Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Real-time iontophorese met tetramethylammonium om volume-fractie en tortuositeit van de extracellulaire ruimte van de hersenen te kwantificeren

12K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55755

⸱

24 juli 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Virginia, 2Department of Cell Biology, SUNY Downstate Medical Center, 3Neural and Behavioral Science Graduate Program, SUNY Downstate Medical Center, 4Division of Neonatology, University of Virginia, 5Department of Neuroscience and Physiology, New York University School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft real-time iontoforese, een methode die fysieke parameters meet van de extracellulaire ruimte (ECS) van de levende hersenen. De diffusie van een inert molecuul dat in de ECS wordt vrijgegeven, wordt gebruikt om de ECS volume fractie en tortuositeit te berekenen. Het is ideaal voor het bestuderen van acute omkeerbare veranderingen in hersen ECS.

Samenvatting

Deze review beschrijft de basisconcepten en het protocol om de real-time iontoforese (RTI) methode uit te voeren, de gouden standaard om de extracellulaire ruimte (ECS) van de levende hersenen te onderzoeken en te kwantificeren. De ECS omgeeft alle hersencellen en bevat zowel interstitiële vloeistof als extracellulaire matrix. Het transport van veel stoffen die nodig zijn voor hersenactiviteit, inclusief neurotransmitters, hormonen en voedingsstoffen, komt door diffusie door de ECS voor. Veranderingen in het volume en de geometrie van deze ruimte komen voor bij normale hersenprocessen, zoals slaap en pathologische aandoeningen, zoals ischemie. De structuur en de regulering van hersen ECS, vooral in zieke staten, blijft echter grotendeels onontgonnen. De RTI methode meet twee fysieke parameters van het levende brein: volume fractie en tortuositeit. Volume-fractie is het aandeel van het weefselvolume dat door ECS wordt bezet. Tortuosity is een maat voor de relatieve hinder die een stof tegenkomt wanneer het diffundeert door een hersenreactieGion in vergelijking met een medium zonder obstakels. In RTI wordt een inerte molecuul gepulst van een bron microelektrode in de hersenen ECS. Aangezien moleculen van deze bron diffunderen, wordt de veranderende concentratie van het ionen mettertijd gemeten met behulp van een ionen-selectieve micro-elektrode die ongeveer 100 μm is gepositioneerd. Uit de resulterende diffusiecurve kan zowel volumefractie als tortuositeit worden berekend. Deze techniek is gebruikt in hersenschijfjes van meerdere soorten (inclusief mensen) en in vivo om acute en chronische veranderingen in ECS te bestuderen. In tegenstelling tot andere methoden kan RTI zowel in realtime als omkeerbare en onomkeerbare veranderingen in de hersenen ECS worden bekeken.

Inleiding

De extracellulaire ruimte (ECS) is het netwerk van door elkaar verbonden kanalen buiten alle hersencellen en bevat zowel interstitiële vloeistof als extracellulaire matrix ( Figuur 1a en Figuur 1b ). De verspreiding van veel stoffen die nodig zijn voor de hersencelfunctie, met inbegrip van voedingsstoffen, hormonen en neurotransmitters, komt door diffusie door de ECS voor. Veranderingen in de fysieke parameters van deze ruimte, met inbegrip van volume, geometrie en extracellulaire matrix, kunnen de diffusie drastisch beïnvloeden door de ECS en de lokale ionconcentraties baden van de hersenen, die een belangrijke invloed hebben op de celfunctie van de hersenencel 1 , 2 .

Real-time iontoforese (RTI) wordt gebruikt om twee structurele kenmerken van een hersengebied te bepalen: volume fractie en tortuositeit 3 , 4 ,"Xref"> 5. Volumefractie ( a ) is het aandeel van weefselvolume dat door de ECS ( V ECS ) wordt bezet ten opzichte van het totale weefselvolume ( V weefsel ) in een representatief elementair volume;

figure-introduction-1

Tortuosity ( λ ) is de relatieve belemmering die een stof tegenkomt wanneer het diffundeert door een hersengebied in vergelijking met een medium zonder obstructies;

figure-introduction-2

Waar D * (cm 2 s -1 ) de effectieve diffusiecoëfficiënt van de stof in de hersenen en D (cm 2 s -1 ) is, is de vrije diffusiecoëfficiënt van de stof in een vrij medium, zoals verdunde agarosegel.

Vandaag de meest gebruikte sonde stof voor de RTI methode is het kleine kationtetramethylammonium (TMA). TMA heeft een molecuulgewicht van 74 g / mol, dissocieert volledig in oplossing en heeft één positieve lading. RTI studies met dit ion hebben aangetoond dat α figure-introduction-3 0,2 en λ figure-introduction-4 1,6 1 , 2 . Dit betekent dat de ECS ongeveer 20% van het totale hersenvolume bedraagt ​​en dat de diffusie van een klein inert molecuul ongeveer 2,5 keer langzamer voorkomt in de ECS dan in een medium zonder obstakels 3 . Beide α en λ variëren echter met de leeftijd van de hersenen, regio en staat en in pathologische omstandigheden 1 . Wijzigingen van deze parameters zijn gekoppeld aan de ontwikkeling van de hersenen, veroudering, slaap, epilepsie en vele andere fundamentele processen en hersenziekten 1, 6 . Terwijl andere technieken a en λ meeten, kan RTI zowel in gelokaliseerde gebieden van levend weefsel in realtime meten. Om deze reden is RTI een onontbeerlijk instrument geworden voor het onderzoeken van veranderingen in a en λ tijdens acute en omkeerbare uitdagingen.

De theorie ter ondersteuning van RTI werd oorspronkelijk gevalideerd door Nicholson en Phillips, en de techniek is sinds die tijd zeer uitgebreid gebruikt 4 , 7 . Experimenten die RTI gebruiken, beginnen met het vrijkomen van een puls van TMA van een bron-micro-elektrode door iontoforese in een verdunde agarosegel. Eens uitgeworpen diffundeerden de ionen vrij van de puntbron, waarbij ze kiezen uit een potentieel oneindig aantal willekeurige wegen ( Figuur 1d ). De veranderende concentratie van het ionen wordt mettertijd gemeten met behulp van een ionen-selectieve micro-elektrode (ISM) die ruwweg is gepositioneerd100 μm weg ( figuur 1c ). De veranderingen in TMA-concentratie worden getekend en op een curve aangebracht die de berekening van zowel D als het transportnummer van de iontoforese micro-elektrode mogelijk maakt (parameters beschreven in het protocol). Met deze waarden wordt de procedure herhaald in een hersengebied van belang om D * te verkrijgen en zowel α als λ te berekenen. Beheersing van de iontoforese micro-elektrode, dataverzameling, grafieken en montage van de TMA-concentratiecurve en berekening van de experimentele parameters worden doorgaans uitgevoerd door de programma's Wanda en Walter, die speciaal hiervoor zijn ontworpen (de software en hun handleidingen zijn Vrij verkrijgbaar bij de auteurs op aanvraag).

