Transiënte expressie en cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten in gekweekte insectencellen

Summary

Nonlytic insectencel expressiesystemen onderbenut productie, cellulair transport / lokalisatie en recombinante eiwitten functionele analyse. We beschrijven werkwijzen voor expressievectoren en transiënte daaropvolgende eiwitexpressie genereren handel verkrijgbaar Lepidoptera cellijnen. De co-localisatie van Bemisia tabaci aquaporins met fluorescente subcellulaire markereiwitten wordt gepresenteerd.

Abstract

Heteroloog eiwit expressiesystemen worden gebruikt voor de productie van recombinante eiwitten, de interpretatie van cellulaire transport / lokalisatie en het vaststellen van de biochemische functie van eiwitten op sub-organismal niveau. Hoewel baculovirus expressiesystemen in toenemende mate gebruikt voor eiwitproductie in talrijke biotechnologische, farmaceutische en industriële toepassingen, nonlytic systemen die geen virale infectie inhouden duidelijke voordelen, maar vaak vergeten en onderbenut. Hier beschrijven we een werkwijze voor het nonlytic expressievectoren en transiënte expressie van recombinant eiwit. Dit protocol maakt een efficiënte cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten en kunnen worden gebruikt om snel te onderscheiden eiwittransport in de cel. We tonen de expressie van vier recombinante eiwitten in een in de handel verkrijgbaar insectencellijn, waaronder twee aquaporine eiwitten van insecten Bemisia tabaci, enals subcellulaire markereiwitten specifiek voor het cel plasmamembraan en intracellulaire lysosomen. Alle recombinante eiwitten werden geproduceerd als chimeren met fluorescerende eiwit markers aan hun carboxyl termini, die zorgt voor de directe detectie van de recombinante eiwitten. De dubbele transfectie van cellen met plasmiden constructen voor de genen van belang en een bekende subcellulaire marker zorgt voor live-cell imaging en verbeterde validatie van cellulaire eiwitten lokalisatie.

Introduction

De productie van recombinante eiwitten met behulp van expressie in insectencellen systemen biedt tal van voordelen voor de studie van eukaryotische eiwitten. Namelijk insectencellen bezitten soortgelijke posttranslationele modificaties, verwerking en sorteermechanismen als die welke in zoogdiercellen, hetgeen voordelig is voor het produceren van correct gevouwen eiwitten ^{1, 2, 3.} Insectencel systemen ook typisch minder middelen en minder tijd en moeite voor het onderhoud dan zoogdiercellijnen ^{4, 5.} Het baculovirus expressiesysteem is zo'n insectencellen gebaseerde systeem dat nu algemeen wordt gebruikt in vele disciplines, waaronder de productie van recombinante eiwitten voor eiwitkarakterisering en therapie, de immunogène presentatie van vreemde peptiden en virale eiwitten voor vaccinproductie, de synthese van multi -proteïne complexenDe productie van geglycosyleerde eiwitten, enz. ^{1, 2, 4, 6.} Er zijn echter situaties waarin baculovirus expressie niet van toepassing ^{3, 7,} en het gebruik van nonlytic en insecten transiënte expressiesystemen geschikter zijn. Bijzonder transiënte expressie in insectencellen biedt de mogelijkheid voor de snelle synthese van recombinant eiwit, vereist minder ontwikkeling en onderhoud, niet gepaard gaat met virale opgelegde cellysis en verschaft een middel om cellulaire transport beter bestuderen tijdens eiwitsynthese ^{7, 8, 9, 10.}

Dit protocol beschrijft de snelle vorming van expressievectoren gebruikt tweestaps overlap extension PCR (OE-PCR) ^{11 en de standaard klonering van plasmide DNA in Escherichia coli. Plasmiden worden gebruikt om dubbel transfecteren handel verkrijgbaar gekweekte insectencellen en representatieve eiwitten. Het protocol beschrijft de productie en het gebruik van twee verschillende fluorescent gelabelde subcellulaire markereiwitten en toont colocalisatie twee aquaporine eiwitten van het insect Bemisia tabaci. Het volgende protocol geeft de basismethode voor OE-PCR, insectencel onderhoud en transfectie en fluorescentiemicroscopie voor de cellulaire lokalisatie van doeleiwitten.}

Protocol

1. OE-PCR voor de bouw van expressieplasmiden

Opmerking: zie tabel 1 voor alle primers die in OE-PCR. Het gebruik van een high-fidelity DNA polymerase wordt aanbevolen voor alle amplificaties. Omdat deze enzymen vaak geen reactie 3'A, is het noodzakelijk om een ​​korte, niet-amplificeren incubatie voeren met een Taq DNA polymerase 'A-staart' van de PCR-producten voordat ze kloneren in een TA insectencel expressie vector. Dit protocol wordt een methode voor het genereren insect expressie plasmiden chimere eiwitten, waarbij de fluorescerende eiwitten gefuseerd in-frame aan de carboxylterminus van de genen van belang (in casu twee Bemisia tabaci aquaporine eiwitten) of subcellulaire markereiwitten (Fig 1).

