Methodenartikel

Gepersonaliseerde naalden voor Microinjections in de hersenen knaagdier

11.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55751

⸱

24 januari 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Sciences, Section of Pharmacology, and National Institute of Neurosciences, University of Ferrara, 2Laboratory for the Technologies for Advanced Therapies (LTTA), University of Ferrara

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol voor microinjection in de knaagdier hersenen die gebruikmaakt van kwarts naalden. Deze naalden niet produceren detecteerbare weefselschade en zorgen voor betrouwbare levering zelfs in diepe regio's. Bovendien, zij kunnen worden aangepast aan de behoefte aan onderzoek door gepersonaliseerde designs en opnieuw kunnen worden gebruikt.

Samenvatting

Microinjections zijn gebruikt voor een lange tijd voor de levering van medicijnen of gifstoffen binnen specifieke hersengebieden en, meer recent, zij zijn gebruikt om gen of cel therapie producten te leveren. Helaas, de huidige microinjection technieken gebruik staal of glas naalden die suboptimaal om meerdere redenen zijn: met name stalen naalden weefselschade kunnen veroorzaken, en glas naalden kunnen buigen wanneer verlaagd diep in de hersenen, ontbreekt de doel-regio. In dit artikel beschrijven we een protocol voor te bereiden en gebruiken van kwarts naalden die een aantal handige functies combineren. Deze naalden produceren geen detecteerbare weefselschade en wordt zeer rigide, zorgen voor betrouwbare levering in de gewenste hersenen regio zelfs bij het gebruik van diepe coördinaten. Bovendien is het mogelijk het ontwerp van de naald iets persoonlijker maken door het maken van meerdere gaten van de gewenste diameter. Meerdere gaten vergemakkelijken de injectie van grote hoeveelheden van de oplossing binnen een groter gebied, overwegende dat grote gaten de injectie van cellen vergemakkelijken. Daarnaast kunnen deze quartz naalden worden gereinigd en hergebruikt, zodanig dat de procedure kosteneffectieve wordt.

Inleiding

Microinjections zijn gebruikt voor een lange tijd voor de levering van farmacologisch werkzame stoffen te moduleren Neuronale activiteit in specifieke hersengebieden. Bovendien zijn ze gebruikt om het injecteren van giftige stoffen in de buurt van bepaalde neuronale populaties, na te bootsen neurodegeneratieve gebeurtenissen kenmerkend zijn voor bepaalde ziekten, bijvoorbeeld 6-hydroxy-dopamine in het nigrostriatal dopamine systeem om na te bootsen van Parkinson 1 , 2 - of de immunotoxin 192 IgG saporin aan laesie de cholinerge systeem3. Meer recentelijk, microinjection procedures zijn gebruikt om het leveren van virale vectoren of cellen protheses voor gen of cel therapie van experimentele hersenen stoornissen4,5.

Het klassieke soort naalden werkzaam in deze studies is gemaakt van roestvrij staal. Hoewel eenvoudig en praktisch in gebruik, stalen naalden hebben een aantal problemen6: ze zijn relatief groot en weefselbeschadiging, kan veroorzaken bij lekkage van de bloed - hersenbarrière en activering van astrocyten; Bovendien kunnen ze produceren boorkern van hersenweefsel dat in de naald creëren van obstakel of zelfs volledig vermijden van stroom van de gewenste oplossing brengt. Recenter, gebruik glas naalden bereid ad hoc van haarvaten bijgekomen in7,8. Deze veroorzaken geen significante weefsel schade noch Astrocyt activering, maar zijn betrekkelijk flexibel en kunnen buigen Wanneer geïntroduceerd in diepe structuren, vermindering van de nauwkeurigheid van lokalisatie (persoonlijke opmerkingen te maken).

