Methodenartikel

Metabole Glycoengineering van Sialic zuur met N-acyl-gewijzigd Mannosamines

DOI:

10.3791/55746

⸱

25 november 2017

 , 
1Max von Pettenkofer-Institut & Genzentrum, Virologie, Nationales Referenzzentrum für Retroviren, Medizinische Fakultät, LMU München, 2Institut für Laboratoriumsmedizin, klinische Chemie und Pathobiochemie, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Institut für Physiologische Chemie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sialic acid is een typische monosaccharide-eenheid gevonden in glycoconjugates. Het is betrokken bij een overvloed van moleculaire en cellulaire interacties. Hier presenteren we een methode als u wilt wijzigen van cel oppervlakte sialic zuur expressie metabole glycoengineering met N- acetylmannosamine derivaten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sialic acid (Sia) is een zeer belangrijke constituent van glycoconjugates, zoals N- en O- glycanen of Glycolipiden. Als gevolg van zijn positie op de niet-reducerende termini van oligo - en polysacchariden, alsmede haar unieke chemische kenmerken, is sialic acid betrokken in een veelheid van verschillende receptor-ligand interacties. Door aanpassing van de expressie van sialic zuur op het celoppervlak, zal bijgevolg sialic acid-afhankelijke interacties worden beïnvloed. Dit kan nuttig zijn voor het onderzoeken van sialic zuur-afhankelijke interacties en heeft de potentie om bepaalde ziekten op een positieve manier beïnvloeden. Via metabolische glycoengineering (MGE), kan de uitdrukking van sialic zuur op het celoppervlak worden gedifferentieerd. Hierin, worden cellen, weefsels, of zelfs hele dieren behandeld met C2 gemodificeerde derivaten van N- acetylmannosamine (ManNAc). Deze amino suikers worden fungeren als sialic zuur voorloper moleculen gemetaboliseerd tot de overeenkomstige sialic acid-soorten en uitgedrukt op glycoconjugates. Toepassing van deze methode produceert intrigerende effecten op verschillende biologische processen. Bijvoorbeeld, het kan drastisch verminderen de expressie van polysialic zuur (polySia) in behandelde neuronale cellen en beïnvloedt daarmee neuronale groei en differentiatie. Hier, laten we de chemische synthese van twee van de meest voorkomende C2 gemodificeerde N- acylmannosamine-derivaten, N- propionylmannosamine (ManNProp) en N- butanoylmannosamine (ManNBut), en verder laten zien hoe deze niet-natuurlijke amino suikers kunnen worden toegepast in cel cultuur experimenten. De expressie van gemodificeerde sialic zuur soorten is gekwantificeerd door hoge prestatie vloeibare chromatografie (HPLC) en verder geanalyseerd via massaspectrometrie. De gevolgen voor de polysialic zure expressie zijn toegelicht via westelijke vlek met behulp van een commercieel verkrijgbare polysialic zuur antilichaam.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sialic acid is een monosacharide die meestal op de niet-reducerende termini van glycoconjugates, zoals N- en O- glycanen of Glycolipiden gevonden kan worden. Onder alle monosacchariden heeft sialic zuur enkele unieke chemische kenmerken. Het heeft een 9 C-atoom ruggengraat, een carboxylic groep in de positie van de C-1, die gedeprotoneerde en daardoor negatief geladen onder fysiologische omstandigheden en een amino-functie in de C-5 positie. Hoewel meer dan 50 natuurlijk voorkomende varianten van sialic zuur op datum1 gekenmerkt, is de overheersende vorm van sialic zuur gevonden bij de mens N- acetylneuraminic zuur (Neu5Ac). Andere zoogdieren express ook hogere hoeveelheden N- glycolylneuraminic zuur (Neu5Gc)2,3.

Als gevolg van de blootgestelde positie in glycoconjugates, is sialic acid betrokken bij een overvloed van receptor-ligand interacties, bijvoorbeeld de binding hemagglutinine afhankelijk van het influenza-virus gastheer cellen4. Een epitoop sialic zuur met belangrijke biologische functies, vooral tijdens de embryogenese en in het zenuwstelsel, is polysialic zuur. Polysialic acid is een polymeer van maximaal 200 Alfa 2,8-linked sialic zuren. De grote eiwit drager van polysialic zuur is het neurale cel adhesie molecuul (NCAM). Polysialic zuur expressie moduleert de zelfklevende eigenschap van de NCAM in die polysialic zuur expressie de hechting vermindert en plasticiteit met het zenuwstelsel5verhoogt.

Wijzigingen in de expressie van (poly) sialic zuur zal uiteindelijk invloed op een veelheid van verschillende biologische interacties. Dit kan worden gebruikt om de afhankelijke processen van de bekende sialic zuur op een moleculair niveau, om nieuwe glycoconjugate interacties te ontdekken, of mogelijke therapeutische benaderingen te verkennen te bestuderen. Er zijn verschillende methoden beschikbaar waaraan de expressie van sialic zuur op het celoppervlak kan worden gedifferentieerd, bijvoorbeeld behandeling met sialic zuur specifieke glycosidases (sialidases), inhibitie van enzymen die betrokken zijn bij de biosynthese van sialic zuur6 ,7,8, neerhalend of wijzigen van de uitdrukking van het sleutelenzym van sialic zuur biosynthese9.

