Laboratoriumtechnieken die gebruikt worden om biotypes van te houden en te onderscheiden Vibrio cholerae Klinische en milieu-isolaten

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft de juiste Vibrio cholerae onderhoudstechnieken naast een reeks biochemische analyses, collectief gebruikt voor snelle en betrouwbare differentiatie tussen klinische en milieuvriendelijke V. Cholerae biotypen in een laboratorium omgeving.

Samenvatting

De aquatische Gram-negatieve bacterie Vibrio cholerae is het etiologische middel van de infectieuze gastro-intestinale ziekte cholera. Vanwege de wereldwijde prevalentie en ernst van deze ziekte, V. Cholerae is uitgebreid bestudeerd in zowel milieu- als laboratoriuminstellingen, waarbij de juiste onderhouds- en cultuurtechnieken nodig zijn. Klassieke en El Tor zijn twee hoofdbiotypes die de V componeren. Cholerae O1 serogroep, die elk unieke genotypische en fenotypische eigenschappen tonen die betrouwbare mechanismen voor biotype karakterisering verschaffen, en vereisen duidelijke virulentie-inducerende kweekomstandigheden. Ongeacht het biotype van de causatieve stam voor een gegeven infectie of uitbraak, omvat de standaardbehandeling voor de ziekte rehydratietherapie, aangevuld met een antibiotica regime. Biotype classificatie kan echter nodig zijn voor laboratoriumstudies en kunnen bredere effecten hebben op het biomedische gebied.In het begin van 2000 werden klinische isolaten geïdentificeerd die genotypische en fenotypische eigenschappen uit zowel klassieke als El Tor-biotypes vertoonden. De nieuw geïdentificeerde hybriden, aangeduid als El Tor varianten, hebben de biotype-identificatie van klinische en milieu-isolatie complexer geworden dan eerdere traditionele identiteitsprotocollen met een enkelvoudige test. Naast het omschrijven van V. Cholerae algemene onderhouds- en cultuurtechnieken beschrijft dit manuscript een reeks genspecifieke ( ctxB en tcpA ) PCR gebaseerde genetische schermen en fenotypische analyses (polymyxine B resistentie, citraat metabolisme, proteolytische activiteit, hemolytische activiteit, motiliteit en glucose metabolisme via Voges- Proskauer assay) collectief gebruikt om te karakteriseren en / of te onderscheiden tussen klassieke en El Tor biotypes. Samen vormen deze analyses een efficiënte systematische aanpak die als alternatief kan worden gebruikt, of bovendien dure, arbeidsintensieve experimenten in de characterizaVerdeling van V. Cholerae klinische (en milieu) isolaten.

Inleiding

Cholera is een ziekte van de distale dunne darm, veroorzaakt door de consumptie van verontreinigd voedsel of water dat de aquatische Gram-negatieve bacterie Vibrio cholerae bevat . Symptomen van cholera omvatten braken en onbeheersbare waterige diarree, wat leidt tot ernstige uitdroging, die, indien niet goed behandeld, tot de dood zal leiden. V. Cholerae kan worden verdeeld in meer dan 200 serogroepen op basis van de structuur van het lipopolysaccharide O-antigen van het celoppervlak. Echter, slechts 2 serogroepen, O1 en O139, hebben epidemie of pandemische potentieel ^{1 , 2} getoond. Bovendien is serogroep O139 voornamelijk geïsoleerd voor Zuidoost-Azië ^{3 , 4} , terwijl serogroep O1 wereldwijd wordt verspreid. Bovendien kan de O1 serogroep worden verdeeld in 2 hoofdbiotypes: klassiek en El Tor. Het klassieke biotype was verantwoordelijk voor de eerste 6 cholera pandemieS tussen 1817 en 1923. De lopende zevende pandemie is een gevolg van het El Tor biotype, dat het klassieke biotype wereldwijd in de omgeving ^{5 , 6 , 7} heeft verplaatst. Recent zijn er stammen ontstaan ​​die onderscheidende kenmerken bevatten van zowel klassieke als El Tor biotypen ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17} en zijn sindsdien El Tor varianten ^{13 , 17 genoemd} . Sommige El Tor varianten hebben verhoogde virulentiecapaciteiten aangetoond met een snellere en ernstige ziekteprogressie dan eerder waargenomen, onderstrepenDe behoefte aan een meer omvattende aanpak van agentidentificatie en preventie en behandeling van ziekte ^{8 , 9 , 18} . Terwijl de identificatie van biotype de behandeling niet onmiddellijk dicteert, kunnen verdere ontwikkelingen in vaccinontwikkeling en toekomstige therapeutische middelen profiteren van biotype onderscheid.

