . Dek het agarose blok volledig met Tyrode's oplossing.
3. Bereid kortgesneden plakken met een dikte van 150-400 μm, afhankelijk van de verdere toepassing (voor scherpe elektrode opnames 150-200 μm), houd de trillingsfrequentie van het mes bij 60-70 Hz en beweeg het mes zo langzaam mogelijk naar voren .
4. Gebruik een fijne poets om de resterende agarose zorgvuldig uit de plakken te verwijderen.
5. Voorzichtig transfeR plakjes met een Pasteur pipette in de Tyrode oplossing met 0,9 mM Ca ²⁺ belucht met 100% O ₂ en houd ze gedurende tenminste 30 minuten op ijs om ze te herstellen uit de snijprocedure.
6. Daarna houd u 30 minuten schijfjes in DMEM bij 37 ° C, beluchten met carbogen, om BDM uit te spoelen voor verder gebruik.

6. De Sharp Electrode Setup voorbereiden

1. Voor voorverwarming, schakel alle elektrische apparaten 30 minuten in voordat de opnames starten.
2. Zet een 3 cm celcultuurschotel op de verwarmingsplaat geplaatst op de omgekeerde microscoop.
3. Plaats de op maat gemaakte ringelektrode (afbeelding 2 ) in de schotel en verbind de aardkabels van de voorversterker en de stimulatie-elektrode.
4. Sluit de flexibele buizen van het perfusiesysteem aan op de schotel.
5. Vul het reservoir van het perfusiesysteem met DMEM, belicht met carbogen.
6. Schakel de perfusiepomp in en zet de perfusie-raTe 2-3 ml / min.
7. Stel de temperatuur van DMEM in het gerecht op tot 37 ° C door de stookverwarming en de verwarmingsplaat te regelen.

7. Actieve potentiële opnames

1. Plaats een ventrikelschijf in de DMEM-vulling.
2. Controleer de structurele integriteit en levensvatbaarheid (gebaseerd op contractiele functie) van het weefsel met de omgekeerde microscoop.
3. Vul een opnameglaselektrode met 3 M KCL.
4. Vul een stimulatie-elektrode met DMEM.
5. Plaats de opnamelektrode en de stimulatieelektrode op de elektrodenhouders.
6. Plaats de stimulatie-elektrode zorgvuldig op de plak en zet de elektrische stimulator aan. Begin met een stimuleringsfrequentie van 1-2 Hz.
7. Verplaats de opnamelektrode met de micromanipulator over de beoogde opname positie.
8. Laat de opnameelektrode langzaam zakken tot de punt het weefsel raakt.
9. Breng een korte rechthoekige elektrische puls door deOpname elektrode om het celmembraan te penetreren.
10. Zet de opnameelektrode voorzichtig terug totdat een stabiel signaal is gewaarborgd.
11. Begin met opname van actiepotenties.

Resultaten

Myocardinfarct leidt tot een vrijwel onomkeerbaar verlies van cardiomyocyten. Celvervangende therapie met behulp van stamcellen afgeleide cardiomyocyten voor exogene hartregeneratie is een veelbelovende therapeutische aanpak. Elektrische integratie en rijping van de getransplanteerde cellen zijn cruciaal voor de veiligheid en efficiëntie van celvervangende therapie.

Om integratie en rijping te beoordelen, hebben we getransplan...

Discussie

Ventriculaire plakjes maken elektrofysiologische, farmacologische en mechanische studies mogelijk met een behouden in vivo weefselstructuur en directe toegang van de meettechnologie naar alle regio's van het hart. Fysiologische actiepotentieel eigenschappen zijn aangetoond in embryonale, neonatale en volwassen plakjes ^{9 , 10 , 11} . De vitaliteit van de plakjes, behalve de oppervlaktelagen die direct beschadigd zijn...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Leica VT 1000s	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany		Microtoom met trillende mes.
Roestvrijstalen mesjes	Campden Instruments, Loughborough, England	7550-1-SS
Pasteurpipetten	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	Z627992
Fijne borstel, bijv. maat 6 (4/32")	VWR, International, Radnor, USA	149-2125
Voorbereidingstafel			zelf gemaakt
Molt voor het inbedden van ventrikels in agarose			zelf gemaakt
1 mL-spuiten	Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA	300013
27 G x 3/4`` naalden	Braun, Melsungen, Germany	4657705
20 G 11/2`` naalden	4657519
Kleine schaar	WPI, Sarasota, USA	501263
Pincet #5, 0.1 x 0.06 mm tip	WPI, Sarasota, USA	500342
Zuurstofgas (medisch zuurstof)	Linde, München, Germany
Carbogengas (95 % O2, 5 % CO2)	Linde, München, Germany
NaCl	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	7647-14-5
KCl	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	746436
CaCl2	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	746495
KH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	NIST200B
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	51558
NaHCO3	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	S5761
D(+)-Glucose	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	G8270
MgSO4	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	M7506
NaOH	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	S8045
Cyanoacrylaatlijm	Henkel, Düsseldorf, Germany
Low-melt agarose	Roth, Karlsruhe, Germany	6351.2
Heparine-natrium-25000 I.E./5 mL	Ratiopharm, Ulm, Germany
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), hoge glucose, GlutaMAX	ThermoScientific, Waltham, USA	10566016
SEC-10LX Versterker	npi electronic GmbH, Tamm, Germany	SEC-10LX
EPC 9	HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany
Zeiss Axiovert 200	Zeiss, Oberkochen, Germany
Micromanipulator met lage vergroting	Narashige, Tokyo, Japan	Nm-3
Micromanipulator met hoge vergroting, drie assen	Narashige, Tokyo, Japan	MHW-3
Peristaltiek perfusiepomp	Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	PPS2
2-kanaals temperatuurregelaar	Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	TCO02
Vierkant pulsstimulator	Natus Europe GmbH, Planegg, Germany	Grass SD9
Glasmacapillairen	WPI, Sarasota, USA	1B150F-1