Een ander veelzijdige methode om het moduleren van sialic zuur expressie is MGE (ook bekend als metabole oligosaccharide engineering, MOE). Hierin, worden cellen, weefsels, of zelfs dieren behandeld met niet-natuurlijke derivaten van ManNAc die C2-amino wijzigingen dragen. Als voorloper moleculen voor sialic zuur, na cellulaire opname, deze ManNAc-analogen zijn unidirectionele verloederde aan niet-natuurlijke sialic zuren en kunnen worden uitgedrukt op sialylated glycoconjugates. Cellen behandeld met ManNAc derivaten uitvoering alifatische C2-wijzigingen, zoals ManNProp of ManNBut, nemen N- propionylneuraminic zuur (Neu5Prop) of N- butanoylneuraminic zuur (Neu5But) in hun glycoconjugates-10 , 11. met behulp van functionele groepen ingevoerd om de C2-positie van de ManNAc, de voorkomende niet-natuurlijke sialic zuren kan worden gekoppeld, bijvoorbeeld via de Staudinger-afbinding of de azide basen cycloadditie, met fluorescente kleurstoffen en daarom gevisualiseerd op de cel-oppervlakte12.

De uitdrukking van deze niet-natuurlijke sialic zuren intrigerende gevolgen heeft voor vele biologische processen, met inbegrip van pathogenen infecties, de hechting en de migratie van tumorcellen, algemene cel adhesie, evenals vascularisatie en differentiatie (voor revisie Zie: Wratil et al. 13). interessant, MGE met N-acyl bewerkt mannosamines kan ook worden gebruikt om zich te mengen met de expressie polysialic zuur. Polysialic zuur wordt gegenereerd door twee verschillende polysialyltransferases (ST8SiaII en ST8SiaIV). Is gebleken, dat polysialyltransferase ST8SiaII wordt geremd door onnatuurlijke sialic zuur precursoren, zoals ManNProp of ManNBut14,15. Bovendien is gebleken in menselijke neuroblastoma cellen dat ManNProp of ManNBut toepassing ook sialylation in totaal15 vermindert.

MGE met N-acyl gewijzigd mannosamines is een eenvoudige methode die met succes is uitgevoerd, niet alleen in het zoogdier- en cultuur van de cel van de bacteriën maar ook in hele dieren van verschillende soorten, zoals Caenorhabditis elegans16, toe te passen zebravis17, of muizen18,19,20,21. Vooral ManNAc derivaten alifatische wijzigingen, met inbegrip van ManNProp en ManNBut, rekening houdend met zijn verwaarloosbaar cytotoxisch zijn, zelfs in millimolar concentraties in de cel kweekmedium of bloed plasma. Bovendien, ze zijn relatief makkelijk te synthetiseren.

Hier, we leveren details over het gebruik van MGE met N-acetyl mannosamines bewerkt. Ten eerste, de chemische synthese van twee van de meest gebruikte ManNAc derivaten op dit gebied, ManNProp en ManNBut, wordt uitgelegd. Vervolgens laten we zien hoe MGE kan worden toegepast in een experiment in vivo . Als voorbeeld, de neuroblastoom cellijn Kelly werd gekozen om aan te tonen van verminderde expressie van het polysialic-epitoop door Western blot na behandeling met de ManNAc-derivaten. De niet-natuurlijke sialic zuren op het celoppervlak werden gekwantificeerd door HPLC en verder geanalyseerd via massaspectrometrie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. bereiding van Buffers en reagentia