De eerste reeks protocollen die hier worden vermeld, zullen de onderzoekers in staat stellen V te behouden. Cholerae stammen in een laboratorium omgeving. Consistentie en daaropvolgende analyse vereist voorraadbereiding en groei van isolaten, die niet biotype afhankelijk zijn. Om de virulentie-expressie optimaal te stimuleren, zijn echter onafhankelijke biotype-specifieke cultiveringsmethoden vereist. ¹⁹ . Daarnaast worden voorbereidingen voor diverse genetische en biochemische analyses beschreven in dit manuscript.

Cholera toxine (CT) en de toxine co-reGeulate pilus (TCP) zijn twee belangrijkste virulentie factoren die worden geregeld door de master regulator ToxT in beide biotypen van de V. Cholerae O1 serogroep ²⁰ . CT is een twee-deeltjes toxine samengesteld uit vijf CtxB Subeenheden die een enkele CtxA subeenheid omringen en verantwoordelijk zijn voor het snelle elektrolytverlies geassocieerd met cholera. TCP is een type IV pilus gecodeerd door de tcp operon ( tcpABQCRDSTEF ), en is betrokken bij de bevestiging en kolonisatie van de distale dunne darm. TcpA is het eerste gen van de tcp operon die codeert voor de individuele pilin subunits die essentieel zijn voor de constructie van de pilus ⁸ . De gensequentie voor ctxA is volledig geconserveerd tussen klassieke en El Tor- biotypen , terwijl ctxB en tcpA verschillen over de twee biotypes, maar worden bewaard binnen elk biotype ⁸ . CtxB is volledig bewaard tussen biotypes, behalve bij twee basisposi(115 en 203). In het El Tor biotype woont thymine bij basisposities 115 en 203, terwijl het klassieke biotype cytosine bij deze basen bevat. TcpA is volledig bewaard binnen elk biotype, maar verschilt op meerdere bases tussen biotypes. Deze genetische onderscheidingen dienen als primaire biotype identificatiemarkers, en na sequencing van het polymerase kettingreactie (PCR) amplificatieproduct omvattende deze sites kunnen isolate sequenties worden vergeleken met wildtype (WT) klassieke O395 of WT El Tor N16961 om de biotype achtergrond te bepalen Van respectievelijk CT en TCP, in een gegeven V. cholerae isolaat.