Het protocol gedeelte van deze review beschrijft de basisprocedures die nodig zijn voor het ontwerpen en uitvoeren van RTI in knaagdierbreinzen. De techniek is ook gebruikt in niet-staafEnt modellen, waaronder menselijke hersenen plakjes en in vivo hersenpreparaten 1 , 4 , 6 , 8 , 9 . Het gedeelte Representatieve resultaten biedt zowel ideale als niet-ideale resultaten om nuances in data-interpretatie te markeren. Tenslotte behandelt de discussie sectie probleemoplossingstechnieken, beperkingen van RTI, alternatieve technieken die gebruikt worden om de ECS te bestuderen en toekomstige toepassingen van RTI.

figure-introduction-5
Figuur 1: Diagrammen van diffusie via ECS. (A) Schema van ECS: Toont de grootte en locatie van het ECS in een typische hersenpreparaat. Geel markeert de ECS tussen de grijze hersencel processen. Het volume van de ECS bedraagt ​​ongeveer 20% van het totale weefsel volume ( dwz volume fractie = 0.2) onder fysiologische omstandigheden. ( B ) vergroot diagram van de ECS: benadrukt fysieke parameters die bijdragen aan tortuositeit, inclusief hersencel geometrie (grijs) en extracellulaire matrix (aangetoond als een netwerk van veelkleurige glycosaminoglycanen en proteoglycanen). ( C ) 3D-diagram van diffusie van een puntbron: Demonstreert de netto beweging van inerte moleculen van een iontoforetische bron naar een ISM. Met uitzondering van diffusiebarrières en cellulaire opname diffundeerden de moleculen in alle richtingen naar buiten, waardoor er een bolvormige concentratievoorzijde ontstaat. Het ISM kwantificeert de lokale concentratie van de inerte moleculen die vrijkomen van de iontoforetische bron. ( D ) Computer simulatie van diffusie in ECS van de hersenen: [Verre links] Instelling voor Monte Carlo simulatie; Groene bollen vertegenwoordigen hersencelprocessen en het rode kruis vertegenwoordigt een puntbron. Deze opstelling modelleren het hersenweefsel diagramma in figuur 1a . [Middenbeelden] 3 en6 moleculen die willekeurige bewegingen verrichten als ze diffunderen door de extracellulaire ruimte van de hersenen, weergegeven in 2 dimensies. [Verre rechts] Willekeurige wandelingen van veel moleculen die uit de puntbron worden vrijgegeven. De netto beweging van alle moleculen uit de puntbron is naar buiten, zoals afgebeeld in figuur 1c . De cumulatieve willekeurige wandelingen schetsen de ruimten tussen de cellen ( dwz de ECS, zie referentie 5 voor verdere uitleg). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures, die gebruikt werden om weefselmonsters te verkrijgen, waren goedkeuring door de dierethiek commissie bij SUNY Downstate Medical Center.

1. Voorbereiding van oplossingen en uitrusting

  1. Bereid een 150 mM NaCl-opvuloplossing voor de referentiekabel van het ISM. Bewaar het in een 10 ml spuit die is bevestigd aan een 0,22 μm filter (om bacteriën of deeltjes te verwijderen).
  2. Bereid een 150 mM TMA chloride (TMA-Cl) opvullingoplossing voor de microelektroden op. Bewaar het in een 10 ml spuit bevestigd aan een 0,22 μm filter. Bereid de TMA-Cl oplossingen (in dit protocol) uit een 5 M fabrikant voorraadoplossing om de juiste concentratie te waarborgen.
  3. Chlorideer minstens vier zilveren draden voor de fabricage van micro-elektroden door de draden in bleekmiddel (natriumhypochloriet) gedurende tenminste 2 uur te onderdompelen. Verwijder overtollige bleekmiddel met ethanol en laat de draden drogen.
  4. Bereid 50 ml 0,3% agarose in 150 mM NaCl en 0,5 mM TMA-Cl in een bekerEn bedek het. Gebruik agarose die poeder is en redelijk fris om goede diffusiemetingen te waarborgen.
  5. Verhit en meng de agarose-oplossing met een roerbalk om het op te lossen. Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur. Bewaar dit bij 4 ° C gedurende maximaal 1 week.
  6. Bereid een onverschillige (grond) elektrode uit van 4% agarose in 1 M KCl (richtingen in aanvulling A)
  7. Maak een kleine, poreuze beker die in de experimentele kamer kan passen en dat de elektrische continuïteit tussen de inhoud en de buitenomgeving mogelijk maakt ( figuur 2a ). Plaats een metalen ring op de bodem van deze beker om te voorkomen dat het drijft wanneer het gedeeltelijk ondergedompeld is in water.
  8. Gebruik seriële verdunning van een 5 M TMA-Cl voorraad om vijf 100 ml TMA-Cl oplossingen te maken voor de kalibratie van de ISM's. Oplossingen moeten eindconcentraties hebben van 0,5, 1, 2, 4 en 8 mM TMA-Cl, alles in 150 mM NaCl. Bewaar de kalibratieoplossingen in een afdichtbare beker om verdamping te voorkomen.

2. Elektronische instellingen

  1. Sluit de componenten van de RTI experimentele opstelling aan volgens het blokdiagram in figuur 2b ; Een versterker met twee ingangskanalen (waarvan er een zeer hoge impedantie voor het ion selectieve vat van de ISM moet zijn), een laagdoorlaatfilter ingesteld op 10 Hz, een grafische recorder, een A / D + D / A Converter, een iontoforetische eenheid (of een versterker die constante stroomimpulsen kan leveren) en een computer (PC) die de Wanda en Walter programma's uitvoert. Controleer de elektronische instellingen om te bevestigen dat alle aansluitingen op zijn plaats zijn.
  2. Scherm de experimentele opstelling in een geaarde behuizing (zoals een Faraday kooi), indien nodig, aangezien ISM's een hoge weerstand hebben en gevoelig zijn voor artefacten die door nabijgelegen bewegingen worden gecreëerd.
  3. Maak een dedicated ISM-kalibratie station bestaande uit een dubbele ingangsversterker, een kaartrecorder, een passende ISM-houder en een onverschillige grondelektrode. Als dat mogelijk is,Bescherm de behuizing. Sla deze stap over als de ISM's zijn gekalibreerd in de experimentele setup (stap 3.29)