  1. Bereiding van 3 mM natrium methoxide oplossing
    1. Ontbinden 8.1 mg natrium methoxide in 50 mL methanol (3 mM) in een 100 mL glazen fles met een roer-bar. Bewaren bij kamertemperatuur (RT) voor meerdere weken.
  2. Voorbereiding van Tris-HCl buffer
    1. Combineren van 8.766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl en 146 mg EDTA in een 100 mL glazen fles met een roer-bar en los op in 80 mL water.
    2. Natriumhydroxide-oplossing (1 M, in water) of HCl (20%, in water) toevoegen aan het roeren oplossing, met inachtneming van de pH met een pH-meter, en breng de pH op 8.0.
    3. Voeg de hoeveelheid water die nodig zijn om een eindvolume van 100 mL. Filtreer de oplossing met behulp van een 0,22 µm steriele filtersysteem.
      Opmerking: 100 mL Tris-HCl buffer bevat 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl en 5 mM EDTA (pH 8.0). De oplossing kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor enkele weken.
  3. Bereiding van de oplossing van de aprotinin
    1. Los 10 mg aprotinin in 1 mL water (1,54 mM). Aliquot de oplossing van de aprotinin in 10 x 1,5 mL-kunststof buizen (van elke 100 µL). Bewaren bij-20 ° C gedurende enkele weken.
  4. Bereiding van de oplossing van de leupeptin
    1. Los 10 mg leupeptin in 2 mL water (10 mM). Aliquot de leupeptin oplossing 10 x 1,5 mL-kunststof buizen. Bewaren bij-20 ° C gedurende enkele weken.
  5. Bereiding van phenylmethylsulfonyl-fluoride (PMSF) oplossing
    1. Los 34.8 mg PMSF in 2 mL ethanol (100 mM). Aliquot de oplossing van de PMSF in 10 x 1,5 mL-kunststof buizen. Bewaren bij-20 ° C gedurende enkele weken.
  6. Bereiding van de oplossing van de 1,2-diamino-4,5-methyldioxybenzol-dihydrochloride (DMB)
    1. Combineer 15.62 mg DMB, 352 µL β-mercaptoethanol, en 48 µL natrium bisulfiet-oplossing (39%), en voeg 9,6 mL water (6,9 mM DMB, 500 mM β-mercaptoethanol en 0,19% natrium bisulfiet). Aliquot de DMB oplossing in 40 x 1,5 mL-kunststof buizen (elke 250 µL). Winkel beschermd tegen licht bij-20 ° C gedurende enkele weken.
  7. Bereiding van 1 M trifluoroacetic acid (TFA) oplossing
    1. Voeg 770.3 µL van 100% TFA 9.23 mL water in een plastic tube van 15 mL (1 M). Bewaren bij 4 ° C voor enkele weken.
  8. Bereiding van 120 mM TFA oplossing
    1. 92,4 µL TFA (100%) aan 9.91 mL water (120 mM) in een plastic tube van 15 mL toevoegen. Bewaren bij 4 ° C voor enkele weken.
  9. Bereiding van 400 mM natriumhydroxide (NaOH)-oplossing
    1. Los 160 mg NaOH in 10 mL water (400 mM) in een plastic tube van 15 mL. Bewaren bij 4 ° C voor enkele weken.
  10. Voorbereiding van westelijke vlek lysis buffer
    1. Los 5,84 g NaCl, 0,1 g Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Tris), 0,1 g CaCl2, 0,95 g MgCl2en 1 g Triton-X100 in 100 mL water en breng de pH op 7,8. Bewaren bij 4 ° C. Voeg 100 µL van elke proteaseinhibitor (aprotinin, leupeptin en PMSF) voordat u de lysis-buffermengsel.
  11. Voorbereiding van het natrium dodecyl sulfaat polyacrylamide-gel elektroforese (SDS-PAGE) buffer
    1. Los van 0,3 g Tris, 1,5 g glycine en 0,1 g SDS in 100 mL water en breng de pH op 7.3. Winkel op RT.
  12. Voorbereiding voor westelijke vlek buffer
    1. Los van 0,3 g Tris, 1.1 g glycine in 90 mL water en voeg 10 mL ethanol. Winkel op RT.
  13. Voorbereiding van het blokkeren van de oplossing
    1. Los 1 g magere gratis melk macht in 25 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Altijd vers bereid.

2. synthese van ManNProp en verwante N-acyl-gewijzigd Mannosamines

  1. Los 431.2 mg mannosamine hydrochloride in 10 mL 3 mM natrium methoxide oplossing in een 50 mL glazen fles met een roer-bar.
  2. Koel het mengsel op het ijs tot 0 ° C. Aan de roeren oplossing, Voeg langzaam ontkleuring 210 µL propionyl chloride (2,4 mmol) of 248 µL butanoyl chloride (2,4 mmol) voor het synthetiseren van ManNProp of ManNBut, respectievelijk. Incubeer het roeren mengsel bij 0 ° C gedurende 4 uur.
  3. Breng de oplossing kwantitatief over in een plastic buis van 50 mL. Poke 4-8 gaatjes in het deksel van de kunststof buis met een dunne naald. Snel de oplossing met behulp van vloeibare stikstof te bevriezen en daarna lyophilize (bevriezing droog) het 48 uur of tot het volledig is opgedroogd.
  4. Meng 350 g silicagel 60 met 750 mL ethyl-acetaat/methanol/water (15:2:1) (dit is een schorsing). Vul een glazen kolom (35 mm diameter en 70 cm lengte) met de silica gel 60 schorsing en was de bereid kolom met een extra 100 mL ethyl-acetaat/methanol/water (15:2:1) voor gebruik.
  5. Los van de gedroogde producten uit stap 2.3 (5 g gedroogde product) in 10 mL ethyl-acetaat/methanol/water (15:2:1) en laden ze met behulp van een pipet op de silica gel kolom. Verzamel 4 mL breuken na 500 mL (voor ManNProp). Opmerking: ManNBut zal Elueer uit de kolom ongeveer na 700 mL.
  6. Breng de eluted breuken in 15 mL plastic buizen. Poke 3-6 gaatjes in het deksel van de kunststof buis met een dunne naald. Snelle bevriezen de oplossing met behulp van vloeibare stikstof en vervolgens het lyophilize totdat het volledig is opgedroogd.
    Opmerking: De gelyofiliseerd producten kunnen worden opgeslagen voor enkele maanden op RT.
  7. Controleer of de zuiverheid van de producten door de Spectrometrie van de massa (zie punt 9).
    Opmerking: U kunt ook zuiverheid kan ook worden gecontroleerd door 1H nucleaire magnetische resonantie (NMR).