Er is dus een noodzaak om zoveel mogelijk schade verminderen (met name bij het uitvoeren van experimenten om te genezen van schade) terwijl het verhogen van de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid (dat wil zeggen, ervoor zorgen dat alle oplossing wordt geleverd en zorgen voor juiste lokalisatie). Bovendien zou het wenselijk zijn om verschillende naald ontwerpen gebruiken om de optimale verdeling van de geïnjecteerde oplossing in hersengebieden met uiteenlopende geometrieën. In dit artikel beschrijven we een protocol voor te bereiden en kwarts naalden gebruiken voor microinjections in de knaagdier hersenen. Als gevolg van het hoge smeltpunt, kwarts haarvaten kunnen niet worden getrokken op een conventionele trekker en daarom niet zijn gebruikt in het verleden voor het genereren van naalden. Kwarts, biedt echter een aantal belangrijke voordelen ten opzichte van glas, in het bijzonder hoge stijfheid en breken weerstand9. Vanwege de stijfheid, kwarts naalden zijn bij uitstek geschikt voor injecties in de ventrale hersengebieden. Vanwege hun hoge weerstand tegen breuk kunnen zij worden gemodelleerd tot meerdere gaten, verkrijgen van ontwerpen die zelfs bij het uitstippelen van hersengebieden met complexe geometrieën10meest effectieve kunnen blijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Ferrara voor dier experimenten en door het Italiaanse ministerie van gezondheid. Het aankomen (dier onderzoek: rapportage In Vivo experimenten11) richtsnoeren zijn gevolgd.

1. bereiding van Quartz naalden

  1. Reinigen en steriliseren van de haarvaten van de kwarts (Zie Tabel van materialen) door ze te plaatsen voor 5 minuten in gedistilleerd water, 5 min in ethanol 99% en 5 min in diethylether.
  2. Laat de haarvaten onder de motorkap voor ten minste 1 uur te laten drogen.
  3. Bereiden de naalden met behulp van een laser trekker volgens parameters waarmee de productie van een voldoende lang, voldoende dunne naald, afhankelijk van de individuele behoeften.
    Opmerking: We gebruiken een laser trekker (Zie Tabel van materialen). Gebruik een programma van twee regels voor het trekken. De eerste regel maakt gebruik van krachtige, de lengte van de grootste scannen (overeenkomend met door samensmelting van FILAMENTEN waarde) en geen trekken kracht. Deze combinatie van parameters leidt tot het smelten van het grootste deel van het capillair met de laagste snelheid van de uitbreiding, waardoor de vorming van een lange naald met inner/externe groot en verlaagd van de schacht. Op deze manier behoudt de naald een hoge mechanische weerstand en brede binnendiameter waarmee de passage van stamcellen of virale deeltjes zonder verstopping. Snelheid en de vertraging van de programmalijn van dit moeten de capillaire uitbreiding stoppen voordat de tip wordt te klein en lange, ontbreekt de vereiste mechanische en kenmerken van de vorm. De tweede regel van het trekken programma wordt automatisch uitgevoerd zodra de quartz afkoelt (5 s). Parameters van kracht, gloeidraad en trekkracht zijn functioneel te snijden een tip met de kortste mogelijke tip lengte en steile schacht, het vermijden van de scheiding van de twee naalden met een tip breuk. Routinematig, met onze apparatuur gebruiken we het volgende: (a) lijn 1 = vermogen 990, filament 5, snelheid 130, vertraging 110, pull 0; (b) lijn 2 = macht 970 gloeidraad 3, snelheid 0, vertraging 70, trekken van 0.
  4. Zet de naalden in een petrischaal eerder gereinigd met ethanol 70%.
    1. Dekking van de schotel met een kunststof paraffine-film.
  5. Snijd de haarvaten in de micro-dissector.
    1. De start, laat de laser een zelfdiagnose uitvoert om te controleren of de kracht en energie geleverd. Vervolgens stelt de parameters van het snijden.
      Opmerking: We gebruiken een micro-dissector (Zie Tabel van materialen) en de volgende parameters: laser power pulse energie (63 µJ), laser beam diameter van 20% van de maximale diafragma (maximale diafragma: 1.0 µm), en een snijsnelheid van 10% van de maximale snelheid (maximale snelheid: 30 µm/s).
    2. Stevig bevestigen de naald op de tafel van de Microscoop en plaats de tip in het midden van het computerscherm.
    3. Op de menubalk, klik op het potloodpictogram en gebruiken voor het tekenen van een merk voor het lasersnijden van de naald.
      Opmerking: De cut moet een hoek van ongeveer 45 ° met betrekking tot het oppervlak van de naald.
    4. Selecteer op de side-bar-functie, de vlag met de "Beginnen CUT" knop zodat de laser te snijden de eerder gemarkeerde plaats.
    5. Indien nodig, gesneden kant hole(s) herhaalt u de procedures in 1.5.2-3; Er is geen behoefte om te verplaatsen van de naald (Figuur 1).
  6. Snijd na reiniging.
    1. De naald verbinden met een leegte pomp door middel van een kunststof buis.
    2. Zet de pomp en de voorwaartse debiet handmatig in te stellen met een matige snelheid (3 µL/min).
    3. De 99% ethanol gecombineerd eerste en vervolgens het gedestilleerd water te verwijderen van verontreinigingen als gevolg van snijden.
    4. Gecombineerd de 99% ethanol opnieuw uit om te verlichten drogen.
      Opmerking: Elke stap moet ten minste 3 min duren.
  7. Bewaren de naalden in een goed overdekte petrischaal tot de dag van de operatie.
  8. Naalden kunnen opnieuw worden gebruikt; aan het einde van het experiment, schoon met bleekmiddel en ethanol te verwijderen het residu van oplossing en mogelijke weefsel. Vul de pot met gedestilleerd water totdat de tips zijn gedekt voor een meer volledige reiniging, zetten de naalden in een micropipet opslag pot met de punt naar beneden wijst, kook voor 1,5 min te verwijderen alle overgebleven weefsel, dan wassen met ethanol.