Er zijn veel protocollen ontwikkeld om de fenotypische onderscheidingen te karakteriseren tussen de klassieke en El Tor biotypes ^{21 , 22 , 23} . Polymyxine B is een peptide antibioticum dat de integriteit van het buitenste celmembraan in Gram-negatieve bac compromiseertTeria en polymyxine B resistentie kunnen worden weergegeven door middel van de polymyxine B resistentie assay ²¹ . Citraat is een primaire substraat van de Kreb-cyclus, en het vermogen om citraat te metaboliseren als enige koolstofbron kan worden bepaald met behulp van de citraatmetabolisme-analyse ²² . HapR codeert voor een globale regulator en de master quorum sensing regulator in V. cholerae, HapR, die bindt aan verschillende promotor regio's en regelt gen- en operon expressie ²⁴ . Sommige pathogene stammen van V. cholerae hebben een natuurlijk voorkomende frame-shift mutatie in het hapR gen dat heeft geleid tot deze dichtheidsafhankelijke regulering van de virulentie genuitdrukking ^{24 , 25} verloren gaan. Het meten van HapR-gereguleerde protease-activiteit met behulp van melkagaremedia laat de onderzoeker toe om te bepalen of een specifiek isolaat een functionele HapR ^{23 bevat} . DeHemolyse assay tests voor het vermogen van een stam hemolytische enzymen af ​​te scheiden die rode bloedcellen lichten; De mate van hemolyse kan worden weergegeven op bloed agarplaten ²³ . Motiliteit wordt vaak geassocieerd met virulentie in V. cholerae en kan geanalyseerd worden met behulp van motiliteitsagarplaten ²³ . De Voges-Proskauer test test voor het vermogen van glucose om glucose als een koolstofbron te fermenteren en de bijproduct acetoïne ^{21 te} produceren. Met de opkomst van El Tor varianten is het moeilijk om de resultaten van een gegeven fenotypische test te voorspellen zonder uitgebreid genotype screening en voordat de biotype achtergrond van V wordt afgetrokken. Cholerae isolaten, wordt het aanbevolen dit samenstel van analyses ²³ uit te voeren en de resultaten te vergelijken met referentiestammen zoals in Tabel 2 .

Hierin hebben we een reeks protocollen geavanceerd, die collectief gebruik maken van de aforemNtioned genotypische en fenotypische analyses voor een meer uitgebreide aanpak om V te karakteriseren. Cholerae biotypes. Verder hebben we de genotypische en fenotypische onderscheidingen van bekende V beschreven. Cholerae El Tor varianten (MQ1795 en BAA-2163), in vergelijking met veelgebruikte biotype referentiestammen (WT klassieke O395, WT El Tor C6706 en WT El Tor N16961; Tabel 1 ). De opkomst van El Tor varianten heeft uitdagingen voorgedragen aan de betrouwbaarheid van eerder gebruikte single-assay biotype karakterisering protocollen; Dit multiple assay identificatie systeem zal echter toelaten voor betrouwbare karakterisering van klinische en milieu V. Cholerae isolaten.

Protocol

Opmerking: Tijdsoverwegingen voor elke analyse moeten worden gemaakt omdat individuele mediapreparaten verschillende tijden vereisen. Bijvoorbeeld, solide agarplaatmedia mogen voldoende koelen en drogen (1-2 dagen). Extra tijdsoverwegingen ( dwz enkele kolonie en overnachtende cultuurgroei) worden onder elk protocol gespecificeerd en worden in tabel 2 gevonden.

