Transiënte expressie en cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten in gekweekte insectencellen

Summary

Nonlytic insectencel expressiesystemen onderbenut productie, cellulair transport / lokalisatie en recombinante eiwitten functionele analyse. We beschrijven werkwijzen voor expressievectoren en transiënte daaropvolgende eiwitexpressie genereren handel verkrijgbaar Lepidoptera cellijnen. De co-localisatie van Bemisia tabaci aquaporins met fluorescente subcellulaire markereiwitten wordt gepresenteerd.

Abstract

Heteroloog eiwit expressiesystemen worden gebruikt voor de productie van recombinante eiwitten, de interpretatie van cellulaire transport / lokalisatie en het vaststellen van de biochemische functie van eiwitten op sub-organismal niveau. Hoewel baculovirus expressiesystemen in toenemende mate gebruikt voor eiwitproductie in talrijke biotechnologische, farmaceutische en industriële toepassingen, nonlytic systemen die geen virale infectie inhouden duidelijke voordelen, maar vaak vergeten en onderbenut. Hier beschrijven we een werkwijze voor het nonlytic expressievectoren en transiënte expressie van recombinant eiwit. Dit protocol maakt een efficiënte cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten en kunnen worden gebruikt om snel te onderscheiden eiwittransport in de cel. We tonen de expressie van vier recombinante eiwitten in een in de handel verkrijgbaar insectencellijn, waaronder twee aquaporine eiwitten van insecten Bemisia tabaci, enals subcellulaire markereiwitten specifiek voor het cel plasmamembraan en intracellulaire lysosomen. Alle recombinante eiwitten werden geproduceerd als chimeren met fluorescerende eiwit markers aan hun carboxyl termini, die zorgt voor de directe detectie van de recombinante eiwitten. De dubbele transfectie van cellen met plasmiden constructen voor de genen van belang en een bekende subcellulaire marker zorgt voor live-cell imaging en verbeterde validatie van cellulaire eiwitten lokalisatie.

Introduction

De productie van recombinante eiwitten met behulp van expressie in insectencellen systemen biedt tal van voordelen voor de studie van eukaryotische eiwitten. Namelijk insectencellen bezitten soortgelijke posttranslationele modificaties, verwerking en sorteermechanismen als die welke in zoogdiercellen, hetgeen voordelig is voor het produceren van correct gevouwen eiwitten ^{1, 2, 3.} Insectencel systemen ook typisch minder middelen en minder tijd en moeite voor het onderhoud dan zoogdiercellijnen ^{4, 5.} Het baculovirus ex....

Protocol

1. OE-PCR voor de bouw van expressieplasmiden

Opmerking: zie tabel 1 voor alle primers die in OE-PCR. Het gebruik van een high-fidelity DNA polymerase wordt aanbevolen voor alle amplificaties. Omdat deze enzymen vaak geen reactie 3'A, is het noodzakelijk om een ​​korte, niet-amplificeren incubatie voeren met een Taq DNA polymerase 'A-staart' van de PCR-producten voordat ze kloneren in een TA insectencel expressie vector. Dit protocol wordt een methode voor het genereren insect expressie plasmiden chimere eiwitten, waarbij de fluorescerende eiwitten gefuseerd in-frame aan de carboxylterminus van de genen van bela....

Results

OE-PCR

OE-PCR maakt de synthese van chimere DNA-producten die, wanneer in een expressievector ingebracht, maken de productie van recombinante chimere eiwitten overeenkomend naar proeven gen van belang en fluorescent merkereiwit. Figuur 1 een algemeen schema voor de bereiding van expressievectoren die pIB B. tabaci aquaporine coderende sequenties (BtDrip1 en BtDrip2_v1) in-frame met het fluorescerende pro.......

Discussion

Heterologe eiwitexpressie zijn belangrijk voor de vervaardiging van recombinante eiwitten gebruikt in talrijke afgeleide toepassingen ^4. Het kiezen van de diverse expressiesystemen beschikbaar afhankelijk van het einddoel voor het eiwit van belang. Verschillende expressie in insectencellen systemen zijn beschikbaar die flexibele alternatieven voor prokaryote en eukaryote celexpressiesystemen ^{5, 6} te bieden. Insecten systemen die baculovir.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD DNA Polymerase	EMD Millipore	71085-3	High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products
ExTaq DNA Polymerase	TaKaRa-Clontech	RR001B	DNA polymerase used for A-tailing of PCR products
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix	Lucigen	30033-1	DNA polymerase used for bacterial colony PCR
Biometra TProfessional Gradient Thermocycler	Biometra/LABRepCo	070-851
Agarose LE	Benchmark Scientific	A1705
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher	S33102
Montage DNA Gel Extraction Kit	EMD Millipore	LSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit	ThermoFisher	K89020	Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution.
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
QIAcube Robotic Workstation	Qiagen	9001292
Purifier Vertical Clean Bench	Labconco	3970401
Tni cultured insect cell Line	Allele Biotech	ABP-CEL-10005
Sf9 cultured insect cell Line	Allele Biotech	ABP-CEL-10002
Serum-Free Insect Culture Medium	Allele Biotech	ABP-MED-10002
TNM-FH Insect Culture Medium	Allele Biotech	ABP-MED-10001
IPL-41 Insect Medium	ThermoFisher	11405081
Cellfectin II Transfection Reagent	ThermoFisher	10362100
16 cm Disposable Cell Scrapers	Sarstedt	83.1832	Cell scrapers with two-position blade
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps	Life Science Products	CT-229331
Transfer Pipets	Fisher	1371120
Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes	Life Science Products	CT-229475
PipetteBoy	VWR	14222-180
5 mL Serological Pipettes	Sarstedt	86.1253.001
0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes	Fisher	14230200
Polypropylene Biohazard Autoclave Bags	Fisher	01828C
35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes	Matsunami Glass	D35-14-1.5-U	35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated
Incubator, Model 1510E	VWR	35823-961
Countess II FL Cell Counter	ThermoFisher	AMQAF1000
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent	ThermoFisher	C10228
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope	Olympus	FV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 plasmid DNA	transOMIC Technologies	TCH1303
pmCherry Vector	Clontech	632522
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	ThermoFisher	R37605