2. de procedure

  1. Na de instructies van de gebruikershandleiding van de pomp, selecteer het instellingenmenu te kalibreren van de pomp volgens de diameter/volume van de spuit microinjection en het debiet vastgesteldop 0,3 µL/min.
  2. Vul een 10 mL spuit (uitgerust met een botte naald (bv, Hamilton naald, 30 G) en een korte polytetrafluorethyleen buis) met steriel water en gebruik deze om het vullen van de spuit microinjection (na heel voorzichtig verwijderd de zuiger) en de injectie montage delen kit voor de handmatige microinjection pomp (MMP).
    Opmerking: De MMP-kit wordt gebruikt voor het veilig monteren de naald in het stereotactische frame (Figuur 2). De kit bevat: een buis van polytetrafluorethyleen, luer-naar-tubing koppeling, Pipetteer houder en pakkingen voor pipetten met verschillende diameters van de buitenste.
  3. Sluit de naald aan de MMP-kit.
    1. Spoel van meer water in het systeem via de 10 mL spuit, en controleren of het water uit de naald komt.
      Opmerking: Zorg ervoor dat elke luchtbel in het systeem te verwijderen door de vulling stappen te herhalen.
  4. De 10 mL spuit verbreken met de spuit microinjection langzaam de zuiger te duwen zodat een druppel water aan de bovenkant van de spuit microinjection, terwijl. Plaats de zuiger in de microinjection spuit.
  5. Sluit de microinjection spuit naar de pomp en de stroomsnelheid vastgesteldop 0,3 µL/min.
    Opmerking: Wacht totdat er een daling van de lekken van de punt van de naald en vervolgens laten gaan voor een andere 3 min.
  6. De stroom vastgesteldop 0.1 µL/min en de operatie procedure starten. De pomp moet lopend terwijl het uitvoeren van de operatie.
    Opmerking: We gebruiken voor de experimenten gemeld in dit artikel, mannelijke Sprague-Dawley ratten van 300 g (3 maanden oud). De procedure is echter in het bijzonder die van toepassing zijn op andere diersoorten, muizen.
  7. Induceren narcose met een methode goedgekeurd door lokale regelgeving.
    Opmerking: Wij gebruiken een mix van intraperitoneale injectie (i.p.) van 85 mg/kg ketamine en 8 mg/kg xylazine gedurende 20-50 minuten van de verdoving. Het is belangrijk dat de staart en/of teen snuifjes worden gebruikt om ervoor te zorgen dat het dier is volledig verdoofd. Niveau van anesthesie en fundamentele vitals worden beoordeeld voordat chirurgie begint en elke 10 min gecontroleerd tijdens het uitvoeren van de operatie. Dierlijke lichaam temperatuur constant vóór, tijdens en na chirurgische ingrepen met behulp van een water opnieuw circuleren verwarming pad. Dieren worden gecontroleerd totdat volledig hersteld (bijvoorbeeld ze rechtop en ambulante zijn). Daarnaast krijgen dieren pijnstillers (tramadol, 5-7 mg/kg i.p.) post-operatively elke 24 h gedurende drie dagen.
    1. Van het dier hoofd scheren en de chirurgische site adequaat voorbereiden op aseptische chirurgie. Het uitvoeren van een twee-traps scrub met jodium-gebaseerde oplossing (Betadine) gevolgd door 70% ethanol. Bovendien, als u wilt behouden asepsis, wikkel de chirurgische site met een chirurgische draperen (in de video heeft weggelaten voor demonstratie-doeleinden).
  8. Plaats de rat in het stereotaxic frame op een water opnieuw circuleren Verwarming Deken. Om extra pijnstilling, op de site van chirurgie 0,5% lidocaïne oplossing toepassen (7 mg/kg niet overschrijden). Steriliseren vooraf alle chirurgische instrumenten met behulp van een kraal sterilisator of vloeistof koude desinfectie door onderdompelend de apparatuur in beide 2% Glutaaraldehyde plus 7,05% fenol (Sporodicin of Cidex) gevolgd door spoelen met steriel water of zoutoplossing. Desinfectie moet zelfs tussen de procedures worden uitgevoerd. Een longitudinale snee te maken over de schedel met behulp van een gesteriliseerde scalpel. Te zacht om te voorkomen dat overmatig bloeden. Open de hoofdhuid met behulp van een platte spatel en chirurgische clips toe te passen op de kleppen van de huid open te houden. Zeer zacht, los het beenvlies blootstellen van de bregma en de oppervlakte van de schedel, waardoor de naald wordt ingevoegd.