1. Voorbereiding van media

1. 1x fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS)
   1. Weeg 4,0 g NaCl, 0,1 g KCl, 0,72 g Na ₂ HPO ₄ en 0,12 g KH ₂ PO ₄ . Combineer de bestanddelen in een 1 L Erlenmeyer-fles, doseer het volume tot 500 ml met gedeïoniseerd water, stel de pH aan op 7.2 met behulp van een pH-meter en voeg HCl druppelsgewijs toe aan de oplossing en autoklaaf of filtersteriliseer met een 0,22 μm filter. 1x PBS kan voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur worden opgeslagen.
      VOORZICHTIG: HC1 is een geconcentreerd zuur en moet volgens de behandeling worden behandeldNaar institutionele, lokale, staats- en federale regelgeving. Voor de juiste gebruiksaanwijzingen verwijzen wij u naar het veiligheidsinformatieblad dat door de fabrikant is verstrekt.
2. Luria-Bertani (LB) bouillon
   1. Weeg 5,0 g trypton, 2,5 g gist extract en 2,5 g NaCl. Combineer de bestanddelen in een 1 liter fles, doseer het volume tot 500 ml met gedeïoniseerd water, autoclaaf, en houd deze bij maximaal 6 maanden op kamertemperatuur. Voor klassieke biotype virulentie-inducerende omstandigheden, pas de pH aan op 6,5 met behulp van HCI voorafgaand aan autoclaving.
3. AKI-medium dat 0,03% (w / v) NaHC03 bevat
   1. Voor component 1 (AKI medium): weeg 7,5 g pepton, 2,0 g gist extract en 2,5 g NaCl. Combineer de bestanddelen in een 1 liter fles, stel het volume in op 450 ml met gedeïoniseerd water en autoclaaf. AKI-medium kan maximaal 6 maanden bij kamertemperatuur worden opgeslagen.
   2. Voor Component 2 (NaHCO ₃ ): weeg 1,5 g NaHCO ₃ en stel het volume aanTot 50 ml met gedeïoniseerd water in een steriele vesikel. Filter NaHCO ₃ steriliseren met een 0,22 μm filter. NaHCO ₃ moet onmiddellijk voor gebruik worden bereid.
   3. Combineer de twee componenten aseptisch en creëer een 1:10 verhouding door Component 2 te filteren in component 1 voorafgaand aan gebruik.
4. Luria-Bertani (LB) Agarplaten
   1. Weeg 5,0 g trypton, 2,5 g gist extract, 2,5 g NaCl en 7,5 g agar. Combineer de bestanddelen in een 1 L Erlenmeyer-fles, zet het volume op 500 ml met gedeïoniseerd water, autoclaaf, en berei het in standaardmaat 100 mm x 15 mm steriele Petri-afwas. Plated media kunnen voor maximaal 6 maanden in plastic verpakt worden, met deksel omhoog bij 4 ° C.
5. LB-agarplaten, aangevuld met polymyxine B
   1. Voor component 1 (LB agar): weeg 5,0 g trypton, 2,5 g gist extract, 2,5 g NaCl en 7,5 g agar. Combineer de bestanddelen in een 1 L Erlenmeyer fles, stel het volume in op 500 mL wiGedioniseerd water en autoclaaf.
   2. Voor component 2 (polymyxine B): ontleed polymyxine B in gedeïoniseerd water in een steriele 2 ml microcentrifugebuis tot een concentratie van 50.000 IE / μL en filtersteriliseer met behulp van een 0,22 μm filter.
   3. Zodra Component 1 koel is, maar nog niet gestolde, voegt 500 μL component 2 tot component 1 aseptisch een eindconcentratie van 50 IE / μL toe en meng het grondig. Bereid u voor in standaardmaat 100 mm x 15 mm steriele Petri-schotels door het mixen van gemengd agar media in de Petri-schotels. Geplateerde media kunnen gedurende maximaal 3 maanden in plastic verpakt worden, met deksel omhoog bij 4 ° C.
6. Minimale Citraat Medium Agar Platen
   1. Voor component 1 (agar met bromothymol blauw): weeg 7,5 g agar en 0,02 g bromothymol blauw. Combineer de bestanddelen in een 1 L Erlenmeyer fles, stel het volume aan 450 ml met gedeïoniseerd water en autoclaaf het mengsel.