1. Gebruik OE-PCR, die bestaat uit twee onafhankelijke rondes van amplificatie genereren: (1) die coderen voor de genen van belang (B. tabaciaquaporin 1: BtDrip1; B. tabaci aquaporin 2: BtDrip2_v1) gefuseerd in frame met een groen fluorescerend eiwit variant genaamd EGFP of (2) de subcellulaire markers (Drosophila melanogaster sex peptide receptor: DmSPR; Homo sapiens fosfolipase A2: HsPLA2) met mCherry coderende sequentie. Direct ligeren de uiteindelijke OE-PCR producten in de pIB / V5-His-TA plasmide.
   1. Voor de eerste ronde van OE-PCR (aangeduid met AD en A'-D' in figuur 1), gebruik van een gen-specifieke sense primer (vetgedrukt in Tabel 1) en een chimeer antisense primer (cursief in Tabel 1) gevonden de laatste 15 bp (zonder het stopcodon) van het gen van interesse / subcellulaire marker en 15 bp van het 5'-uiteinde van het gewenste fluorescerend eiwit (EGFP of mCherry) een productmengsel met een 3'-overhang genereren.
      Opmerking: Zie tabel 2 voor PCR omstandigheden.
   2. In een afzonderlijke buis, gebruik van een gen-specific fluorescerend eiwit antisense primer (afgebeeld met een onderstreping in tabel 1) en een chimère sense primer die 15 bp van het 3'-uiteinde van het gen van interesse / subcellulaire marker en 15 bp van het 5'-einde van de gewenste fluorescerende bevat eiwit aan een product met een 5'-overhang te genereren.
      Opmerking: zie tabel 2 voor de PCR-omstandigheden. De PCR-matrijs kan hetzij een sequentie gevalideerde PCR product of, liever, plasmide-DNA dat de gewenste sequentie. De hier beschreven onderzoek maakt gebruik sequentie gevalideerde plasmiden.
   3. Scheid de PCR producten met 1% agarose gelelektroforese (met behulp van standaard moleculair-grade agarose).
   4. Accijns en zuiveren van de producten van de verwachte afmetingen (zie tabel 2) met een commercieel beschikbare DNA gelextractiekit (zie de tabel van materialen voor de specifieke uitrusting die in dit protocol).
   5. Met de gel gezuiverde PCR-producten van stap 1.1.4 de definitieve overlap e genererenXTensie producten (aangegeven met A '- D '' in figuur 1). Met een gen sense primer voor het betreffende gen / subcellulaire marker en het overeenkomstige gen-specifieke antisense primer voor het fluorescerende eiwit aan de gewenste chimere sequentie te genereren.
      Opmerking: zie tabel 2 voor de PCR-omstandigheden. Het kan nodig zijn om de optimale hoeveelheden eerste ronde overlap verlengingsproducten empirisch vast te voegen aan het reactiemengsel om het uiteindelijke volledige lengte chimere PCR product.
   6. Scheid de tweede ronde OE-PCR producten door 1% agarose gelelektroforese. Accijns en zuiveren van de producten met behulp van een commercieel verkrijgbare DNA-gelextractiekit.
   7. Incubeer gel gezuiverde tweede ronde OE-PCR producten met 1 eenheid Taq DNA-polymerase master mix gedurende 10 minuten bij 72 ° C aan het 3'-geadenyleerde (dwz A-staart) producten nodig voor TA klonering genereren.
   8. Ligeren van de resulterende geadenyleerde productenpIB in de expressievector en het gebruik van standaard moleculaire kloneringstechnieken om chemisch competente (hitteschok) of elektrocompetente (elektroporatie) Escherichia coli cellen te transformeren. Plaat overnacht op medium dat de geschikte selectiemerker (bijvoorbeeld ampicilline of carbenicilline).
   9. Uitvoeren van kolonie-PCR ¹² met behulp van een vector-specifieke primer en een plaats-specifieke primer voor insertie-positieve kolonies die zijn getransformeerd met expressie- plasmiden die een insert in de 5'-3' oriëntatie te identificeren. Bereid 's nachts culturen van kolonies genereren van PCR-producten van de verwachte grootte.
   10. Isoleer plasmide-DNA met behulp van een commercieel verkrijgbare DNA zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant (zie Materialen voor de specifieke uitrusting die in dit protocol). Valideer de sequentie integriteit van elk inzetstuk door directe DNA-sequentiebepaling.