  9. Monteren van de arm op het stereotaxic frame (terwijl de stroom loopt) en verplaats het puntje van de naald precies op de top van bregma, waarbij aandacht wordt besteed niet te breken van de tip. Aantekeningen van de antero-posterior en medio-laterale coördinaten van de bregma en vertalen naar de gewenste coördinaten. Geleid door een stereomicroscoop, lager de naald totdat haar tip raakt bijna de schedel, markeren het boren plek na een beetje verhoging van de stereotaxic arm.
  10. Boor (tip Ø boren: 0.8 mm; boor snelheid: 1000 rpm) de schedel op de aangegeven plek. Wees voorzichtig niet te doordringen van de dura tijdens het boren procedures. Tijdens het boren, druppelen steriele zoutoplossing om te voorkomen dat bot schade en necrose.
  11. Een klein stukje plastic paraffine film knippen en deze plaatsen op de schedel. Maak met de 10 µL Pipetteer een druppel van de oplossing te injecteren op de plastic paraffine-film. Stoppen met de pomp, iets ophalen van de Opdringer van de pomp en maak een kleine luchtbel in het capillair door zachtjes te trekken van de zuiger van de spuit microinjection.
  12. Verlaag de stereotactische arm totdat de punt van de naald de daling tot. Het monster trekken door te trekken (zeer langzaam) de zuiger van de spuit van microinjection, het vermijden van de vorming van een zeepbel. Vervangen van de Opdringer van de pomp in contact met de zuiger en zet de pomp op een debiet van 0,3 µL/min. wachten tot de vorming van een druppel (enkele min) voordat u verdergaat met de volgende stap.
    Opmerking: In het huidige voorbeeld experiment, kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) werd toegediend in het striatum (AP: minimaal 1,5, ML: ±2.7; DV:-5.0) en in de dorsale hippocampus (AP:-3.5, ML: ±2.1; DV:-3.5; in mm van dura), 2 µL/site. Om te vergemakkelijken de vergelijking tussen de twee injectie methoden, werd elk gebied van de hersenen toegediend met behulp van een naald kwarts in een halfrond en een botte tip van 26 G of een 30 G schuine kant-tip RVS naald in de andere.
  13. Lager de stroom aan 0.1 µL/min, nick de dura met een naald van de schuine rand-tip roestvrij staal en langzaam lager de stereotactische arm op de dorso-ventrale bijl, invoeren van het hersenweefsel. Wanneer de gewenste positie is bereikt, gaan stoppen beneden een extra 0,1 mm, de pomp, de stereotactische arm te verhogen met 0,1 mm en de pomp op de stroom aan 0,3 µL/min opnieuw te beginnen.
    Opmerking: De reden om een langzame stroming terwijl het verlagen van de naald is om een positieve druk die penetratie van kleine fragmenten van weefsel in de naald zelf vermijdt. Zo'n gebeurtenis zou belemmeren de tip, afbreuk te doen aan de levering van de oplossing. Aangezien het debiet erg traag is terwijl het verlagen van de naald en de snelheid van de verlaging is ongeveer 10 mm/s, dit betekent dat de hoeveelheid oplossing die langs het spoor van de naald blijven te verwaarlozen in vergelijking met die geïnjecteerd in de doelsite zijn. Deze voorzorgsmaatregel kan bij gebruik van naalden kant rijggat worden vermeden.
  14. De timer te starten en de benodigde tijd afhankelijk van het gewenste volume te injecteren (bijvoorbeeld 6 min 40 s als injecteren 2 µL) wachten. Controleren de zeepbel beweging terwijl injecteren. Aan het eind, stop de pomp en 5 min wachten voordat de naald langzaam worden opgehaald. Wanneer de quartz-naald is volledig geëxtraheerd, start de pomp opnieuw en controleer voor de vorming van een druppel op het puntje van de naald.
  15. Zegel van de opening in het oppervlak van de schedel met been wax, de hemostatische clips verwijderen en suture de hoofdhuid, het gebied rond de wond met een antibioticum crème (b.v., neosporin) jas en het dier terug te keren naar de kooi.