figure-protocol-1
Figuur 2: Poreuze Experimentele Kop en Elektronische Setup. (A) Poreus experimentele cup: een poreus netwerk wordt gebruikt om een experimentele cup waarmee elektrische continuïteit tussen de agarose (binnen) en de experimentele baden fluïdum (buiten) te creëren. Op de bodem van de beker is een metalen ring aangebracht om te voorkomen dat de beker in de badoplossing drijft. ( B ) Blokdiagram van de RTI setup (stappen 2.1 en 2.2): Een ISM is aangesloten op een versterker (amp). De ISM heeft twee vaten. Eén bevat vloeibare ionenwisselaar (LIX) in de tip en genereert een spanning die evenredig is aan de logaritme van de TMA-concentratie bij de tip samen met de lokale omgevingsspanning; thE signaal pad wordt weergegeven door een rode lijn. Het andere vat van het ISM staat bekend als het referentievat en meet de omgevingsspanning aan het uiteinde van de ISM; Het is verbonden door een blauw signaalpad. De versterker heeft twee zogenaamde hoofdtrappen die verbinding maken met de ISM; Deze eenheden hebben een winst van 1 (x1) en passen de hoge impedantie van de micro-elektrode overeen met de lage impedantie van de rest van de versterkerschakeling. Het hoofdstadium dat verbonden is met het ion selectieve vat moet overeenkomen met een inkomende weerstand van ongeveer 1.000 MΩ, terwijl de weerstand van het referentiekanaal typisch ongeveer 10 MΩ is. Nadat het hoofdstadium is verlaten, wordt de spanning van de referentiekabel omgekeerd en afgetrokken van de spanning op het ion selectieve vat met behulp van een summing versterker (Σ) om de pure ion signaal spanning te verkrijgen. De uitgang van de versterker gaat over naar een signaal conditioning unit die extra versterking en een multipool low-pass filter (≤ 10 Hz, meestal een Bessel fiLter), die geluidsoverlast elimineert en signaal aliasing verhindert bij de analoge naar digitale omzetter (A / D). De uitgangen van het filter worden ook weergegeven op een strip chart recorder. De A / D converter digitaliseert de signalen en stuurt ze naar een pc (pc). De PC genereert ook een digitaal signaal dat wordt omgezet door een digitale-naar-analoge omzetter (D / A) naar een analoge spanningspuls die wordt toegevoerd aan de iontoforese-eenheid, die de spanning omzetten naar een stroomimpuls van constante amplitude en stuurt Naar de iontoforese micro-elektrode. Het iontoforese signaalpad wordt weergegeven door een groene lijn. Het gegevensverzamelings- en iontoforese signaal wordt onder de controle van het Wanda-programma, dat een uitvoerbestand voor elk diffusie-record genereert in de vorm van een spanning versus tijdopname, samen met alle parameters die het experiment definiëren. Een tweede programma, Walter, leest het uitvoerbestand en gebruikt ISM-kalibratiedata om de gedigitaliseerde spanningen om te zetten in concentraties. De concentratie veRsus tijdcurven worden vervolgens in Walter in de juiste oplossing aan de diffusievergelijking aangebracht. D en n t worden geëxtraheerd als het medium agarose is, en A en a worden geëxtraheerd als het medium hersenen is. Analoge signalen zijn solide lijnen; Digitale signalen zijn stippellijnen. Er is ook een onverschillige grondelektrode (niet afgebeeld) in het bad dat de plak bevat. Rode lijnen = ion signaal, blauwe lijnen = referentie signaal, groene lijnen = iontophorese commando, vaste lijnen = analoge, gestippelde lijnen = digitaal. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Bereiding en kalibratie van ion-selectieve microelektroden

  1. Maak een ISM met behulp van het protocol onder een dag voor het experiment. Maak ISM's in batches om ervoor te zorgen dat tenminste twee werk op de dag van het experiment.
    OPMERKING: De meeste ISM's zijn stabiel voor een dag oftwee. ISM fabricage is gevoelig voor vochtigheid en atmosferische omstandigheden. Niet elke micro-elektrode zal met succes kalibreren.
  2. Verwijder ongeveer 0,5 cm glas aan het uiteinde van een van de vaten van een dubbelborde borosilicate glazen capillaire met behulp van een oud paar tang.
  3. Chip een enkel vat aan het tegenoverliggende uiteinde van de capillaire ( afbeelding 3a ). Zorg ervoor dat het septum niet beschadigd is (kritisch). Let op: Draag bril om schade te voorkomen door projectielglas.
  4. Plaats de capillaire in een fles aceton gedurende ten minste 1 uur om verontreinigingen te verwijderen.
  5. Verwijder de capillaire uit het aceton en puls schoon, droog, gecomprimeerd stikstofgas of lucht erdoor om eventuele overmaat aceton te verwijderen. Verwijder alle acetonen in de capillaire, omdat rest aceton kan interfereren met silanisatie (cruciaal).
  6. Maak de tip van de micropipette op een verticale of horizontale trekker. Pas de parameters aan om een ​​pipet te trekken met een lange taps enScherpe punt, ongeveer 1 μm of minder in diameter. Aan het eind van deze stap wordt één capillaire gemaakt in twee pipetten ( figuur 3a ).
  7. Visualiseer een enkele micropipette onder een samengestelde, rechtopstaande microscoop met een 10X-doelstelling. Knip het uiteinde af met een glasmicroscoopdia, zodat de uiteindelijke diameter van de punt ( dwz beide vaten) tussen 2 en 5 μm ligt ( Figuur 3b ). Deze pipet wordt vanaf nu wel aangeduid als een ISM.
  8. Vul het gesneden vat van de ISM met 150 mM NaCl-referentieoplossing door de opening op de gescheurde kant met een 10 ml spuit die is bevestigd aan een 0,22 μm filter en een 28 G, 97 mm naald ( Figuur 3b ). Vul het vat niet meer dan drie vierde de hoogte van het vat.
  9. Vul het niet-gescheurde vat van het ISM met 150 mM TMA-Cl opvulling oplossing. Tik de ISM voorzichtig om luchtbellen uit de oplossing te kloppen. Controleer op bellen onder de microfoonRoscope gebruikt voor het kippen van de punt.
  10. Vlam de achterkant van het ISM met een Bunsen-brander om ervoor te zorgen dat er geen communicatie van de backfill-oplossing plaatsvindt over de septum aan de achterzijde van de ISM. Zorg ervoor dat de top vierde van de ISM droog is na het vlammen.
  11. Voeg een gechloreerde zilverdraad in de referentieoplossing van de ISM en buig de draad uit de capillaire om dit te markeren als referentievat ( Figuur 3c ). Zorg ervoor dat de draad in de backfill oplossing is ondergedompeld en gedurende de duur van het experiment in oplossing blijft.
  12. Schuif een korte lengte polytetrafluorethyleenbuisjes (ongeveer 20 cm lang) over de punt van een 25 G spuitnaald. Plaats het andere uiteinde van de buis in de achterkant van het ion-selectieve vat. Zorg ervoor dat de buis in het vat zit, maar boven de vuloplossing ( Figuur 3c ).
  13. Verhit een stok tandheelkundige was met een Bunsen-brander en sluit de buizen en de silvafel aanDraai ze in hun respectieve vaten ( Figuur 3c ). Zorg ervoor dat er een complete luchtafdichting wordt geproduceerd rond de plastic buis in het ion-selectieve vat (kritisch).
  14. Bereid een kleine, transparante glazen houder (5 ml of minder) van 4% chloortrimethylsilaan in xyleen op. Let op: Xylenen en silanen zijn zeer gevaarlijk voor de gezondheid; Behandel beide chemicaliën in een afzuigkap en verwijder het op een juiste manier.
  15. Plaats de container voor een stereo-dissectiemicroscoop die horizontaal in een afzuigkap is gemonteerd. Bevestig de ISM verticaal over de container met behulp van een micromanipulator ( Figuur 3d ).
  16. Dip de punt van de micro-elektrode in de chlorotrimethylsilaanoplossing.
  17. Bevestig een lege 10 ml spuit aan de 25-gauge naald die leidt naar de ISM. Pas de positieve luchtdruk van de spuit aan tot een bubble TMA-Cl oplossing is gevormd; Deze stap moet worden uitgevoerd onder directe visualisatie via de microscoop.
  18. Tik de houder van de ISM voorzichtig om de bubbel van de tip af te kloppen.
  19. Teken de chlorotrimethylsilaanoplossing tot een hoogte van ongeveer 1.500 μm in de punt van het ISM met behulp van een negatieve druk op de 10 ml spuit.
  20. Maak de chlorotrimethylsilaanoplossing volledig van de top van de ISM totdat een bubble TMA-Cl-oplossing bij de tip is ontstaan ​​( Figuur 3d ).
  21. Herhaal stappen 3.19 en 3.20 vijf keer. Zorg ervoor dat er per keer een even ononderbroken kolom vloeistof wordt getekend. Als er geen oplossing in de punt kan worden getekend, controleer of de buis is geblokkeerd, de luchtdichting onvolledig is of de punt van de ISM is geblokkeerd.
  22. Spoel alle chloortrimethylsilaanoplossing uit de tip tot een bubble van TMA-Cl-oplossing is gecreëerd.
  23. Terwijl u een positieve druk op de spuit vasthoudt, verwijder dan het ISM uit de xyleenoplossing. Zorg ervoor dat alle xyleenoplossing uit de ISM-tip wordt verdreven, aangezien overtollig xyleen de excuus zal ruïnerenHanger kolom gemaakt in de volgende stappen.
  24. Plaats de tip van het ISM in een kleine transparante container (hetzij de uitwisselaar kwam in of een kleine cuvette) met de vloeibare ionenwisselaar (LIX) voor TMA. Voer deze stap uit onder directe visualisatie met behulp van de horizontale microscoopinstelling.
  25. Breng een kleine hoeveelheid negatieve druk aan om een ​​minimale hoeveelheid van de LIX in de punt te trekken ( dus zodra LIX wordt gezien, ga dan de negatieve druk op).
  26. Ontkoppel de 10 ml spuit uit de buis en laat de ISM 5 minuten zitten. In die tijd zal de LIX de gesilaniseerde tip binnengaan totdat het een evenwichtstoestand bereikt.
  27. Verwijder de ISM van de LIX. Trek de buis uit het wisselkozijn (terwijl u zo min mogelijk wax verwijdert). Plaats een gechloreerde zilverdraad in de kleine opening die aan het achterkant van de ISM is gemaakt. Verzegel de draad in de opvulling van het wisselvatvat met gesmolten was.
  28. Laat de ISM toe om te zittenGedurende minstens 30 minuten Bevestig voltooide ISM's aan de binnenrand van een beker met behulp van een pluizige, tijdelijke lijm.
  29. Kalibreer de ISM door de spanning gemeten door de ISM in te nemen in elke kalibratieoplossing die is gemaakt in stap 1.8.
    OPMERKING: Kalibratie kan in een kalibratiestation worden uitgevoerd (zie stap 2.3) of in de experimentele setup. Deze procedure is beschreven in aanvulling B en in Haack et al 10 .
  30. Als de ISM-kalibratie succesvol was voor meerdere ISM's, pauzeer hier tot de dag van het voorgenomen gebruik. Zo niet, maak meer ISM's op.
  31. Op de dag van het experiment, kalibreer de micro-elektrode opnieuw (zie stap 3.29).