3. de celkweek

  1. Cultuur Kelly neuroblastoom cellen in Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) opslagmedium met 10% foetale runderserum 100 U penicilline, 100 mg streptomycine, 2 mM L-glutamine bevat 5 mM ManNAc, 5 ManNProp, of 5 mM ManNBut, bij 37 ° C en 5% CO2.
    Opmerking: Cellen gekweekt in medium zonder ManNAc of zijn analogen worden gebruikt als een besturingselement.
  2. Vóór toepassing van de mannosamines, los van de Kelly neuroblastoom cellen door ze aan het broeden voor 10 min met trypsine/EDTA (0,25%, 0,02%, in PBS) en rekenen met behulp van een Neubauer-kamer of cel counter. Zaad de cellen bij gedefinieerde aantallen gebaseerd op de grootte van de plaat/schotel.
    1. Voor het meten van sialic zuur monosacchariden, seed 1 x 105 cellen in 500 µL medium in een 48-well weefselkweek plaat. Zaad voor de analyse van polysialic zuren, 1 x 106 cellen in 3 mL medium op een 6 cm diameter cel cultuur schotel. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2. Vervang het medium elke 24 h.
      Opmerking: Het effect van MGE toeneemt met de totale tijd van behandeling. Voor hoge metabole efficiëntie door de cellen te behandelen voor 5-7 dagen.
  3. Na de behandeling, decanteren in het medium. De afwas platen/met PBS. Loskoppelen van de cellen door ze aan het broeden voor 10 min met trypsine/EDTA (0,25%, 0,02%, in PBS). Neutraliseer de trypsine door dezelfde hoeveelheid cel kweekmedium aan de vrijstaande cellen toe te voegen. Breng de vrijstaande cellen in 15 mL plastic buizen. De monsters gedurende 3 minuten op 500 x g centrifugeren en verwijder het supernatant.
    1. Voeg toe 5 mL PBS en centrifuge cellen (zie stap 3.3). Herhaal de procedure wassen twee meer tijden.
      Opmerking: De pellet gewassen cel zonder supernatant kan worden achtergelaten bij-20 ° C voor meerdere dagen. Als de expressie van polysialic zuur worden opgehelderd is blijven van hoofdstuk 10.

4. cellysis voor HPLC analyse

  1. Voorbereiding van HPLC lysis buffer
    1. Het combineren van 5 mL Tris-HCl buffer, 5 µL aprotinin oplossing, 20 µL leupeptin oplossing en 50 µL PMSF oplossing.
      Opmerking: 5 mL HPLC Lysis buffer bevat 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1,54 µM aprotinin, 40 µM Leupeptin, en 1 mM PMSF (pH 8.0). Deze buffer dient altijd bereid verse voorafgaand aan cellysis.
  2. Resuspendeer de verzamelde cel pellets (stap 3.3) elk in 500 µL ijskoude HPLC-lysisbuffermengsel, en ultra-Bewerk ultrasone trillingen ten de monsters met een ultra sonic processor naald driemaal voor een periode van 30 s bij middelhoge amplitudes. Koel de monsters in de ijskast voor minstens 1 min tussen de cycli.

5. scheiding van de membraan-breuk

  1. Centrifugeer het lysed celsteekproeven voor 2 h op 20.000 x g- en 4 ° C. Scheid het supernatant (ongeveer 480 µL), die vertegenwoordigt cytosolische eiwitten bevatten, in 1,5 mL plastic buizen. Bepaal de concentratie van de eiwitten van deze fracties met behulp van, bijvoorbeeld, de Bradford of de bicinchoninic zuur (BCA) bepaling.
    Opmerking: De eiwitconcentratie (ongeveer 1 mg/mL) van de cytosolische breuken kan later worden gerelateerd aan de gemeten hoeveelheden van de gerespecteerde sialic acid-soorten. De pellet vertegenwoordigt de membraan breuk, die is gebruikt in stap 6.1.

6. zure hydrolyse

Opmerking: Oligo- en polysacchariden in de celmembranen zijn gehydrolyseerd tot monosachariden. Verder, mogelijk O-wijzigingen in de monosacchariden zijn gehydrolyseerd, als goed. Dit is nodig voor de kwantitatieve analyse van de HPLC, omdat de overgrote meerderheid van sialic zuren in de membraan breuken zijn vanzelfsprekend in glycoconjugates en kan eventueel het dragen van O-acetyl of O- lactolyl wijzigingen.

  1. Voeg 150 µL 1 M TFA-oplossing voor de gescheiden membraan breuken (pellet uit punt 5). Incubeer de monsters gedurende 4 uur bij 80 ° C met schudden bij 200-600 rpm.
  2. De monsters voor ongeveer 30 min op 20.000 x g en 21 ° C met behulp van 0,5 mL filter buizen met 3 kDa uitsluiting membranen, totdat het volume van de bovenste fase minder dan 20 µL is centrifugeren.
    Opmerking: Deze stap is belangrijk om te beschikken over hogere moleculaire puin.
  3. Overdracht van de lagere fase met kleinere moleculen, met inbegrip van de soorten van sialic zuur, in 2 mL plastic buizen. Poke 2-4 gaten in de doppen van de kunststof buizen met een dunne naald. Snelle bevriezen van de monsters met behulp van vloeibare stikstof en dan lyophilize ze 's nachts.
    Opmerking: De gedroogde monsters kunnen worden opgeslagen voor meerdere dagen op RT. vervangen een GLB zonder gaten voor langere opslag.

7. fluorescerende Labeling

  1. Resuspendeer de gedroogde monsters in 10 µL 120 mM TFA oplossing en voeg 50 µL DMB oplossing. Pipetteer monsters in donkere 1,5 mL buizen om hen te beschermen tegen ultraviolet licht.
  2. Voor normen, los 1 µL Neu5Ac (60 ng/mL, in water) of 1 µL Neu5Gc (60 ng/mL, in water) in 10 µL 120 mM TFA oplossing in donkere 1,5 mL tubes. Voeg 50 µL DMB oplossing.
  3. Incubeer de celmembraan monsters en de normen voor 1,5 h bij 56 ° C beschermd tegen licht. Na incubatie, voeg toe 4 µL 400 mM NaOH oplossing aan elk monster om te stoppen met de labeling reactie.