2. Insect Cell Culture Maintenance

Opmerking: Om steriele omstandigheden te handhaven over tot alle cellen manipulaties die de opening van de weefselkweek kolf onder een laminaire stroming kap. Schakel de laminaire stroming kap UV kiemdodende lamp tenminste 1 uur voor cel manipulaties. Draag nitril en decontamineren oppervlak van de bank, pipetten, werktuigen, buizen en kolven met 70% ethanol voor het gebruik ervan. Bekendheid met elementaire celcultuur technieken wordt aanbevolen ^13.

1. Gebruik Tni cellen (een gevestigde celcultuur die afgeleid van Trichoplusia ni ovarieel weefsel) die zijn aangepast aan serumvrij medium en onderhouden als hechtende monolaag kweek in serumvrij insect medium bij 28 ° C in T25 weefselkweekflessen.
2. Handhaven Sf9-cellen (een gevestigde celcultuur die afgeleid is van Spodoptera frugiperda ovariële weefsel) die gelijk maar met gebruik TNM-FH insect kweekmedium supplemented met 10% foetaal runderserum (FBS).
3. Zaad van de eerste kweek uit bevroren Sf9 of Tni-cellen door het verwijderen stock flesjes van -80 ° C en zodat ze ontdooien in een 37 ° C waterbad. Decontamineren flesjes met 70% ethanol na ontdooien en plaats ze op ijs.
4. Voeg 4 ml insectencel medium in nieuw T25 fles en breng 1 ml van het ontdooide insectencel suspensie. Plaats de kolf in een 28 ° C, niet-bevochtigde incubator en de cellen te laten hechten gedurende 30-45 min.
5. Vervang het enten medium met 5 ml van het geschikte medium en de flessen te brengen naar een 28 ° C niet bevochtigde incubator. Monitor cel samenvloeiing dagelijks. Passage van de cellen bij het bereiken van 90% samenvloeiing.
   Opmerking: de volledige dekking van T25 fles overeenkomt met ~ 5 x 10 ⁶ cellen.
6. Insectencel passage.
   1. Om doorgang de cellen eerst de uitgeputte medium uit de confluente kolf met cellen met een steriele 5 ml serologische pipet.Kantel de kolf zodat het medium stroomt naar een hoek, weg van de celmonolaag. Verwijder voorzichtig het medium met behulp van een pipet zonder verstoring van de cellen.
   2. Los TNI cellen door zachtjes spoelen van de T25 kolven met de confluente monolaag met 4 ml serumvrij medium insect middels nieuwe, steriele, 5 ml serologische pipet. Verplaats de pipetpunt in de kolf langzaam irrigatie cellen losjes bevestigd aan de bodem kolf te verwijderen.
      1. Controleer de adequate losmaken van cellen door alle media, het draaien van de kolf, en het waarnemen dat de bodem van de kolf helder.
   3. Voor Sf9-cellen, die strakker hechten wordt 4 ml vers TNM-FH-medium en gebruikt een cel schraper om de gehechte cellen te verwijderen. Met een 5 ml serologische pipet zachtjes mengen en verkleinen cellen klonteren.
   4. Gebruik een geautomatiseerde celteller het aantal levensvatbare insectencellen per volume medium schatten. Overdracht 0,1 ml cellen / mediummengsel met 1,5 mLmicrofugebuis. In een afzonderlijke 0,5 ml microcentrifugebuis, voeg 10 ul cellen / mediummengsel 10 pi van trypan blauw.
   5. Verwijderen celteller kamer slede uit de verpakking en voeg 10 ul van de cel / medium / trypan blue mengsel aan weerszijden van de slede tellen. Steek de schuif in de cel teller en bepaal de celdichtheid en de levensvatbaarheid.
   6. Gebruik van de celdichtheid, bereken en voeg de juiste hoeveelheid van insectencellen celmedium (maximaal 5 ml) nieuwe, steriele T25 flessen.
   7. Breng ongeveer 1-1,5 x 10 ⁶ cellen T25 flessen met vers medium; etiket van de flessen met de cellijn, datum, drager, aantal cellen toegevoegd en passage nummer _(Pn + 1 generatie, waarbij P _n is het aantal passages van de vorige generatie cellen); en plaatst de flessen in een 28 ° C incubator gedurende maximaal 72 uur.
      Opmerking: Insectencellen kunnen continu worden voortgeplant, hoewel cellen minder ontvankelijk voor transfectie en / of heteroloog kan zijneiwitexpressie na 30 passages. Behandelen weggegooid cellen / Media met 10% bleekmiddeloplossing autoclaaf en wegwerp plastic waren vóór verwijdering.