figure-protocol-2
Figuur 3: Bereiding van een ion-selectieve micro-elektrode. (A) ISM na chipping rug van de einden van een capillair en trekken (stappen 3,2-3,6): Eén vat aan beide uiteinden oFa glazen capillaire is afgebroken. Een ISM wordt gegenereerd door een dubbele barrelglaskapilla te trekken om twee micropipetten met fijne tips te genereren. ( B ) ISM na het vullen van beide vaten (stap 3.7-3.9): De punt van een enkele ISM is gesneden tot een diameter van 2-5 μm. Het ion-selectieve vat wordt teruggevuld met TMA-Cl, en het referentievat is teruggevuld met NaCl. ( C ) ISM voorafgaand aan de bekleding met chloortrimethylsilaan (stappen 3.11-3.13): Een gechlorideerde zilverdraad wordt in het referentiekarrel geplaatst. Polytetrafluorethyleen (PTFE) buizen is verbonden met een 25 G-naald en in de ion-selectieve vat geplaatst. Een luchtdichte afdichting bovenop beide vaten is gemaakt met behulp van tandwax. ( D ) Coating een micropipet met chlortrimethylsilaan (stappen 3.15-3.26): [Lage vergroting] Een ISM gesuspendeerd in chloortritimethylsilaan in lijn met een horizontaal gemonteerde stereomicroscoop. [Hoog vergroting] De weergave via een horizontaal gemonteerde stereomicroscOpe van een ISM tip in chlorotrimethylsilane oplossing. Na visualisatie van de tip door middel van een microscoop wordt een kleine hoeveelheid TMA-Cl oplossing uit het ion selectieve vat verwijderd (genoeg om een ​​kleine bubble van TMA-Cl oplossing te genereren). De ISM-houder wordt getikt om een ​​TMA-Cl-oplossingbubble vrij te maken en vervolgens wordt chlorotrimethylsilaan in de punt opgesteld. Deze cyclus wordt meerdere malen herhaald. Nadat alle chlorotrimethylsilanen uit het ISM zijn uitgezet, wordt de ISM in de vloeibare ionenwisselaar (LIX) geplaatst voor TMA en LIX wordt in de punt van het ion selectieve vat getrokken. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Bereiding van Iontophorese Microelektroden

OPMERKING: Iontophorese microelektroden moeten op de dag van het experiment worden vervaardigd.

  1. Trek een dubbelborde borosilicate glazen capillaire op een verticaal of hoHorizontale trekker. Pas de parameters aan om een ​​pipet te trekken die lijkt op de micropipetten die in stap 3.6 zijn getrokken ( figuur 4a ).
  2. Plaats de micropipet onder de samengestelde microscoop die in stap 3.7 gebruikt wordt en snijd de tip af met een glasmicroscoopdia, zodat de resulterende diameter tussen 2 en 5 μm ligt ( Figuur 4a ).
  3. Vul beide vaten met de 150 mM TMA-Cl-vullingsoplossing met een 10 ml spuit aan een 0,22 μm filter en een 28 G, 97 mm naald ( Figuur 4a ).
  4. Tap de micropipette voorzichtig om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de oplossing van beide vaten worden gelaten.
  5. Plaats gechlorideerde zilveren draden in beide vaten van de micropipette. Zorg ervoor dat de kabels diep genoeg zijn in de backfill-oplossingen, zodat ze gedurende de duur van het experiment in contact blijven met de oplossingen.
  6. Zet de draden in de vaten met behulp van heet tandheelkundige was. Sluit voorzichtig t Hij draagt ​​door hen om elkaar te draaien (voltooide micro-elektrode getoond in figuur 4b ).

figure-protocol-3
Figuur 4: Bereiding van een Iontophorese Microelektrode. (A) Iontoforese microelektrode na opvullen beide lopen (stappen 4,1-4,3): Een micro-elektrode iontoforese wordt getrokken uit een capillaire buis. De punt van de micro-elektrode wordt gesneden tot een diameter van 2-5 μm. Beide vaten van de iontoforese micro-elektrode worden gevuld met TMA-Cl-oplossing. ( B ) Voltooide iontoforese micro-elektrode (stappen 4.5-4.6): Een iontoforese micro-elektrode met twee gechlorideerde zilveren draden die in de vaten worden ingebracht. De vaten van de micro-elektrode worden afgesloten met wax en de zilveren draden zijn aan de achterzijde van de micro-elektrode aan elkaar gedraaid./files/ftp_upload/55755/55755fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

5. Bereiding van Kunstmatige Cerebrospinale Vloeistof- en Knaagdruppelhersenweefselplakken

  1. Bereid 1 liter kunstmatig cerebrospinale vloeistof (ACSF) op met een samenstelling die geschikt is voor het experiment en voeg 0,5 mM TMA-Cl daaraan toe.
    OPMERKING: De TMA-Cl is nodig om een ​​achtergrondconcentratie van TMA tijdens het experiment vast te stellen.
  2. Bereid de plakken van knaagdieren met een dikte van 400 μm volgens de standaardprotocollen 11 , 12 . Gebruik het ACSF dat in stap 5.1 is voorbereid voor de dissectie en het onderhoud van hersenschijfjes.