   2. Voor Component 2 (10x VBMM): weeg 1.0 g MgSO ₄ 7H ₂ O, 10,0 g citroenzuurH ₂ O, 50,0 g anhydride K ₂ HPO ₄ en 17,5 g NaNH ₄ HPO ₄ 4H ₂ O. Combineer de bestanddelen in een 1 L Erlenmeyer-fles, stel het volume in op 500 ml Met gedeïoniseerd water en autoclaaf of filtersteriliseren met behulp van een 0,22 μm filter. 10x VBMM kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur tot 6 maanden.
   3. Voeg 50 ml Component 2 aan Component 1 toe en berei in standaardmaat 100 mm x 15 mm steriele Petri-schotels door gemengde agarmedia in de Petri-schalen te gieten. Plated media kunnen voor maximaal 6 maanden in plastic verpakt worden, met deksel omhoog bij 4 ° C.
7. Melk-agarplaten
   1. Voor component 1 (melk): weeg 8,0 g onverzadigde droge melk in een 1 L Erlenmeyer-fles, stel het volume aan op 200 ml met gedeïoniseerd water en autoclaaf.
   2. Voor Component 2 (agar met hart-hart infusie): weeg 3,68 g hart-hart infusie en 6,0 g agar. Combineer de conStituenten in een 500 ml Erlenmeyer-fles, instel volume aan 200 ml met gedeïoniseerd water en autoclaaf.
   3. Combineer de twee componenten door Component 2 in component 1 te gieten, na autoclaving en grondig te mengen. Bereid u voor in 150 mm x 15 mm steriele Petrischalen. Melkplaten kunnen voor maximaal een week worden opgeslagen in plastic, dekselzijde omlaag bij 4 ° C. Bereid in 150 mm x 15 mm steriele Petrischalen door giet gemengd agar media in de petrischalen.
8. Motiliteitsagarplaten
   1. Voor component 1 (LB agar): weeg 5,0 g trypton, 2,5 g gist extract, 2,5 g NaCl en 2,0 g agar. Combineer de bestanddelen in een 1 L Erlenmeyer-fles, stel het volume in op 500 ml met gedeïoniseerd water en autoclaaf.
   2. Voor component 2 (1% (w / v) trifenyltetrazoliumchloride; TTC): weeg 0,25 g TTC. Verstel volume tot 25 ml met gedeïoniseerd water in een steriele vesikel en filtersteriliseer met behulp van een 0,22 μm filter. Bewaar voor maximaal 6 maanden bij kamertemperatuur verpaktIn folie om de lichtblootstelling te minimaliseren.
   3. Voeg 2,5 ml 1% (w / v) steriele TTC toe aan autoclaafmedia.
   4. Giet de media zo dik mogelijk (≥50 ml / plaat) in grote 150 mm x 15 mm steriele Petri-schalen. Geplateerde media kunnen gedurende maximaal een week in plastic verpakt worden, met deksel omhoog bij 4 ° C. Bereid in 150 mm x 15 mm steriele Petrischalen door giet gemengd agar media in de petrischalen.
9. Voges-Proskauer (VP)
   1. Voor component 1 (Methyl Red-Voges-Proskauer-bouillon; MR-VP): weeg 1,7 g MR-VP-medium in een 500 ml Erlenmeyer-fles, stel het volume aan op 100 ml met gedeïoniseerd water en autoclaaf. Steriele MR-VP bouillon kan maximaal 6 maanden bij kamertemperatuur worden opgeslagen.
   2. Voor component 2 (5% (w / v) alfa (α) naftol): weeg 1,0 g a-naftol in een steriele vesikel en stel het volume aan op 20 ml met 95% ethanol. Α-naftol kan bij kamertemperatuur worden opgeslagen gedurende maximaal 1 week verpakt in folie om lichtverlies te minimaliserenComposure.
   3. Voor component 3 (40% (w / v) kaliumhydroxide; KOH): weeg 20,0 g KOH in een steriele vesikel, stel het volume in op 50 ml met steriel gedeïoniseerd water. KOH kan voor maximaal 6 maanden bij kamertemperatuur in een plastic vat worden opgeslagen.