8. HPLC analyse

Opmerking: Gelabelde monsters worden geanalyseerd op een HPLC-systeem dat is uitgerust met een C18 RP kolom (110 Å, 3 µm deeltjesgrootte, 4.6 x 150 mm), een fluorescentiedetector en een breuk-verzamelaar. De gebruikte extractiemiddelen zijn water, methanol en acetonitril. Zorg ervoor dat alle oplosmiddelen voorafgaand aan de metingen, ontgas als het HPLC-systeem een interne degasser ontbreekt.

  1. De temperatuur van de kolom ingesteld op 40 ° C en configureer de fluorescentiedetector met 373 nm voor excitatie en 448 nm voor emissie, respectievelijk. Injecteer 10 µL monstervolume en scheid de sondes voor 50 min op 0,5 mL/min debiet met methanol/acetonitril/water (6:8:86) als de elutievloeistof. Verzamelen voor de analyse van de Spectrometrie van de massa, de pieken van belang.
    Opmerking: Neu5Gc naar verwachting eluaat na 6-8 min, Neu5Ac na 9-12 min, Neu5Prop na 17-23 min en Neu5But na 38-44 min. De gefractioneerde monsters kunnen worden opgeslagen voor verschillende h bij 4 ° C beschermd tegen licht.
  2. Na het meten van elk monster, wassen van de kolom voor 7,5 min op 1,0 mL/min debiet (≈ 1,5 kolom volumes) met methanol/acetonitril/water (6:25:69) en opnieuw equilibreer het systeem voor 7,5 min op 1,0 mL/min debiet met methanol/acetonitril/water (6:8:86).
  3. Bereken de oppervlakte onder de kromme van de pieken van de sialic zuur van belang met behulp van de besturingssysteemsoftware van de respectieve HPLC-systeem22voor kwantitatieve analyse.
    Opmerking: Verkregen gegevens kan worden gerelateerd aan de Neu5Ac of de Neu5Gc-standaard en de concentraties van de gemeten eiwit in de cytosolische breuken (zie rubriek 5.1).

9. massaspectrometrie analyse van Sialic zuur monosacchariden

Opmerking: HPLC retention pieken van belang kunnen worden verder geanalyseerd door vloeistofchromatografie (LC) electrospray-ionisatie massaspectrometrie (ESI-MS), om te verifiëren of de soort onnatuurlijke sialic zuur.

  1. Voor spectrometrische analyse, injecteren 20 µL van verzamelde monster in een LC/Mass Selective Detector (MSD) systeem met 79,9% methanol, 20% isopropylalcohol en 0,1% mierenzuur als eluens, 0,5 mL/min debiet, 4 kV capillaire spanning en capillaire temperatuur 350 ° C 22 , 23.
  2. Selecteer in de evaluatiesoftware van de respectieve LC/MSD-systeem, het hoogtepunt van belang in het chromatogram totale ion. Bekijk de massaspectrum van de opgelost piek. De positieve massa/lading verhouding tussen 300 en 700 weergeven
    Opmerking: DMB etikettering van sialic zuren leidt tot een toename in de moleculaire massa van 116.2 g/mol. De sialic-zuur DMB-geëtiketteerden soorten hebben de volgende moleculaire massa's: DMB-Neu5Ac = 424.2 g/mol, DMB-Neu5Gc = 441.8 g/mol, DMB-Neu5Prop = 436.2 g/mol, DMB-Neu5But = 453.2 g/molaire Common adducten acetonitril, natrium of isopropyl-alcohol.