6. Real-time Iontophorese in Agarose

  1. Zet de computer aan met de Walter- en Wanda-programma's.
    OPMERKING: Deze programma's zijn vrij beschikbaar op aanvraag. Hoewel deze software niet essentieel is, is het soortgelijk programmerenSoftware of het uitvoeren van de analyse met de hand anders zou nodig zijn.
  2. ACSF via de submersiekamer met een passende snelheid uitvoeren ( bijv. 2 ml / min). Stel de temperatuurregelaar in voor de duur van het experiment op een gewenste temperatuur en bel ACSF met 95% O 2 /5% CO 2 (of een ander geschikt gasmengsel).
  3. Monteer een onverschillige (grond) elektrode in een passende houder en dompel de tip in de ACSF door de onderdompelingskamer. Sluit de draad aan op de grond van de opname-instelling.
  4. Vul de poreuze kop (gemaakt in stap 1.7) met de eerder bereide 0.3% agarose en plaats het in de onderlaagkamer. Zorg ervoor dat de oplossing niet over de bovenkant van de beker loopt.
  5. Bevestig een gekalibreerde ISM aan de pipethouder van een micromanipulator en een iontoforese microelektrode naar de tweede. Zet de houders in een hoek die geschikt is voor de instelling ( afbeelding 5a ).
  6. AansluitenDe ISM en de iontoforese micro-elektrode draden naar hun respectieve hoofdfasen van de opnameversterker. Als alternatief kunt u direct op de versterker aansluiten (afhankelijk van de instelling).
  7. Zorg ervoor dat het gewicht / de positie van de verbindingsdraden of clips geen beweging van de microelektroden veroorzaakt, aangezien kleine fluctuaties in positionering de resultaten kunnen beïnvloeden.
  8. Schakel de elektronische instelling in (vanaf stap 2). Start Walter en Wanda in aparte gevallen.
  9. Klik in de Wanda GUI op "Calibreren" ( Figuur 6a ). Vul in de kalibratiebox ( figuur 6b ) de spanningen in die tijdens de ISM-kalibratie zijn gemeten (stap 3.29) en klik op "Pas gegevens op".
    OPMERKING: hiermee kunt u de volgende weergave van de Nicolsky-vergelijking aanpassen (alternatief de equatie op een andere manier passen om M en K te verkrijgen):
    figure-protocol-4
    HaarE, V is de gemeten spanning (mV), M is de Nicolsky-helling (mV), C is de concentratie van ionen (mM), K is de interferentie (mM) en V 0 is de offset-spanning (mV) 3 .
  10. Klik op 'Accepteren' in het vak Calibreren om automatisch de helling ( M ) en interferentie ( K ) die in stap 6.9 is gegenereerd, automatisch over te dragen naar de hoofd GUI.
    OPMERKING: Hier vertegenwoordigt K de Na-inmenging, die gewoonlijk verwaarloosbaar is.
  11. Controleer aan de linkerkant van de GUI dat alle experimentele parameters in overeenkomstige ingangen zijn ingesteld ( Figuur 6a ).
    1. Stel in de bronmethode de bron in op de iontoforetische bron (standaard), de "Record Duration" op "200 s" (standaard), de "Pulse Begin" naar "10 s" (standaard), de "Pulse End" Naar "60 s" (standaard), de "Bias Current" naar "20 nA" (standaard), de"Hoofdstroom" naar "100 nA" (standaard) en de "Conversiefactor" naar een geschikte waarde.
    2. In de Meet elektrode doos, instel "Bad C" op de concentratie van TMA binnen de badoplossing (uitgedrukt in mM). Stel de 'Total Gain', 'Output Channel', 'ISM Channel' en 'Ref Channel' in op passende waarden voor het gegevensverzamelingssysteem dat in gebruik is.
      OPMERKING: De "Conversion Factor" moet op een geschikte waarde (specifiek voor de iontoforetische eenheid in gebruik) zijn ingesteld. Deze waarde specificeert de hoeveelheid stroom die voor een gegeven toegepaste spanning wordt doorgegeven van de D / A-converter (nA / mV).
  12. Plaats een temperatuursensor in de agarbeker. Noteer de gemeten temperatuur in de "Temperatuur" -toets in het vak "Meet elektrode" van de GUI ( Figuur 6a ).
  13. Zet de subfase-verlichting aan. Draai indien nodig de camera aan op de microfoonRoscope en camera monitor.
  14. Laat de micro-elektroden minstens 1,000 μm diep in de agarose zakken en centraal in de beker ( Figuur 5b ). Visualiseer ze onder de microscoop met behulp van een 10X-doelstelling (waterdichtingsdoel met een lange werkafstand).
  15. Controleer de spanning op de versterker op 0 mV voor zowel referentie- als ISM-kanalen om de in de agarose opgenomen spanning als uitgangspanning te bepalen.
  16. Op de tweekanaalsversterker verplaats de ISM-kanaalschakelaar handmatig naar de spanningsaftrekkingsuitgang om de aftrek 'aan' tussen de referentie- en ISM-kanalen in te stellen.
    OPMERKING: Subtractie zorgt ervoor dat de spanning verandert in het ISM-kanaal alleen de veranderingen in de TMA-concentratie weerspiegelen.
  17. Verplaats de ISM zodat het de tip van de iontophorese micro-elektrode raakt. Centreer de uiteinden op elkaar in alle drie de richtingassen.
  18. Zero de relatieve posities van beide micro-elektroden op deMicromanipulator controleboxen. Zorg ervoor dat de micro-elektroden nauwkeurig en nauwkeurig (kritisch) centraal staan.
  19. Verplaats de ISM 120 μm van de iontoforese micro-elektrode in één as (de linker-rechter as, Figuur 5b ). Voer deze afstand in in het vak 'Meet elektrode' van de GUI ( Figuur 6a ).
  20. Start een opname door op "Acquire" te klikken in de GUI ( Figuur 6a ); Laat het programma toe om een ​​volledige opname op te nemen.
    OPMERKING: De iontophorese microelektrode ontvangt een constante biasstroom. Nadat u op "Acquire" hebt geklikt, is er een korte vertraging voordat de hoofdstroom voor een beperkte duur wordt toegepast.
  21. Herhaal stap 6.20 twee tot drie keer. Wacht tot het TMA-signaal terugkeert naar de basislijn voordat u nieuwe records verwerven; Het programma slaat elk record op voor latere analyse.
  22. Controleer de afstand van de twee microelektroden door de ISM terug te bewegen tO de nulpositie die door de controlebox is opgegeven. Als de microelektroden niet meer gecentreerd zijn, moet u ze opnieuw centreren met dezelfde strategie als in stap 6.17. Noteer wijzigingen in de positie van de elektroden.
    OPMERKING: als de spatie met meer dan ongeveer 2% verandert, kunnen de in stap 6.19 verkregen records niet als accuraat worden beschouwd en moeten er nieuwe worden opgenomen.