2. Onderhoud en groei van V. Cholerae stammen

1. Voorbereiding en gebruik van bevroren voorraadculturen
   1. Pellet 1,8 ml vloeibare nachtkweek gedurende 2 minuten door centrifugeren (≥8.600 xg) in een steriele 2 ml microcentrifugebuis, verwijder supernatant en verwijder de celpellet opnieuw in 900 μL verse LB-bouillon door pipettering.
   2. Voeg 900 μL steriele 60% (v / v) glycerol aan de kweek toe en meng door vortexing.
   3. Breng het mengsel over op een steriele 2 ml cryogene buis en houd onbepaald bij -80 ° C.
   4. Om te gebruiken, verwijder een kleine hoeveelheid bevroren voorraad met een steriele inoculatielus en streep voor enkele kolonies op LB agAr borden. Onmiddellijk teruggekomen bevroren voorraad tot -80 ° C na gebruik om te voorkomen dat culturen volledig ontdooien. Incubeer de dekselzijde van de platen gedurende 12 tot 16 uur bij 37 ° C.
2. Groei van overnachtingsculturen in vloeibaar medium
   1. Streak voor enkele kolonies (volgens punt 2.1.4) van bevroren voorraad op LB agarplaten. Incubeer de dekselzijde van de platen gedurende 12 tot 16 uur bij 37 ° C.
   2. Inoculeer 4 ml vloeibare LB bouillon in een steriele 10 ml kweekbuis met een enkele kolonie door het oppervlak van de enkele kolonie aan te raken met een steriele applicatiestok en de kolonie over te brengen in de vloeibare bouillon.
   3. Incubeer met beluchting in een shaker incubator bij 225 rpm gedurende 12 tot 16 uur bij 37 ° C.
3. Groeikromme
   1. Bereid de nachtcultuur in vloeibare LB bouillon zoals eerder vermeld in protocol 2.2.
   2. Maak een 1: 100 verdunning van de nachtcultuur door 250 μl van de overnightcultuur naar 2 over te brengen5 ml verse LB bouillon in een steriele 250 ml Erlenmeyer fles.
   3. Meet de optische dichtheid van de vloeibare culturen bij 600 nm (OD ₆₀₀ ) elk uur dat begint op het moment van inenting (T ₀ ).
   4. Incubeer een 1: 100 verdunning van de nachtcultuur met beluchting in een shaker incubator bij 225 rpm gedurende maximaal 30 uur bij 37 ° C of totdat de kweek de maximale dichtheid bereikt.
   5. Graf de OD ₆₀₀ vs. Time en gebruik lineaire regressie om de geschatte verdubbelingstijd voor elke stam te bepalen.
4. El Tor Biotype Virulence Inducerende Voorwaarden
   1. Streak voor enkele kolonies van bevroren voorraad op LB agarplaten. Incubeer de deksel van de platen omlaag, gedurende 12 tot 16 uur bij 37 ° C.
   2. Inoculeer 10 ml AKI-medium dat 0,03% (w / v) NaHC03 bevat met een enkele kolonie.
   3. Incubeer cultuur zonder beluchting bij 37 ° C gedurende 3,5 uur.
   4. Verwijder 7 ml kweek en incubeer de resterende 3 ml cultuRe met beluchting in een shaker incubator bij 225 rpm gedurende nog eens 4 uur.
5. Klassieke Biotype Virulentie Inducerende Voorwaarden
   1. Streak voor enkele kolonies van bevroren voorraad op LB agarplaten. Incubeer de dekselzijde van de platen gedurende 12 tot 16 uur bij 37 ° C.
   2. Inoculeer 4 ml vloeibare LB-bouillon (pH 6,5) met een enkele kolonie.
   3. Incubeer met beluchting in een shaker incubator bij 225 rpm gedurende 12 tot 16 uur bij 30 ° C.
6. Was Cell Pellet in 1x PBS
   1. Pellet 1,8 ml nachtcultuur gedurende 2 minuten door centrifugeren (≥8 600 xg) in een steriele 2 ml microcentrifugebuis en verwijder het supernatant met behulp van een pipet. Celcellen opnieuw opschorten in 1,8 ml 1x PBS door pipettering.
   2. Herhaal de wasprocedure drie keer, gevolgd door een laatste resuspensie in 1,8 ml 1x PBS.