10. westelijke vlekkenanalyse Polysialic zuur in Kelly neuroblastoom cellen

  1. Voorbereiding van cel lysates
    1. 1 mL lysis-buffermengsel van westelijke vlek aan de cel pellets toevoegen uit stap 3.3 en vortex. Incubeer gedurende 30 min op ijs. Vortex elke 5 min. Centrifugeer de monsters gedurende 1,5 uur op 20.000 x g- en 4 ° C. Het verzamelen van de bovendrijvende substantie die de eiwitten uit de lysed cellen bevatten.
    2. Bepaal de eiwitconcentratie van de eiwitfracties, bijvoorbeeld, de Bradford of de BCA-bepaling. Verdun de monsters aan een eiwitconcentratie van 1,5 µg/µL in lysis-buffermengsel.
    3. De SDS-pagina de monsters voorbereiden door toevoeging van 10 µL Laemmli monster buffer aan 90 µL eiwitoplossing (1,5 µg/µL) en kook het monster voor 5 min24.
  2. Immunoblotting
    1. 8% SDS-acrylamide gels met 20-30 µL zakken en 0,75 of 1 mm dikte gebruiken. Draaien van de gel op 25 mA voor 2 h op RT.
    2. Verwijder voorzichtig de glasdeel van de gel. Knip uit en gooi het bovenste gedeelte van de gel met de lading zakken. Plaats de gel op een nitrocellulose membraan (0,2 µm), eerder gedrenkt in westelijke vlek buffer. De eiwitten overbrengen in nitrocellulose overeenkomstig de aanbevelingen van het systeem (bijvoorbeeld 250 mA gedurende 1 uur bij 4 ° C).
    3. Verwijder het membraan van het nitrocellulose uit het Bevlekkende systeem. Vlek de vlek met Ponceau rood om aan te visualiseren van de eiwitten. Het membraan van het nitrocellulose overboeken naar een kunststof kamer en voeg 10 mL oplossing blokkeren. Incubeer gedurende 1 h op RT of overnacht bij 4 ° C.
    4. Decanteren in de blokkerende oplossing en voeg monoklonaal anti-polySia 735 antilichaam (1 µg/mL) in PBS. Incubeer het membraan gedurende 1 uur op RT of overnacht bij 4 ° C. Na incubatie, wassen het membraan ten minste driemaal voor 5 min met PBS.
    5. Voeg polyklonale anti-muis IgG secundair antilichaam (1 µg/mL) gekoppeld aan horseradish peroxidase (HRP) of een fluorescerende label in PBS. Incubeer het membraan gedurende 1 uur op RT. Na incubatie, wassen het membraan ten minste driemaal voor 5 min met PBS.
    6. Overdracht van het membraan op een bord van een passende imager. Het signaal volgens de instructies van de fabrikant te detecteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HPLC chromatogrammen van de fluorescentie die het label van de Neu5Ac en de Neu5Gc-normen zijn afgebeeld in Figuur 2. Met behulp van de hierin beschreven methode, GC DMB-label Neu5Gc meestal tussen 7-9 min elutie tijd en DMB-Neu5Ac tussen 10-12 min. Diverse kleinere toppen in het chromatogram staan meestal tussen 2-6 min. Deze pieken vertegenwoordigen spoorverontreiniging DMB en reactie tussenproducten25.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als het chemisch gesynthetiseerde derivaten van ManNAc, ManNProp en ManNBut worden geanalyseerd via massaspectrometrie, moet alleen de juiste massa piek voor beide specimens worden geïdentificeerd. Daarom kunnen de producten worden geacht te hebben een zuiverheid van meer dan 99%. Kleine hoeveelheden van Neu5Gc, die normaal gesproken niet wordt gevonden in menselijke cellen29, zijn in de fracties van de membraan van de lysed cellen aangetroffen. Dit gebeurt meest waarschijnlijk door een bergings-t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken L. D. Nguyen voor proeflezen van het manuscript en voor de vruchtbare discussies. Bovendien, we danken J. Dernedde en H. G. Nguyen voor uw hulp bij het voorbereiden van de video-shoot. De meeste scènes van de video werden doodgeschoten in de laboratoria van R. Tauber. Wij danken ook het Max-Planck-Instituut voor de Kolloïden en grensvlakken en voor ons gratis toegang te geven tot hun massaspectrometrie faciliteit. RH werd gesteund door de DFG (ProMoAge).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CellenSigma-Aldrich92110411
RPMI-mediumSigma-AldrichR8758
75 ml weefselkweekkolvenGreiner690175
48-well platenCorning3548
FCSPAAA15-102
Pen/StrepGibco15140-122
TrypsineGibco15400-054
EDTARothX986.1
TrisServa37190.03
SDSRoth2326.2
SDS-PAGE-apparatuur (tanks, glaswerk enz., machineVWRSDS Gel/Blot
AcrylamidRoth3019.1
ProteïneladderFisher Scientific267620
NitrocelluloseGE Healthcare10600002
Ponceau roodRoth5938.2
MelkpoederRothT145.3
ECLMilliporeWBLUF 0500
0,5 ml centrifugale filterunit met 3 kDa membraanMerck-MilliporeUFC500324
15 mL centrifugebuizenSigma-Aldrich (Corning)CLS430791-500EA
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250-10ML
2-PropanolSigma-Aldrich34965-1LHPLC-gradientkwaliteit
4,5-Methyleendioxidi-1,2-fenyleendiaminedihydrochlorideSigma-AldrichD4784-50MG
48 well, platte bodem weefselkweekplaatSigma-Aldrich (Corning)CLS3548-100EA
50 mL centrifugebuizenSigma-Aldrich (Corning)CLS430829-500EA
AcetonitrilSigma-Aldrich34967-1LHPLC-gradientkwaliteit
Aprotinine uit runderlongSigma-AldrichA1153-10MGgevriesdroogd poeder, 3-8 TIU/mg solid
ButyrylchlorideSigma-Aldrich109614-250G
C18 RP-kolomPhenomenex00F-4435-E0110 Å, 3 µm deeltjesgrootte, 4,6 x 150 mm
D-MannosaminehydrochlorideSigma-AldrichM4670-1G
Dulbecco`s fosfaatgebufferde zout-oplossingPAN BiotechP04-36500
EthyleendiaminetetraazijnzuurSigma-AldrichE9884-100G
MierenzuurSigma-Aldrich56302-50ML-GL
ZoutzuuroplossingSigma-AldrichH1758-100ML36,5-38,0%, in water
LeupeptineSigma-AldrichL2884-10MG
MethanolCarl-RothT169.2HPLC-gradientkwaliteit
N-Acetyl-D-mannosamineSigma-AldrichA8176-250MG
N-AcetylneuraminzuurSigma-AldrichA0812-25MG
N-GlycolylneuraminzuurSigma-AldrichG9793-10MG
FenylmethaansulfonylfluorideSigma-AldrichP7626-250MG
PropionylchlorideSigma-AldrichP51559-500G
Safe-Lockbuizen, 1,5 ml, amber (lichtbescherming)Eppendorf30120191
Safe-Lockbuizen, 1,5 ml, kleurloosEppendorf30120086
NatriumbisulfietoplossingSigma-Aldrich13438-1L-R-D40%, in water
NatriumchlorideSigma-Aldrich746398-500G-D
NatriumhydroxideSigma-Aldrich795429-500G-D
NatriumhydroxideoplossingSigma-Aldrich319511-500ML1,0 M, in water
NatriummethoxideSigma-Aldrich164992-5G
TrifluorazijnzuurSigma-AldrichT6508-100ML-D
TrishydrochlorideSigma-AldrichT5941-100G
Trypsine 0,25 %/EDTA 0,02 % in PBSPAN BiotechP10-019100
WaterCarl-RothT905.1HPLC-gradientkwaliteit
Silicagel 60Carl-Roth9779.1
HPLCAgilent
ESI-MSD-systeemAgilent