figure-protocol-5
Figuur 5: Opzet voor experimenten in agar. (A) Configuratie voor experimenten in verdunde agar (stappen 6,1-6,5): Een kleine poreuze bak met verdunde agar geplaatst in een lopende perfusiekamer. Een micro-elektrode (ionografische) micro-elektrode (linkszijde) en een ISM (rechtse kant) worden gehouden door micro-elektrodehouders; Microelektrodehouders zijn in de armen van robot micromanipulators aangebracht. Een temperatuursensor wordt in agar gel geplaatst en een onverschillige grondelektrode is plIn de submersiekamer. ( B ) Vergrote weergave van microelektroden in agar: Een iontoforese microelektrode (linkerkant) en een ISM (rechtse kant) worden in agar weergegeven met behulp van een 10x waterdempingsdoel (objectief gedompeld hier in 150 mM NaCl). Microelektroden worden gepositioneerd met behulp van micromanipulatoren tot een diepte van 1000 μm; De afstand tussen microelektroden is 120 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-6
Figuur 6: Wanda Computer Software Interface. (A) navigeren Wanda grafische gebruikersinterface (GUI): Het scherm dat na het openen van de Wanda software weergegeven. In vak (1) worden de juiste medium, iontoforese molecule en techniek geselecteerd. (2) "Kalibreren" is geklikt om te openenDe Wanda kalibratie doos. Nadat de ISM is gekalibreerd (zie Figuur 6b en Aanvulling B), is de ISM gepositioneerd in agar of hersenen, zoals beschreven in stappen 6 en 8 van het protocol. In vak (6) worden alle passende waarden voor het uitgevoerde experiment ingevoerd. (7) 'Acquire' is geklikt om een ​​opname te maken; Een grafiek van spanning versus tijd verschijnt in het bovenste gedeelte van de Wanda GUI. ( B ) ISM in Wanda kalibreren : Het venster dat opent na het klikken op (2) "Calibreren" in de Wanda GUI. De waarden uit stap 3.29 worden ingevuld in vak (3), en (4) "Fit Data" is geselecteerd. De kalibratiekromme wordt bevestigd lineair te zijn. (5) 'Accept' is geklikt om terug te keren naar de Wanda GUI. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

7. Agarose Data Analysis

  1. Open deWalter programma op de computer (pc). In het menu "0. Records From:" klikt u op de knop "Wanda / VOLTORO" om de records die door Wanda worden gegenereerd te lezen ( Figuur 7a ). Als u wilt dat de uitvoer naar een spreadsheet is vereist, open de juiste software. Klik op "Sheet 1.3" in de "1. Write Excel?" Menu ( figuur 7b ).
  2. Selecteer in het volgende pop-upvenster de (te) record (en) die te lezen en klik op "Openen" ( Figuur 7b ); Let op dat de records automatisch worden gepografeerd. Voer de volgende stappen uit om de montageprocedure te starten.
    1. Klik in het menu '2. Opties' op de knop 'select rec'. In het pop-upvenster " Figuur 2 ", gebruik de muis om de kruispunten te verplaatsen over het eerste record dat moet worden verwerkt ( Figuur 7c ); Druk op de muisknop om het record te kiezen.
    2. Klik op oN "fit curve" in het menu. Selecteer het gewenste aantal iteraties van montage; Gebruik tenminste 20 iteraties van de montage om een ​​correcte pasvorm van de gegevens te verkrijgen.
    3. Selecteer in het menu "alles" om alle data punten te passen en selecteer "doorgaan" Het programma past de weergegeven curve aan. Let op de montageprocedure en vergelijk het experimentele record met de verkregen beste curve.
  3. Selecteer de optie om het resultaat te schrijven in het betreffende spreadsheetprogramma door op "Excel" in het menu "7. Resultaten" te klikken ( Figuur 7d ). Let op (en record) de volgende kritische gegevens die worden gebruikt om de functionaliteit van de iontoforese micro-elektrode te bepalen: ' D (E5) ', ' Reference D (E5) ', ' r_app ', transportnummer ' n t ', ' Apparent N t '.
    OPMERKING: " D (E5) ": Gemeten vrije diffusiecoëfficiënttx 10 5 (cm2 / s); " Referentie D (E5) ": Theoretische vrije diffusiecoëfficiënt x 10 5 (cm 2 / s). Deze waarde wordt geëxtraheerd vanuit een database binnen Walter, gebaseerd op de ionen, het medium en de temperatuurinvoer. " R_app ": schijnbare micro-elektrodeafstand (cm), berekend op basis van de gemeten en referentie D (E5) . " N t ": Transportnummer (dimensieloos). Dit getal bepaalt de fractie van de iontoforese stroom die wordt gebruikt om TMA 4 vrij te geven . " Schijnbaar n t ": Schijnbaar transportnummer (dimensieloos). Dit is een transportnummer berekend vanaf r_app . Dit getal moet dicht bij de gemeten n t liggen .
  4. Herhaal stappen 7.1-7.3 voor elk van de records voor een gekozen paar microelektroden.
  5. Bepaal of de iontoforese microelektrode bruikbaar is door het volgende te doen.
    1. Vergelijk " r_app" met de werkelijke r ( dwz 120 μm); Dit criterium is vervuld indien de gemiddelde waarden van alle proeven binnen 4% van elkaar liggen.
    2. Vergelijk " D (E5)" met de referentie D (E5) ; Dit criterium is vervuld indien de gemiddelde waarden van alle proeven binnen 8% van elkaar liggen.
    3. Vergelijk de " n t " tussen proeven met dezelfde micro-elektrode; Dit criterium is vervuld indien de gemiddelde waarden van alle proeven binnen 10% van elkaar liggen.
  6. Als een van de criteria uit stap 7.5 niet is voldaan, moet u de ionophorese micro-elektrode oplossen of een andere testen.
  7. Als het micro-elektrode van de iontoforese geschikt wordt geacht voor het experiment, record het gemiddelde transportnummer van alle proeven in het veld Transportnummer N in de Wanda GUI ( Figuur 6a ).

jove_content "> figure-protocol-7
Figuur 7: Walter Computer Software Interface. (A) Het kiezen van het programma voor gegevensverzameling in Walter: De "0. Records From:" menu opent na het starten van de Walter software. De optie om de door Wanda opgeslagen bestanden te laden wordt geselecteerd door op de knop "Wanda / Voltoro" te klikken. ( B ) De data- en data-analyse-uitvoerplaats in Walter selecteren: [Links] Nadat het betreffende spreadsheetprogramma is geopend, wordt "Sheets 1.3" gekozen om alle Walter-data-analyses uit te voeren naar het eerder geopende spreadsheetprogramma. [Rechts] Nadat de data-analyse uitgangslocatie is gekozen, wordt een pop-upvenster geopend waardoor de gebruiker de eerste en laatste opnamen kunt kiezen die door Walter worden gelezen. ( C ) De opname kiezen om te analyseren in Walter: [Rechts] Nadat de bestanden die u wilt lezen gekozen worden, wordt een pop-upvenster geopend met alle geselecteerde records disGespeeld als een grafiek (" figuur 2 "). [Links] In het menu "2.Opties" wordt "select rec" geklikt, en de muis wordt gebruikt om de crosshairs te verplaatsen om de eerste opname voor analyse te identificeren; Of met de muisknop wordt gedrukt om de opname te kiezen. ( D ) Exporteren van de data analyse van Walter naar een spreadsheet: Na het aanpassen van de gegevens verschijnen een pop-upvenster en het menu "7. Resultaten". [Links] Grafiek van de geselecteerde opname (blauw) met de gepaste diffusiecurve die door Walter (rood) wordt gegenereerd. [Rechts] Met het menu "7. Resultaten" kan de gebruiker de gegevens van de analyse naar een spreadsheetprogramma schrijven door op de knop "Excel" te klikken. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