3. Karakterisering V. Cholerae biotypes

1. PCR- gebaseerde genetische schermen met behulp van ctxB en tcpA
   1. Ontwerp een set primers, die ongeveer 50-70 bp stroomopwaarts en stroomafwaarts van de translatoire start- en stopplaatsen van respectievelijk ctxB en tcpA ontleden.
   2. Bereid de nachtcultuur in vloeibare LB bouillon zoals eerder vermeld in protocol 2.2.
   3. Chromosomaal DNA isoleren met behulp van een in de handel verkrijgbare kit die is ontworpen voor gram-negatieve bacteriën. Gezuiverd chromosomaal DNA kan onbepaald worden opgeslagen bij -20 ° C. Chromosomale DNA-isolatie onder gebruik van commercieel verkrijgbare kits duurt ongeveer 4 uur.
   4. Gebruik een microvolume spectrofotometer om ervoor te zorgen dat het chromosomale DNA-monster van hoge kwaliteit is (A _260/280 > 1.8).
   5. Voor elk chromosomaal DNA-isolaat bereidt u de polymerase kettingreactie (s) (PCR) op ijs in een steriele 200 μL PCR-buis (en) en amplificeer gebieden van ctxB en tcpA onder gebruikmaking van standaard PCR componenten: Taq polymerase en buFfer (of equivalenten), dNTP-oplossing en forward / reverse primers. Gebruik standaard PCR parameters (~ 3 uur). Gebruik bijvoorbeeld het volgende protocol:
      1. Aanvankelijke denaturatie bij 95 ° C gedurende 120 s.
      2. Denatureren bij 95 ° C gedurende 60 s.
      3. Anneal primers bij 60 ° C gedurende 45 s.
      4. Verleng bij 90 ° C bij 72 ° C.
      5. Herhaal stappen 3.1.5.2 tot en met 3.1.5.4 voor 34 cycli.
      6. Definitieve verlenging 72 ° C voor 600 s.
      7. Oneindig vasthouden bij 4 ° C.
   6. Verf 5 μL respectievelijk PCR-product (en) met behulp van een standaard 6x DNA geladige kleurstof, en laad ongeveer 10 μl 1 kb ladder en 10 μl PCR product op een 1% agarosegel in 1x Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer.
   7. Loop gelelektroforese bij 130 V tot de kleurstof voor het einde bereikt, maar niet af, van de gel (ongeveer 90 minuten). Constante bewaking wordt aanbevolen, aangezien de spanning en de lopende tijden kunnen variëren afhankelijk van de apparatuur.
   8. Bij verificatie vanSuccesvolle PCR amplificatie met de verwachte grootte, zuiver het resterende 45 μl PCR product (en) met gebruik van een in de handel verkrijgbare DNA clean & concentrator kit.
   9. Sequentie schoongemaakt PCR product (en) met dezelfde primers gebruikt voor PCR amplificatie, en bereiden volgens lokale richtlijnen voor sequencing.
   10. Vergelijk het FASTA formaat van gensequenties van elk isolaat naar de gepubliceerde sequentie die beschikbaar is op de NCBI website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) door de volgende toetredingsnummers in het zoekvak te zoeken.
   11. CtxB : (klassiek) gebied tussen VC0395_A1059 naar VC0395_A1060 (El Tor) VC_1456
   12. TcpA : (klassiek) VC0395_A0353 (El Tor) VC_0828
2. Fenotypische analyses voor biotype classificatie via spotting
   1. Bereid de nachtcultuur in vloeibare LB bouillon zoals eerder vermeld in protocol 2.2.
   2. Was de celpelletjes (s) zoals gespecificeerd in protocol 2.6.
   3. Gebruik een pipet naarPlaats 1 μl gewassen kweek op respectievelijk medium. Voor medium selectie en incubatie specificaties, zie tabel 2.
3. Motiliteitsassay
   1. Bereid overnachtende cultuur (en) in vloeibare LB bouillon zoals eerder vermeld in protocol 2.2.
   2. Was de celpelletjes (s) zoals gespecificeerd in protocol 2.6.
   3. Inoculate motiliteitsagarplaten door inoculeren van steek in de gewassen vloeibare kweek te plaatsen en "verticaal" in de media te steken. Tussendoor elke inoculatie, steriliseer de draadstok met behulp van een Bunsen-brander, en als u de agar steekt, moet u ervoor zorgen dat de inoculerende steek niet buigt, omdat dit de resultaten kan veranderen.
   4. Incubeer de deksels van de platen gedurende 14 tot 24 uur bij 37 ° C. Na 14 uur bewaken de motiliteitsplaten nauw om de groei van culturen te voorkomen.
4. Voges-Proskauer (VP) Assay
   1. Bereid overnachtende cultuur (en) in vloeibare LB bouillon zoals eerder vermeld in protocol 2.2.
   2. Inoculeer 4Ml methyl rode Voges-Proskauer, of MR-VP bouillon, door 10 μl van voorheen bereide nachtelijke cultuur te pipetten in 4 ml MR-VP bouillon in een steriele kweekbuis en incuberen met beluchting in een shaker incubator bij 225 rpm gedurende 12 tot 16 H bij 37 ° C.
   3. Voeg 150 μl 5% (w / v) a-naftol en 50 μl 40% (w / v) KOH toe aan 1 ml alikvoten MR-VP overnight cultuur in respectievelijk steriele cultuurbuizen.
   4. Kortom draaikolk en laat gedurende 4 uur op kamertemperatuur staan ​​tot de kleurverandering zich ontwikkelt.