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Angata, T., Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: An evolutionary perspective. Chem Rev. 102, 439-469 (2002).
  2. Schauer, R., Schoop, H. J., Faillard, H. On biosynthesis of glycolyl group of N-glycolylneuraminic acid. oxidation of N-acetyl group to glycolyl group. Hoppe-Seylers Zeitschrift Fur Physiologische Chemie. 349, (1968).
  3. Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273, 15866-15871 (1998).
  4. Kelm, S., et al. Use of sialic acid analogues to define functional groups involved in binding to the influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem. 205, 147-153 (1992).
  5. Colley, K. J., Kitajima, K., Sato, C. Polysialic acid: Biosynthesis, novel functions and applications. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, 498-532 (2014).
  6. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8, 661-668 (2012).
  7. Wratil, P. R., et al. A Novel Approach to Decrease Sialic Acid Expression in Cells by a C-3-modified N-Acetylmannosamine. J Biol Chem. 289, 32056-32063 (2014).
  8. Nieto-Garcia, O., et al. Inhibition of the key enzyme of sialic acid biosynthesis by C6-Se modified N-acetylmannosamine analogs. Chem Sci. 7, 3928-3933 (2016).
  9. Keppler, O. T., et al. UDP-GlcNAc 2-epimerase: A regulator of cell surface sialylation. Science. 284, 1372-1376 (1999).
  10. Kayser, H., et al. Biosynthesis of a nonphysiological sialic acid in different rat organs, using N-propanoyl-D-hexosamines as precursors. J Biol Chem. 267, 16934-16938 (1992).
  11. Keppler, O. T., et al. Biosynthetic modulation of sialic acid-dependent virus-receptor interactions of two primate polyoma viruses. J Biol Chem. 270, 1308-1314 (1995).
  12. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12-17 (2009).
  13. Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic Glycoengineering with N-Acyl Side Chain Modified Mannosamines. Angewandte Chemie International Edition. 55, 9482-9512 (2016).
  14. Horstkorte, R., et al. Selective inhibition of polysialyltransferase ST8Siall by unnatural sialic acids. Exp Cell Res. 298, 268-274 (2004).
  15. Gnanapragassam, V. S., et al. Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 9, 10(2014).
  16. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted 3+2 azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of blomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126, 15046-15047 (2004).
  17. Dehnert, K. W., et al. Imaging the Sialome during Zebrafish Development with Copper-Free Click Chemistry. ChemBioChem. 13, 353-357 (2012).
  18. Prescher, J. A., Dube, D. H., Bertozzi, C. R. Chemical remodelling of cell surfaces in living animals. Nature. 430, 873-877 (2004).
  19. Neves, A. A., et al. Imaging sialylated tumor cell glycans in vivo. Faseb Journal. 25, 2528-2537 (2011).
  20. Vogt, J., et al. Homeostatic regulation of NCAM polysialylation is critical for correct synaptic targeting. Cell Mol Life Sci. 69, 1179-1191 (2012).
  21. Qiu, L., et al. A novel cancer immunotherapy based on the combination of a synthetic carbohydrate-pulsed dendritic cell vaccine and glycoengineered cancer cells. Oncotarget. 6, 5195-5203 (2015).
  22. Erikson, E., et al. Mouse Siglec-1 Mediates trans-Infection of Surface-bound Murine Leukemia Virus in a Sialic Acid N-Acyl Side Chain-dependent Manner. J Biol Chem. 290, 27345-27359 (2015).
  23. Klein, A., Diaz, S., Ferreira, I., Lamblin, G., Roussel, P., Manzi, A. E. New sialic acids from biological sources identified by a comprehensive and sensitive approach: liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) of SIA quinoxalinones. Glycobiology. 7, 421-432 (1997).
  24. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4. Nature. 227, (1970).
  25. Orozco-Solano, M. I., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Ultrasound-assisted hydrolysis and chemical derivatization combined to lab-on-valve solid-phase extraction for the determination of sialic acids in human biofluids by µ-liquid chromatography-laser induced fluorescence. Analytica Chimica Acta. 766, 69-76 (2013).
  26. Hara, S., Takemori, Y., Yamaguchi, M., Nakamura, M., Ohkura, Y. Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera, glycoproteins, and glycolipids. Anal Biochem. 164, 138-145 (1987).
  27. İzzetoğlu, S., Şahar, U., Şener, E., Deveci, R. Determination of sialic acids in immune system cells (coelomocytes) of sea urchin, Paracentrotus lividus, using capillary LC-ESI-MS/MS. Fish Shellfish Immunol. 36, 181-186 (2014).
  28. Wolf, S., et al. Chemical Synthesis and Enzymatic Testing of CMP-Sialic Acid Derivatives. ChemBioChem. 13, 2605-2615 (2012).
  29. Sonnenburg, J. L., Altheide, T. K., Varki, A. A uniquely human consequence of domain-specific functional adaptation in a sialic acid-binding receptor. Glycobiology. 14, 339-346 (2004).
  30. Oetke, C., et al. Evidence for efficient uptake and incorporation of sialic acid by eukaryotic cells. Eur J Biochem. 268, 4553-4561 (2001).