8. Real-time Iontophorese in Brainschijfjes

  1. Plaats een 400 μm dikke hersen sLuizen in de opname kamer, zodat het volledig ondergedompeld is in de vloeiende ACSF. Plaats de plak met een waterverf pensel en beveilig het voorzichtig met een rooster.
  2. Beweeg zowel de iontoforese microelektrode als de ISM boven het veld van belang op de breinschijf. Onderdompelen zowel in de stromende ACSF maar boven de plak.
  3. Controleer de spanning voor zowel de referentie als de ion-sensingskanalen op "0" mV. Wacht tot de spanning in beide kanalen stabiliseert. Markeer de spanning gemeten op het ijzensensiekanaal van de ISM op de kaartrecorder. Gebruik hiervoor de basiswaarde V-parameter in Wanda.
  4. Plaats de ISM en de iontoforese microelektrode 200 μm diep in de plak en 120 μm van elkaar af. Wacht op de stabilisatie van het signaal na het verplaatsen van de micro-elektrode in de hersenschijf.
    OPMERKING: De biasstroom die wordt toegepast op de iontoforese micro-elektrode veroorzaakt een kleine accumulatie van TMA. Het is een gewone fout om ar te nemenOpnemen te vroeg en onderschatten de signaalopbouw.
  5. Merk op de grafische recorder de gestabiliseerde spanning gemeten in de hersenschijf op het ion-sensing kanaal van de ISM. Bereken het spanningsverschil tussen het TMA-signaal gemeten in stap 8.3 en stap 8.4 en voer deze waarde in in het veld "Baseline V (mV)" in de Meet Electrode-box van de Wanda GUI ( Figuur 6a ).
  6. Controleer aan de linkerkant van de GUI dat alle experimentele parameters correct zijn opgenomen / ingevoerd. Stel 'Medium' in 'Brain', 'Transportnummer' op de gemiddelde waarde berekend voor de iontoforese micro-elektrode in stap 7.4, en 'Temperatuur' op de temperatuur van het bad dat het segment bevat.
    OPMERKING: V moet voor elke set metingen worden opgenomen. De basislijn V wordt door Wanda omgezet in de basis C (mM) parameter ( dwz de concentratie van TMA in het hersenweefsel).
  7. Start de opname door op "Acquire" te klikken en laat het een volledige opname maken. Wacht tot het TMA-signaal terugkeert naar de basislijn voordat u een nieuwe opname krijgt.
  8. Neem twee tot drie opeenvolgende opnames voordat u de microelektroden van de gekozen hersenlocatie verwijdert. Voer de temperatuur onmiddellijk voor elke opname in de Wanda-software in.
  9. Beweeg beide microelektroden diagonaal terug naar het oppervlak van de plak. Raak beide naar tenminste 50 μm boven de plak. Bepaal met behulp van de grafische recorder alle veranderingen tussen de V gemeten en de meting van stap 8.3.
  10. Centrum de tips van het ISM en de iontoforetische micro-elektroden in relatie tot elkaar in de x-, y- en z-assen. Verkrijg spatiewijzigingen, indien aanwezig, van het display van de micromanipulator controlebox.

9. Brain Data Analysis

  1. Open een nieuwe spreadsheet voor de analyse-uitvoer.
  2. Herhaal stap 7.1-7.4 in Walter om te analyserenE de opnames uit de hersenen.
  3. Schrijf de gegevens op het spreadsheet programma door op "Excel" in het Walter menu te klikken. Noteer de a , volume fractie van de hersenen ECS; Λ , tortuositeit van de hersenen ECS; En k (s -1 ), niet-specifieke klaring.

10. Transportnummer en ISM-kalibratie controleren

  1. Meet de ISM transportgetal (NT) aan het einde van het experiment via het onderstaande protocol. Alternatief, controleer n t na kritisch onderzoek of bij de meting worden weergegeven abnormaal. Het controleren van n t te vaak kan echter leiden tot trauma aan de breinschijf.
  2. Neem nieuwe opnames in agarose. Zie stappen 6.4, 6.11, 6.12, 6.14, 6.15 en 6.17-6.22.
  3. Herhaal stap 7.1-7.4 in Walter om de n t van de nieuwe agarose opnames te verkrijgen. Controleer de spreadsheet: als de n t is veranderd met meerdan 10% van de n t verkregen vóór de hersenmetingen, de met deze iontoforetische microelektrode gegevens niet betrouwbaar.
  4. Voer een nieuwe kalibratie uit (zie stap 3.29) voor de ISM nadat alle hersendata is verzameld. Gebruik de nieuw verkregen ISM-kalibratiedata als invoer in het Wanda Calibrate-vak (zie stappen 6.9 en 6.10) en controleer of de hellingswaarde met minder dan 10% van de vorige kalibratie verschilt.
    OPMERKING: De gegevens die bij deze ISM zijn verkregen, zijn niet betrouwbaar indien de hellingswaarde met meer dan 10% van de vorige kalibratie verschilt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het nut van de RTI techniek wordt aangetoond in een experiment dat is ontworpen om de veranderingen in a en tijdens een hypoosmolaire uitdaging te meten ( Figuur 8 en Figuur 9 ). Het is eerder aangetoond dat het verminderen van de osmolariteit van de ECS door wassen op hypotonische ACSF een afname in a en een toename van λ 13 zal veroorzaken .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