3. insectencel Transfectie

1. Zaad een T25 kolf met tot 1 x 10 ⁶ Tni of Sf9-cellen in een geschikt insectencel medium (serumvrij insect medium voor Tni en TNM-FH Sf9) en groeien tot confluentie gedurende 72 uur bij 28 ° C.
2. Verwijder de oude medium en los de cellen met 4 ml vers serumvrij insectenmedium (zie stap 2.6.2 en 2.6.3 hierboven).
3. Schat de celdichtheid met behulp van een geautomatiseerde celteller (zie stap 2.6.4, hierboven).
4. Voeg ongeveer 7 x 10 ⁵ cellen afzonderlijke 35 mm glazen bodem gerechten en de cellen te laten hechten gedurende 20-25 minuten bij 28 ° C.
5. Voor elke transfectie, voeg 2 pg plasmide DNA (hetzij een plasmide voor enkele transfecties of 2 ug van elk van de twee plasmiden voor doeuble transfecties) tot 0,1 ml serumvrij insectenmedium (zonder FBS zowel Sf9 en Tni transfecties) in een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis.
6. In een afzonderlijke buis, meng 8 pl transfectiereagens met 0,1 ml serumvrij medium insecten en breng deze oplossing aan de buis bevattende het plasmide-DNA van belang. Licht vortex en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20-30 min.
7. Verdun het plasmide-transfectie mengsel van stap 3.5 en 3.6 met 0,8 ml serumvrij medium insect, zodat het totale volume gelijk aan 1 ml.
8. Verwijder voorzichtig de media uit de glazen schalen met aangehechte cellen. Overlay de aangehechte cellen met het verdunde plasmide-transfectie medium.
9. Incubeer de cellen bij 28 ° C gedurende 5 uur.
   Opmerking: De omstandigheden voor transfectie vereist empirische optimalisatie voor maximale transfectie-efficiëntie (bijvoorbeeld overnacht transfectie plaats van 5 uur, de hoeveelheid plasmide-DNA dat de chemie van het transfectiereagensgebruikt, enz.).
10. Verwijder de transfectie medium en voorzichtig wassen van de cellen met 1 ml serumvrij medium insect, dat evenwel niet om cellen los te maken.
11. Voeg 2 ml vers insectencel medium (serumvrij insect medium voor Tni en TNM-FH Sf9) en incubeer bij 28 ° C gedurende 48-72 uur.
    Opmerking: Nogmaals, dit vereisen empirische optimalisatie voor maximale expressie van heteroloog eiwit.

4. Confocale fluorescentie microscopie

1. Op 48-72 h na transfectie was de cellen eenmaal met 1 ml IPL-41 insectenmedium en dek af met 2 ml IPL-41 voor beeldvorming.
   Opmerking: Deze wasstap vermindert de achtergrond auto-fluorescentie waargenomen met insect cel medium dat wordt gebruikt in normale cel onderhoud.
2. 4 druppels Hoechst levende cellen kleurend reagens (zie de tabel van materialen voor de specifieke nucleaire kleurstof gebruikt in dit protocol) aan het medium en incubeer bij 28 ° C gedurende 20-25 min.
   Opmerking: Extra nucLear vlekken kunnen worden gesubstitueerd, hoewel de kleurstof een fluorescentieprofiel uniek van EGFP en mCherry moeten hebben.
3. Plaats een 35 mm schaal in de in zichzelf besloten laser scanning confocale microscoop (zie de tabel van materialen voor het specifieke instrument dat in dit protocol).
4. Stel de microscoop voor Hoechst, EGFP en mCherry observatiecondities: Hoechst excitatie / emissie - 359/461 nm; EGFP excitatie / emissie - 489/510 nm; mCherry excitatie / emissie - 580/610 nm.
5. Uitvoeren van een initiële scan met een 10x objectief fluorescerende expressie te bevestigen en daarna naar aftastmodus met gebruik van een 60X fasecontrast water immersie objectief.
6. Pas het laservermogen (5-7%), detectorgevoeligheidsbereik (47-49%), scansnelheid, Z-as diepte en digitale zoomfunctie om het beeldcontrast en resolutie optimaliseren. Het imago van de cellen met 1,5x digitale zoom om een ​​totaal van 90X versterking te geven.
   Opmerking: Microscoop parameters nodig empirische aanpassing voor optimalebeeldcollectie en kunnen specifiek zijn voor het instrument in gebruik.
7. Exporteer de ruwe data zoals TIFF beeldbestanden en wijzigen (gewas en overlay) voor de figuur generatie.