    Opmerking: Na het euthanasie-protocol goedgekeurd door de ethische Commissie institutionele, voor de experimenten die in dit artikel beschreven dieren waren diep verdoofd met een injectie i.p. 43 mg/kg ketamine en 7 mg/kg xylazine en onthoofd. Hersenen werden verwijderd, postfixed in formaline voor 48 h en paraffine ingesloten. Coronale secties (8 µm) van de hersenen waren gesneden gebruikend microtome.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Wij vergeleken beschadigd is door directe microinjection in de rat dorsale hippocampus en striatum met behulp van een kwarts-naald in vergelijking met twee classic, 26 G botte uiteinde en 30 G schuine rand (tip van de uitwendige diameter van 60 µM; een 20 µM diameter kant gat type C, Figuur 1) roestvrij stalen naalden. Voor dit doel, we ingespoten 2 µL van aCSF in het recht en dorsale hippocampus en striatum met respectievelijk de quartz en de stalen naald en...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De techniek die in dit artikel beschreven voldoet aan de behoeften die worden beschreven in de Introductie voor het optimaliseren van de microinjections die worden uitgevoerd voor verschillende doeleinden12. De hier beschreven naalden vermindering van de schade tot een minimum, in wezen niet-detecteerbare niveau; variantie met glas naalden (die gevoelig zijn voor buigen), kwarts naalden zijn rigide en zorgen voor een betrouwbare hit van de gewenste hersenen regio zelfs in diepe co...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk heeft gesteund door een subsidie van de Europese Gemeenschap [KP7-mensen-2011-IAPP project 285827 (EPIXCHANGE)].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Quartz capillairenSutter Instruments, Novato, CA USAQ100-50-10Zonder gloeidraad
PullerSutterP2000
Micropipet opslagopbergingWorld Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USAE210
Laser microdissectorLeica Microsystems, Wetzlar, DuitslandLMD6500
Hamilton spuitHamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸtzerbach, Duitsland19138-U
MicroinfusiepompUniventor, Zejtun, MaltaModel 864
Handmatige micro-injectiepompkitWPIItem#: MMP-KITKit waarmee micropipetten veilig kunnen worden bevestigd aan het stereotactische frame
Precisie boorProxxon28510 MicroMot 50/EKogellager aandrijfas met variabele snelheid
Kunstmatige cerebrale spinale vloeistofTocris3525
Naalden 26 G Blunt en 30 G BevelHamilton26 G Blunt: 19138-U
30 G Bevel: 20757
MicrotoomLeica, DuitslandLEICA RM212RT

Referenties

  1. Kirik, D., Rosenblad, C., Björklund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).
  2. Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity. Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).
  3. Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance. J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).
  4. Shoichet, M. S., Winn, S. R. Cell delivery to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).
  5. Simonato, M., et al. Progress in gene therapy for neurological disorders. Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).
  6. Björklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes. Brain Res. 317, 267-277 (1986).
  7. Paradiso, B., et al. Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).
  8. Falcicchia, C., et al. Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors. PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).
  9. Munoz, J. L., Coles, J. A. Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes. J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).
  10. Sutter Instruments. P-2000: Laser-Based Micropipette Puller. , Available from: http://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-2000.html (2017).
  11. Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).
  12. Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae. Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Kwartsnaaldenmicro injectie in de hersenenlaserpullerstereotaxisch framemicro injectiepomppreventie van weefselschadeherbruikbare naaldendiepe hersengebiedenaanpassing van naalden

Gerelateerde artikelen