figure-discussion-1
Figuur 10: Niet-ideale gegevens die gemeenschappelijke technische problemen tonen. (A) Schema van gemeenschappelijke technische problemen met iontoforese micro-elektroden: Vergelijking van de normale release van TMA uit een functionerende iontoforese micro-elektrode met drie bronnen demonstreren technische problemen. [Hoge vergroting, a1] De stroom in een ideale iontoforetische bron wordt gelijk ve...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Het werk werd ondersteund door NIH NINDS subsidie ​​R01 NS047557.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
A/D- en D/A-converterNational Instruments CorporationNI USB-6221 DAQDe NI USB-6221 wordt nog steeds verkocht als een 'Legacy'-apparaat door NI. Ze bevelen NI USB-6341 X Series DAQs aan voor nieuwe installaties, maar we hebben de nieuwere eenheden niet getest. We beschrijven het gebruik van de NI USB-6221 met MATLAB en Windows 7 (32-bits). Alternatieven: de veel oudere PCI-MIO-16E-4 A/D-converter (alleen gebruikt onder Windows XP of ouder OS) met BNC-2090 BNC-connectorpaneel en SH68-68-EP-kabel. Zoals vermeld in de Wanda-handleiding, is er een experimenteel MATLAB-programma beschikbaar om Axon Binary Files te gebruiken.
agaroseLonzaNuSieve GTG Agarose #50081om verdunde agarosegel voor RTI-metingen voor te bereiden
versterker voor ISMDaganModel IX2-700 Dual Intracellulaire Voorversterkerionen- en referentiespanningsversterker met N=0,1 (voor referentievat) en N=0,001 (voor ionenvat) headstages
biologisch samenstelling microscoop (met 4x en 10x objectief)voor het chippen van de micro-elektrodenpunten en het inspecteren van micro-elektroden; verschillende leveranciers, bijv. AmScope
borosilicaat theta capillair glasbuisHarvard ApparatusWarner Instruments model TG200-4; order #64-0811dubbelbuisglas voor ionen-selectieve micro-elektroden en iontoforetische micro-elektroden; O.D. 2,0 mm, I.D. 1,4 mm, septum 0,2 mm, lengte 10 cm
kwastWinsor & NewtonUniversity Series 233, maat 0ronde korte handgreepkwast, verkrijgbaar bij Amazon
bunsenbranderFisher
camera voor het visualiseren van micropipettenOlympusOLY-150vereist monitor, IR-filter op substage verlichting is optioneel
chart recorderom continue spanningen op ionen-selectieve micro-elektrode tijdens kalibratie in tetramethylammonium-standaarden en tijdens RTI-experiment te registreren; bijv. Kipp & Zonen type BD112 dual-cannel chart recorder, verkrijgbaar gereviseerde
chlorotrimethylsilaan, puriss., > 99%Sigma-Aldrichcatalogus # 92360voor silanisering; VOORZICHTIG: ontvlambaar, acute toxiciteit (oraal, dermaal, inademing), huidcorrosion, oogschade, reageert heftig met water, zie Sigma-Aldrich Veiligheidsinformatie voor volledige beschrijving
Commerciële SoftwareThe MathWorksMATLAB, Data acquisitie toolkitvoor data acquisitie en analyse met behulp van Wanda en Walter programma's. Merk op dat een academische licentie beschikbaar is.
oogbeschermende brilFisher
vaste draaistelling compound microscoopOlympusBX51WIkan andere compound microscopen met vaste draaistellingen gebruiken
pincettenFine Science Tools#11251-10om glas capillair te chippen; Dumond #5, bij voorkeur gebruikt en niet langer nodig voor fijn werk
afzuigkapvoor silanisering en het vullen van de punt van ionen-selectieve vat met vloeibare ionenwisselaar; verschillende leveranciers, bijv. Captair met geschikte filter verkocht door Erlab
glas microscoopglasFisher#12-550Aom micro-elektrode punten te chippen
verwarming/roerderFisherCorning PC-420Dom verdunde agarosegel te bereiden en oplossingen te roeren
iontoforetische unitDaganION-100 en PS-100ION-100 is een enkelkanaals iontoforetische eenheid +/- 130 V compliance; PS-100 is een externe voeding; alternatieven: bijv. Axoprobe-1A gemaakt door Axon Instruments (nu Molecular Devices), niet meer in productie, controleer beschikbaarheid van gereviseerde eenheden (eBay en andere sites)
vloeibare ionenwisselaar (LIX) voor tetramethylammoniumWorld Precision InstrumentsIE190 Kalium IonenwisselaarOpmerking: dit is gelijkwaardig aan de originele Corning-kaliumwisselaar 477317 op basis van tetrafenylboraat - niet verwarren met neutrale drager kaliumwisselaar afkomstig van het laboratorium van Dr. Simon, ETH, Zürich, die geen tetramethylammonium detecteert, en wordt verkocht door Fluka. U kunt ook zelf vloeibare ionenwisselaar voor tetramethylammonium maken: 3% per gewicht kalium tetrakis = (p-chloorfenyl)boraat opgelost in 2,3-dimethylnitrobenzeen. Koop chemicaliën bij Fluka (nu onderdeel van Sigma). Zie Oehme en Simon (1976) Anal. Chim. Acta 86: 21-25; VOORZICHTIG: De toxicologische eigenschappen van deze vloeibare ionenwisselaar zijn niet volledig bepaald. Inslikken of contact met het menselijk lichaam kan schadelijk zijn. Wees voorzichtig! Vloeibare ionenwisselaars moeten op een koele plaats worden bewaard, buiten direct zonlicht.
micro-elektrode houderWPIM3301EHom ionen-selectieve micro-elektrode voorfabricaat voor silanisering te houden en de punt van ionen-selectieve vat te vullen met vloeibare ionenwisselaar; WPI verkoopt twee versies van deze houder, doorzichtige M3301EH en zwarte M3301EH. Volgens onze ervaring lijkt de doorzichtige M3301EH steviger te zijn dan de zwarte M3301EH.
micromanipulatorNarishigeMM-3om ionen-selectieve micro-elektrode voorfabricaat te positioneren tijdens silanisering en het vullen van de punt van ionen-selectieve vat met vloeibare ionenwisselaar; kan worden vervangen door elke drie-assige micromanipulator in goede werkende staat
micropipet pullerSutter InstrumentsModel P-97om dubbelbuisglasbuis te trekken; andere pullers kunnen worden gebruikt zolang ze grote diameter dubbelbuisglasbuis kunnen plaatsen
microprobe thermometerPhysiotempModel BAT-12Rfijne sonde van deze thermometer wordt dicht bij opnameplaats geplaatst
naaldBDSpuiten en Naalden

Referenties

  1. Sykova, E., Nicholson, C. Diffusion in brain extracellular space. Physiol Rev. 88 (4), 1277-1340 (2008).
  2. Nicholson, C. Diffusion and related transport mechanisms in brain tissue. Rep Prog Phys. 64 (7), 815-884 (2001).
  3. Nicholson, C. Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment. J Neurosci Methods. 48 (3), 199-213 (1993).
  4. Nicholson, C., Phillips, J. M. Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum. J Physiol. 321, 225-257 (1981).
  5. Nicholson, C., Sykova, E. Extracellular space structure revealed by diffusion analysis. Trends Neurosci. 21 (5), 207-215 (1998).
  6. Xie, L. L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
  7. Hrabetova, S., Nicholson, C. Biophysical properties of brain extracellular space explored with ion-selective microelectrodes, integrative optical imaging and related techniques. Electrochemical Methods for Neuroscience Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC press. 167-204 (2007).
  8. Rice, M. E., Okada, Y. C., Nicholson, C. Anisotropic and heterogeneous diffusion in the turtle cerebellum: implications for volume transmission. J Neurophysiol. 70 (5), 2035-2044 (1993).
  9. Vargova, L., et al. Diffusion parameters of the extracellular space in human gliomas. Glia. 42 (1), 77-88 (2003).
  10. Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. Double-barreled and concentric microelectrodes for measurement of extracellular ion signals in brain tissue. J Vis Exp. (103), (2015).
  11. Xiao, F., Hrabetova, S. Enlarged extracellular space of aquaporin-4-deficient mice does not enhance diffusion of Alexa Fluor 488 or dextran polymers. Neuroscience. 161 (1), 39-45 (2009).
  12. Sherpa, A. D., Pvan de Nes,, Xiao, F., Weedon, J., Hrabetova, S. Gliotoxin-induced swelling of astrocytes hinders diffusion in brain extracellular space via formation of dead-space microdomains. Glia. 62 (7), 1053-1065 (2014).
  13. Kume-Kick, J., et al. Independence of extracellular tortuosity and volume fraction during osmotic challenge in rat neocortex. J Physiol. 542 (Pt 2), 515-527 (2002).
  14. Saghyan, A., Lewis, D. P., Hrabe, J., Hrabetova, S. Extracellular diffusion in laminar brain structures exemplified by hippocampus. J Neurosci Methods. 205 (1), 110-118 (2012).
  15. Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. Fabrication and use of high-speed, concentric H+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording. J Neurophys. 96 (2), 919-924 (2006).
  16. Nicholson, C. Diffusion from an injected volume of a substance in brain tissue with arbitrary volume fraction and tortuosity. Brain Res. 333 (2), 325-329 (1985).
  17. Nicholson, C., Tao, L. Hindered diffusion of high molecular weight compounds in brain extracellular microenvironment measured with integrative optical imaging. Biophys J. 65 (6), 2277-2290 (1993).
  18. Thorne, R. G., Nicholson, C. In vivo diffusion analysis with quantum dots and dextrans predicts the width of brain extracellular space. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (14), 5567-5572 (2006).
  19. Wolak, D. J., Thorne, R. G. Diffusion of macromolecules in the brain: implications for drug delivery. Mol Pharm. 10 (5), 1492-1504 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Hersenplakjeionselectieve microelektrodediffusiecurveagarosekalibratietransportgetal
Real-time iontophorese met tetramethylammonium om volume-fractie en tortuositeit van de extracellulaire ruimte van de hersenen te kwantificeren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.