  31. Buttner, B., et al. Biochemical engineering of cell surface sialic acids stimulates axonal growth. J Neuro. 22, 8869-8875 (2002).
  32. Kontou, M., Weidemann, W., Bork, K., Horstkorte, R. Biological Chemistry. 390, 575(2009).
  33. Tanaka, F., et al. Expression of polysialic acid and STX, a human polysialyltransferase, is correlated with tumor progression in non small cell lung cancer. Cancer Res. 60, 3072-3080 (2000).
  34. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  35. Collins, B. E., Fralich, T. J., Itonori, S., Ichikawa, Y., Schnaar, R. L. Conversion of cellular sialic acid expression from N-acetyl- to N-glycolylneuraminic acid using a synthetic precursor, N-glycolylmannosamine pentaacetate: inhibition of myelin-associated glycoprotein binding to neural cells. Glycobiology. 10, 11-20 (2000).
  36. Schwartz, E. L., Hadfield, A. F., Brown, A. E., Sartorelli, A. C. Modification of sialic acid metabolism of murine erythroleukemia cells by analogs of N-acetylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta. 762, 489-497 (1983).
  37. Jones, M. B., et al. Characterization of the cellular uptake and metabolic conversion of acetylated N-acetylmannosamine (ManNAc) analogues to sialic acids. Biotechnol Bioeng. 85, 394-405 (2004).
  38. Bayer, N. B., et al. Artificial and Natural Sialic Acid Precursors Influence the Angiogenic Capacity of Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Molecules. 18, 2571-2586 (2013).
  39. Schmidt, C., Stehling, P., Schnitzer, J., Reutter, W., Horstkorte, R. Biochemical engineering of neural cell surfaces by the synthetic N-propanoyl-substituted neuraminic acid precursor. J Biol Chem. 273, 19146-19152 (1998).
  40. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. In Vivo Imaging of Caenorhabditis elegans Glycans. ACS Chem Biol. 4, 1068-1072 (2009).
  41. Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
  42. Chang, P. V., et al. Copper-free click chemistry in living animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 1821-1826 (2010).
  43. Gagiannis, D., Gossrau, R., Reutter, W., Zimmermann-Kordmann, M., Horstkorte, R. Engineering the sialic acid in organs of mice using N-propanoylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1770, 297-306 (2007).
  44. Rong, J., et al. Glycan Imaging in Intact Rat Hearts and Glycoproteomic Analysis Reveal the Upregulation of Sialylation during Cardiac Hypertrophy. J Am Chem Soc. 136, 17468-17476 (2014).
  45. Galuska, S. P., et al. Quantification of Nucleotide-Activated Sialic Acids by a Combination of Reduction and Fluorescent Labeling. Anal Chem. 82, 4591-4598 (2010).
  46. Harms, E., Reutter, W. Half-Life Of N-Acetylneuraminic Acid In Plasma-Membranes Of Rat-Liver And Morris Hepatoma 7777. Cancer Res. 34, 3165-3172 (1974).
  47. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Curr Opin Chem Biol. 16, 214-220 (2012).
  48. Preidl, J. J., et al. Fluorescent Mimetics of CMP-Neu5Ac Are Highly Potent, Cell-Permeable Polarization Probes of Eukaryotic and Bacterial Sialyltransferases and Inhibit Cellular Sialylation. Angewandte Chemie-International Edition. 53, 5700(2014).
  49. Macauley, M. S., et al. Systemic Blockade of Sialylation in Mice with a Global Inhibitor of Sialyltransferases. J Biol Chem. 289, 35149-35158 (2014).
  50. Jorge, P., Abdul-Wajid, A. Sialyl-Tn-KLH, glycoconjugate analysis and stability by high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Glycobiology. 5, 759-764 (1995).
  51. Lin, S. L., Inoue, Y., Inoue, S. Evaluation of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed electrochemical and fluorometric detection for extensive application to the analysisof homologous series of oligo- and polysialic acids in bioactive molecules. Glycobiology. 9, 807-814 (1999).
  52. Pan, Y. B., Chefalo, P., Nagy, N., Harding, C., Guo, Z. W. Synthesis and immunological properties of N-modified GM3 antigens as therapeutic cancer vaccines. J Med Chem. 48, 875-883 (2005).
  53. Chefalo, P., Pan, Y. B., Nagy, N., Guo, Z. W., Harding, C. V. Efficient metabolic engineering, of GM3 on tumor cells by N-phenylacetyl-D-mannosamine. Biochemistry. 45, 3733-3739 (2006).
  54. Lee, S., et al. Chemical Tumor-Targeting of Nanoparticles Based on Metabolic Glycoengineering and Click Chemistry. ACS Nano. 8, 2048-2063 (2014).
  55. Koulaxouzidis, G., Reutter, W., Hildebrandt, H., Stark, G. B., Witzel, C. In vivo stimulation of early peripheral axon regeneration by N-propionylmannosamine in the presence of polysialyltransferase ST8SIA2. J Neural Transm. , 1-9 (2015).
  56. Gnanapragassam, V. S., et al. Correction: Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 11, e0154289(2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

SiaalzuurmodificatieN acylmannosaminePolysiaalzuuranalyseHogedrukvloeistofchromatografieMassaspectrometrieWestern blotCelkweekbehandelingFluorescente labelingHPLC analyse

Gerelateerde artikelen