Results

OE-PCR

OE-PCR maakt de synthese van chimere DNA-producten die, wanneer in een expressievector ingebracht, maken de productie van recombinante chimere eiwitten overeenkomend naar proeven gen van belang en fluorescent merkereiwit. Figuur 1 een algemeen schema voor de bereiding van expressievectoren die pIB B. tabaci aquaporine coderende sequenties (BtDrip1 en BtDrip2_v1) in-frame met het fluorescerende pro...

Discussion

Heterologe eiwitexpressie zijn belangrijk voor de vervaardiging van recombinante eiwitten gebruikt in talrijke afgeleide toepassingen ^4. Het kiezen van de diverse expressiesystemen beschikbaar afhankelijk van het einddoel voor het eiwit van belang. Verschillende expressie in insectencellen systemen zijn beschikbaar die flexibele alternatieven voor prokaryote en eukaryote celexpressiesystemen ^{5, 6} te bieden. Insecten systemen die baculovir...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD DNA Polymerase	EMD Millipore	71085-3	High-fidelity DNA polymerase gebruikt voor PCR-amplificatie van overlappende extensie PCR-producten
ExTaq DNA Polymerase	TaKaRa-Clontech	RR001B	DNA-polymerase gebruikt voor A-staarting van PCR-producten
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix	Lucigen	30033-1	DNA-polymerase gebruikt voor bacteriële kolonie PCR
Biometra TProfessional Gradient Thermocycler	Biometra/LABRepCo	070-851
Agarose LE	Benchmark Scientific	A1705
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher	S33102
Montage DNA Gel Extraction Kit	EMD Millipore	LSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit	ThermoFisher	K89020	Bevat componenten die nodig zijn om overlappende extensie PCR-producten te klonen, inclusief gelinieriseerd en door topoisomerase I geactiveerd pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemisch competente E. coli en zout oplossing.
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
QIAcube Robotic Workstation	Qiagen	9001292
Purifier Vertical Clean Bench	Labconco	3970401
Tni gekweekte insectencel lijn	Allele Biotech	ABP-CEL-10005
Sf9 gekweekte insectencel lijn	Allele Biotech	ABP-CEL-10002
Serum-vrij Insectencultuurmedium	Allele Biotech	ABP-MED-10002
TNM-FH Insectencultuurmedium	Allele Biotech	ABP-MED-10001
IPL-41 Insectenmedium	ThermoFisher	11405081
Cellfectin II Transfectie Reagens	ThermoFisher	10362100
16 cm Wegwerp Cel Schrapers	Sarstedt	83.1832	Cel schrapers met twee-positie mes
25 cm2 (T25) Weefsel Cultuur Flacons met Vent Filterdoppen	Life Science Products	CT-229331
Transfer Pipetten	Fisher	1371120
Steriele, 50 mL Bio-Reactiebuizen	Life Science Products	CT-229475
PipetteBoy	VWR	14222-180
5 mL Serologische Pipetten	Sarstedt	86.1253.001
0.5 mL Flat-Cap PCR Buizen	Fisher	14230200
Polypropyleen Biohazard Autoclaafzakken	Fisher	01828C
35 mm #1.5 Glas Bodem Schaaltjes	Matsunami Glass	D35-14-1.5-U	35 mm schotel diameter, 14 mm glas diameter, 1.5 mm glas dikte, ongecoat
Incubator, Model 1510E	VWR	35823-961
Countess II FL Cel Teller	ThermoFisher	AMQAF1000
Countess Cel Telling Kamer Slides met 0.4% Trypan Blauw Reagens	ThermoFisher	C10228
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscoop	Olympus	FV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 plasmide DNA	transOMIC Technologies	TCH1303
pmCherry Vector	Clontech	632522
NucBlue Live ReadyProbes Reagens (Hoechst 33342)	ThermoFisher	R37605