Resultaten

Voor goed onderhoud en gebruik van bacteriestammen, wordt het aanbevolen de verdubbelingstijd van de betrokken stam (en) te kennen. Hierin worden de wisselende groeitempo's van veelgebruikte V. Choleraestammen werden aangetoond door middel van een groeicurve en de benaderende verdubbelingstijden werden berekend aan de hand van lineaire regressie. WT El Tor N16961 en El Tor variant MQ1795 vertoonden kortere verdubbelingstijden (~ 1 uur en ~ 1 uur respectievelijk) dan WT klass...

Discussie

Van de meer dan 200 geïdentificeerde V. Cholerae serogroepen, alleen O1 en O139 hebben epidemische mogelijkheden. De O1 serogroep kan worden verdeeld in twee biotypes: klassiek en El Tor. Echter, hybride stammen, genaamd El Tor varianten ^{13 , 17} , zijn opgetreden die de El Tor biotype achtergrond bezitten en klassieke kenmerken ^{8 , 9 , 10 ,}

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 kb DNA Ladder	New England Biolabs	N3232S	https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder
60% Glycerol	Calbiochem	356352	http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352
Agar	Becto, Dickinson and Co.	214030	http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch
Agar met hersen-hartinfusie	Becto, Dickinson and Co.	237500	http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch
Agarose	Peqlab	732-2789	https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+¤tLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+
Watervrij K2HPO4	Fisher Scientific	P288-500	https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID
Blood Agar Plates	Remel	R01200	Bewaar bij 4 °C;  http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar
Boorzuur	Fisher Scientific	A73-500	https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID
Bromothymolblauw	Fisher Scientific	B388-10	https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID
Citriquezuur ·H2O	Fisher Scientific	S72836-3	https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Kit	New England Biolabs	N0446S	Bewaar bij -20 °C;  https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset
Disodium EDTA	Fisher Scientific	S311-500	https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID
DNA Clean & Concentrator™ -25 Kit	Zymo Research	D4007	http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit
GelGreen Nucleic Acid Stain	Biotium	41005	https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10,000x-in-water/
Genesys 10SUV-VIS Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-208100	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100
Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit	Qiagen	158567	https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation
HCl	Fisher Scientific	A144-212	Corrosie;  https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID
KCl	Fisher Scientific	P217-500	https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&searchTerm=P217500&searchType=RAPID
KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500	https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&searchTerm=P285500&searchType=RAPID
KOH	Fisher Scientific	P250-500	https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID
Le Loop	Decon Labs Inc.	MP190-25	http://deconlabs.com/products/leloop/
Le Stab	Decon Labs Inc.	MP186-5	http://deconlabs.com/products/lestab/
MgSO4·7H2O	Fisher Scientific	M63-500	https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHi