Een geïntegreerd systeem op afstand trigger intracellulaire signaaltransductie door Kinase Upconversion Nanoparticle-gemedieerde Photoactivation

Samenvatting

In dit protocol was gekooide proteïne kinase A (PKA), een Cellulaire signaaltransductie bioeffector, geïmmobiliseerd op een oppervlak van nanoparticle, microinjected in het cytosol en geactiveerd door de upconverted UV-licht van nabij-infrarood (NIR) bestraling, inducerende stroomafwaarts stress vezel desintegratie in het cytosol.

Samenvatting

Upconversion nanoparticle (UCNP)-gemedieerde photoactivation is een nieuwe aanpak om op afstand controle bioeffectors met veel minder fototoxiciteit en diepere weefsels penetratie. De bestaande instrumenten op de markt is echter niet gemakkelijk compatibel met upconversion toepassing. Wijzigen van de commercieel beschikbare instrument is daarom essentieel voor dit onderzoek. In deze paper illustreren we eerst de wijzigingen in een conventionele fluorimeter en fluorescentie Microscoop te laten compatibel voor foton upconversion experimenten. Vervolgens beschrijven we de synthese van een nabij-infrarood (NIR)-geactiveerd gekooide proteïne kinase A katalytische subeenheid (PKA) geïmmobiliseerd op een UCNP complex. Parameters voor microinjection en NIR photoactivation procedures worden ook gemeld. Nadat de gekooide PKA-UCNP is microinjected in REF52 fibroblast cellen, activeert de bestraling van het NIR, dat aanzienlijk superieur aan conventionele UV-bestraling is, efficiënt de PKA signaaltransductie traject in levende cellen. Bovendien bevestigen de positieve en negatieve controle experimenten dat de PKA-geïnduceerde traject leidt tot het uiteenvallen van stress vezels specifiek wordt geactiveerd door NIR bestraling. Het gebruik van gemodificeerde eiwitten UCNP biedt dus een innovatieve benadering van op afstand bedienen licht-gemoduleerd cellulaire experimenten, waarin directe blootstelling aan UV-licht vermeden worden moet.

Inleiding

Chemisch gemodificeerde eiwitten die photoactivated (bijvoorbeeld PKA gekooide eiwitten worden kunnen) zijn ontwikkeld als een opkomende veld in de chemische biologie te niet-gebeurt manipuleren intercellulaire biochemische processen^{1,2 ,3}. Met behulp van licht, zoals een stimulans uitstekende Spatio resolutie biedt bij het activeren van deze gekooide eiwitten. UV-licht kan echter leiden tot ongewenste morfologische veranderingen, apoptosis en DNA schade aan cellen^4,5. Vandaar, recente ontwikkelingen in het ontwerp van photocaging groepen richten over het inschakelen van photocleavage bij langere golflengte of twee-foton excitatie om fototoxiciteit, evenals over het verhogen van de diep-weefsel penetratie^6,7. Kooien groepen die reageren op langere golflengte waardoor ons om te kiezen van de geschikte uncaging golflengten (d.w.z., kanalen) selectief activeren bioeffectors wanneer twee of meer caging groepen zijn huidige⁷. Gezien deze handige functies, is ontwikkeling van nieuwe rood-licht photocaging groepen zeer belangrijk stroomopwaartse werk in fotochemische methodologieën voor biologische studies, variërend van het sonderen van de mechanismen van de reacties op het beheersen van cellulaire activiteiten⁸. Niettemin, een twee-foton caging groep is normaal als gevolg van de structuur van de gesmolten aromatische ring te hydrophobic, en een caging groep van zichtbaar licht is normaal organometaal, met aromatische liganden. Deze hydrofobe/aromatische eigenschap is niet geschikt als de bioeffector is een eiwit of enzym, zoals het denatureert van de site van de activering van het enzym/eiwit en verlies van functie, veroorzaakt zelfs als de vervoeging en fotolyse nog steeds op de chemische niveau^{2 werkt ,9}.

UCNPs zijn effectieve omvormers die het NIR excitatie licht omzetten in UV. Deze unieke en fascinerende eigenschap van UCNPs biedt realistische oplossingen voor de uitdagingen in verband met photoactivation en geactiveerd gecontroleerde afgifte van kleine molecules, met inbegrip van foliumzuur¹⁰, cisplatine derivaten¹¹ , DNA/siRNA¹², copolymeer blaasjes¹³en holle deeltjes¹⁴. Echter tot de beste van onze kennis, is de UCNP-bijgewoonde photoactivation van enzymen of eiwitten niet getest tot nu toe. Omdat er geen succesvolle geldt voor het gebruik van rood licht of NIR photoactive een enzym, werden we gevraagd uit te voeren van de NIR-geactiveerd activering van een eiwit/enzym constructie bestaat uit chemisch gewijzigde gekooide enzym complexen met een silica-bekleed, lanthanide-doped UCNP¹⁵. In dit onderzoek was de UCNP met een snel reagerende signaaltransductie kinase in de vorm van gekooide PKA vervoegd. PKA regelt glycogeen-synthese en cytoskeletal verordening die op externe prikkels via cyclisch adenosine fosfaat (cAMP) verordening in het cytosol^{16 reageert}. We studeerde de haalbaarheid van enzymactivering in temporele en ruimtelijke manieren in een cellulaire experiment na NIR bestraling. Dit UCNP-bijgewoonde photoactivation platform is een nieuwe methode om photoactivate een enzym met behulp van NIR en vermijdt de ongewenste signaaltransductie reactie van cellen veroorzaakt door conventionele UV-bestraling-^2,4.

Het is zeer moeilijk te translocate grote bioeffectors (bijvoorbeeld eiwitten) tussen de celmembranen controle van cellulaire activiteit. Hoewel deeltje-geïmmobiliseerd eiwit gemakkelijker translocate via endocytose in het cytosol wellicht, kan endocytose worden beschadigd of gedegradeerd via endosomal entrapment en de daaruit voortvloeiende lysosomale afbraak^2,4. Misschien zelfs als de gekooide proteïne nog steeds functioneel na membraan translocatie is, de translocated bedragen niet genoeg om het activeren van de cellulaire reactie^2,17. In schril contrast is microinjection een directe en kwantitatieve benadering leveren grote bioeffectors naar het cytoplasma van de cel. Bovendien vereist de bioeffector UCNP-geïmmobiliseerd upconverted licht te worden geactiveerd. De optische instrumenten vereist daarom verdere wijziging te meten, visualiseren, en gebruik maken van het licht upconversion. In dit werk, zal de levering van een gekooide PKA-UCNP-complex naar een cel met behulp van microinjection en de volgende essentiële spectroscopie en microscopie wijzigingen voor NIR photoactivation in detail worden beschreven.

Protocol

Opmerking: het protocol beschrijft een wijziging van de gedetailleerde instrumentatie voor upconversion-assisted photoactivation, een synthetische procedure voor het genereren van gekooide PKA-UCNP, transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) van de silica beklede UCNP en gekooide PKA-UCNP monsters, UV- en NIR fotolyse setup cel voorbereiding, microinjection van de PKA-UCNP, een photoactivation studie en de stress vezel kleuring van REF52 cellen.

1. Fluorimeter Setup voor Upconversion Spectrum meting

1. installeren van een 4 X objectief naast de houder van de meetcel van de fluorescentie-spectrometer, zodat de laser is gericht op het midden van de Cuvet.
2. Plaats een afstembare 0,5 - tot 8-W 980-nm laserdiode 90° tegen de objectief.
   Let op: De exploitant moet kennen met de veiligheid van laser en NIR laser veiligheidsbril dragen.
3. Installeren een volledige reflectie-spiegel in het lichtpad snijpunt van het objectief en de laser. Een zwart geanodiseerde metalen plaat te blokkeren van het venster van de excitatie van de spectroscopie en om de inwendige delen te beschermen plaatst.
4. Plaatst de meetcel van silica beklede UCNP oplossing (0.2 - 0.6 mg/mL) in de meetcel houder zodat een straal licht upconversion kan worden gevisualiseerd en kan worden gebruikt om de beste licht uitlijning voor spiegel installatie aanpassen.
5. De spectroscopie overschakelen naar luminescentie modus met laagste bet spanning instelling (pas aan een hogere instelling als het signaal te zwak is). Aanpassen van de spiegel tot de beste uitlijning, waar de lichtbundel is op het midden van de meetcel en de bet pikt het sterkste signaal.
6. Meet het upconversion spectrum, na aanpassing, aan de instelling van het gewenste vermogen. Gebruik een energiemeter thermische stapel om te bouwen van een ijkcurve van laser macht tegen de elektrische huidige lezing op de voeding van de laser. Constant controleren van de prestaties van de laser om ervoor te zorgen dat de prestaties de geijkte gasgroep is.

2. Microscoop Setup

Opmerking: de volgende installatie werkt voor microscopen uitgerust met een optische weglengte van tweelagige. Als de gebruiker wil installeren een excitatie lichtbron switch in de achterste poort om de NIR-laser en de HQI lamp dezelfde poort te maken, zal de collimator in de achterste poort aanzienlijk de NIR blokkeren omdat het is ontworpen om de verwarming van het monster. De gebruiker moet een moeilijke keuze maken: Houd de collimator en lijden aan zeer lage upconversion efficiëntie, of verwijderen van de collimator en offeren van de intensiteit van excitatie licht voor de epifluorescence.

Opmerking: een cutaway diagram toont de lichtpad regeling voor een gewijzigde spectrofluorometer, de microscopie voor upconversion luminescentie en NIR fotolyse modus en voor epifluorescence en UV fotolyse modus, en de experimentele opzet gebruikt voor dit experiment worden geïllustreerd in Figuur 2.

1. Equip de fluorescentie Microscoop met een lichte HQI gids, gericht op de achterkant poort.
   Opmerking: In dit bovenste laag licht pad waar er een kubus torentje, één kubus positie moet leeg te voorzien van NIR afkomstig uit de lagere laag licht pad
2. Installeren een afstembare 0,5 tot 8,0 W 980 nm laserdiode in de rechterkant haven, met de open kant-poort-collimator.
   Opmerking: Dit vergroot de laser licht plek aan circa 500 µm in diameter als een 10 X-objectief wordt gebruikt. Het verwijderen van deze collimator resulteert in een micrometer gasgroep lichte plek en NIR cel bestraling onpraktisch maakt. Deze collimator is NIR-transparante.
3. Installeer een dichroïde spiegel (850-nm korte-pass) en een excitatie-filter (950 nm long pass) in de lagere laag licht cmd.
4. Gebruiken een UCNP oplossing te visualiseren van de NIR lichte plek. Pas de positie van de laser het NIR lichtstraal in het gezichtsveld tot finish de uitlijning centreren.

3. Bereiding en karakterisatie van Caged PKA-UCNP bouwen

1. Incubate recombinante PKA (9 µM) met 0.5 mM 2-nitrobenzylbromide (NBB) in kooien buffer (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, en 10 mM MgCl ₂; pH 8,5) voor 1-2 h bij 25 ° C. Quench de overtollige NBB met 10 mM dthiothreitol (DTT) en klik vervolgens dialyze tegen 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic zuur (HEPES) buffer (10 mM, pH 7.5) te verwijderen van de overtollige reagentia en zouten.
   Opmerking: De pH van de oplossing caging is verlaagd van 8,5 tot 7.5 tijdens dialyse met HEPES pH 7.5 voor de latere immobilisatie reactie.
2. Mix de lanthanide zouten-Y(CH₃CO₂) ₃ hydraat (99,9%, 0.4527 g, 1.38 mmol), Yb (CH ₃ CO ₂) ₃ hydraat (99,9%, 0.2533 g, 0.60 mmol) en Tm (CH ₃ CO ₂) ₃ hydraat (99,9%, 0.0168 g, 0,02 mmol)-octadecene (30 mL) en oliezuur (12 mL), verwarm het mengsel tot 115 ° C gedurende 30 minuten, en ze afkoelen tot 50 ° C. Vervolgens los het reactiemengsel in een oplossing in methanol (20 mL) met 0,2 g (5.0 mmol) van NaOH pellet en 0.2964 g (8 mmol) ammonium fluoride met het ultrasoonapparaat voor 15 min. verhogen de temperatuur van de reactie tot 300 ° C om de kern van de UCNP (β-NaYF ₄ : 1,0% Tm ^{3 +} / 30% Yb ^{3 +}) nanodeeltjes.
3. Los de kern nanodeeltjes (25 mg) met CO-520 (0,5 mL) in cyclohexaan (10 mL). Ammoniak (wt 30% v/v, 0,08 mL) en tetraethylorthosilicate (TEOS, 0,04 mL) toevoegen en toepassen van constant roeren gedurende 12 uur bij kamertemperatuur te krijgen van de silica beklede β-NaYF-₄: 1.0%Tm ^{3 +} /30%Yb ^{3 +} core nanodeeltjes.
4. Broeden de PKA (6 nmol) of PKA caged (6 nmol) met UCNP (1 mg) ¹⁵ in HEPES-buffer (10 mM, pH 7.5) bij 4 ° C gedurende 3 uur te immobiliseren van de PKA van UCNP silica beklede via Elektrostatische interacties.
5. Filteren het mengsel met behulp van PVDF filter (0,45 µm), centrifuge op 17.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, en redisperse van de pellet in HEPES (50 µL, 10 mM, pH 7.5) met 0,1% eiwit stabilisator te verkrijgen van het gezuiverde PKA-UCNP complex. Centrifugeer bij 17.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en het verzamelen van het supernatans dat voor een analyse van Bradford in een tube 1.5-mL.
6. Analyseren de onbegrensde PKA in supernatant behoed stap 3.5 met een analyse van Bradford voor het rug-berekenen van het niveau van de PKA-vervanging voor de UCNP deeltjes, die normaal zijn vervanging van ~ 4.5 nmol van PKA per mg van deeltje.
   Opmerking: De analyse van Bradford onthult een sterke blauwe kleur op de pellets, waarin wordt voorgesteld een vlak en stabiel eiwitrijk immobilisatie zonder desorptie, terwijl het supernatant Fractie van gekooide PKA-UCNP oplossing toont een kleur vergelijkbaar HEPES-buffer ( Figuur 4 c-4e).

4. Karakterisering van

Opmerking: de kinase bepaling wordt gebruikt voor het kwantificeren van de specifieke activiteit van pyruvaat kinase. Kortom, resulteert de fosforylering van de peptide, die is gekoppeld aan pyruvaat kinase en lactaat dehydrogenase, in de oxidatie van NADH. Vorming van laatstgenoemde wordt gecontroleerd door het meten van de afname van de absorptie van NADH bij 340 nm.

1. Bepalen de activiteit van de PKA en PKA-UCNP in een 60 µL totaalvolume van assay mengsel met 4-morpholinepropanesulfonic zuur (MOPS, 100 mM, pH 7.5), KCl (100 mM), phosphoenolpyruvate (PEP, 1 mM), adenosine trifosfaat (ATP, 1 mM), β - Nicotinamide adenine dinucleotide, minder vorm (NADH, 0.8 mM), magnesiumchloride (MgCl ₂, 1 mM), kemptide (0,4 mM) en een pyruvaat kinase/lactaat dehydrogenase mengsel (30/40 eenheden van PK/LDH).
2. Meten de afname van de NADH extinctie na verloop van tijd na de toevoeging van PKA oplossing (2 µL) aan het mengsel assay. Berekenen van de helling van de lijn rechtstreeks aan de activiteit van de gemeten kinase.
3. Meten van de activiteit van de PKA-UCNP ¹⁵ en de algehele activiteit, die moet ook gepaard gaan met het product van de vermenigvuldiging van inheemse PKA-specifieke activiteit en het berekende bedrag oppervlak-coated PKA.

5. Fotolyse Setup

1. Measure alle macht van het licht bronnen met behulp van een thermische stapel sensor en macht dichtheden berekenen (PD = vermogen (W) / Area (cm ²)) ¹⁸ gebaseerd op de lichte plek.
2. In vitro UV fotolyse experimenten uitvoeren op een commercieel systeem met een 365 nm LED (200 mW/cm ²) ¹⁵.
3. Voor UV-photoactivation in het werkgebied van de Microscoop, verlichten de PKA-UCNP oplossing met de excitatie licht gefilterd door een commerciële kubus ¹⁵.
   Opmerking: De vermogensdichtheid is ~ 15 mW/cm ², zonder objectief gericht.
4. Voor in vitro NIR photoactivation in het werkgebied van de Microscoop, verlichten de PKA-UCNP oplossing met behulp van een 980 nm laser met aangepaste upconversion filter/spiegel instellingen geïnstalleerd op de lagere-tier licht pad, een dichroïde spiegel (850 nm korte-pass), en een excitatie-filter (950 nm long pass).
   Opmerking: De vermogensdichtheid van de uitvoer is 5 W/cm ² vóór 4 X objectief gericht. De vermogensdichtheid wordt geschat op ~ 68 W/cm ² na 4 X het objectief gericht.

6. Cel monstervoorbereiding en Microinjection van de complexen van de PKA-UCNP

1. vooraf Filtreer de monsters door een 0,45 µm filter na PKA immobilisatie (stap 3.5).
2. Incubeer de cellen in het foetale runderserum (FBS) 10% met L-15 medium gedurende de periode van microinjection voor stabiele pH-control buiten de incubator.
   Opmerking: als u wilt bevestigen dat microinjection is voltooid, mede injecteren de inheemse PKA-UCNP, gekooide PKA-UCNP of PEGylated UCNP (7,5 mg/mL) ¹⁵ met 5 (6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) (10 µM) in naar cellen.
3. Aanpassen de concentratie van de PKA-UCNP deeltjes zodanig is dat na microinjection, de cytosolische concentratie 1-3 μM PKA - een fysiologische concentratiebereik voor PKA in een cel, met de veronderstelling dat het geïnjecteerde volume 1/10 van cellulaire volume .
4. De microinjection in de cellen (stap 6.2) uitvoeren met behulp van een microinjector apparaat in combinatie met een één-assige hydraulisch micromanipulator ( Figuur 3).
5. Gebruik een digitale manometer te controleren van de druk van de microinjector in het meetbereik is (~ 50-200 hPa) en de klep van de dispenser in een aangepaste pressuring kamer te verstrekken compensatie druk voor microinjection verzegelen. Terugtrekken van de naald met behulp van een trekker.
6. Injectie druk tussen 50 en 75 hPa, met een tijd van de injectie van 200-300 ms en de druk van de compensatie bij 15 hPa om te voorkomen dat kweekmedium terugvoer in naald door capillaire werking blijven.
7. Onderzoeken van de openingen van de tip van de naalden om ervoor te zorgen dat ze een uitwendige diameter van tussen 1,3 en 1,5 µm, die kan worden bevestigd door het nemen van beelden met behulp van een objectief 40 x.
8. Wassen de cellen met 2 mL van L-15 medium met 10% FBS na de microinjection. Observeren van de cellulaire fluorescentie beeldvorming van 5 (6) - carboxytetramethyl - rhodamine (TAMRA) kunt bevestigen microinjection voltooid.

7. Photoactivation van Caged PKA-UCNP met behulp van UV- of NIR licht in levende cellen

1. voor UV photoactivation na de PKA-UCNP microinjection, groeien de REF52 cellen op een schotel van 3,5 µm, plaats ze op het podium van de Microscoop en ze bestralen met UV-licht gefilterd door de kubus voor 3 min zonder objectief gericht.
   Opmerking: REF52 cellen werden onderhouden in DMEM met 10% FBS bij 37 ° C in een 5% CO ₂ incubator en cellen waren subcultured toen de confluentie tot 90% elke 2-3 dagen bereiken.
2. Voor NIR photoactivation na PKA-UCNP microinjection, verlichten de cellen op een laser 980-nm uit lagere-tier filter/spiegel instellingen, zoals beschreven in stap 5.4.
   Opmerking: Het vermogen van de dichtheid is 5 W/cm ² vóór 10 X objectief gericht en wordt geschat op 300 W/cm ² na 10 x objectief gericht. Upconversion is een proces dat vereist een hoge foton dichtheid, vooral wanneer een grotere verschuiving van de anti-Stoke nodig is. Vandaar, gericht is nodig tijdens photoactivation.
3. Wanneer een grotere lichte plek (650 µm x 520 µm) vereist is, deze cellen met NIR gericht door een 10 x-objectief met een collimator voor 15 min. toestaan voor een donkere interval van 5 minuten na elke 5-min bestraling te vermijden verwarming bestralen.
   Opmerking: Wanneer een hoge ruimtelijke resolutie (subcellular lichte plek) vereist is, gebruik de 40 X-objectief met een gaatje in het einde van de afrit van de lichtgeleider geïnstalleerd voor het genereren van een lichte plek van subcellular-dimensie (5 µm x 4 µm). In dit geval, 1 s van bestraling is genoeg voor NIR photoactivation als gevolg van de hoge flux van fotonen.
4. Na UV- of NIR fotolyse, de cellen te herstellen in een 5% CO ₂ incubator bij 37 ° C gedurende 1 uur in volledige medium voor het genereren van cellulaire reacties toestaan. Vervolgens kunt u ze vóór verdere vlekken in 1 mL 4% paraformaldehyde-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor 20 min.
   Let op: Paraformaldehyde is zeer giftig; Vermijd contact met huid, ogen en slijmvliezen. Vermijd inademen van het poeder tijdens het meten en voorbereiding.

8. Visualisatie van Stress Fiber desintegratie veroorzaakt door NIR Photoactivation

1. na fixatie, gebruiken Alexa 594-phalloidin (5 µL van 6,6 µM stockoplossing toevoegen aan 200 µL van PBS voor kleuring; Incubeer gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur) om vlek en Visualiseer de stress vezels. Visualiseren van de beelden van Alexa 594-phalloidin (Ex 581 nm/Em 609 nm) met behulp van een filter set.
2. Incubeer de cellen gedurende 5 min. in 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) bij kamertemperatuur. Na kleuring, wassen van de monsters met PBS en fluorescerende beelden van de vezels van de stress en de kernen afzonderlijk nemen.

Resultaten

Het ontwerp van de gekooide enzym-UCNP constructie wordt geïllustreerd in Figuur 1. Het enzym PKA was eerst reageerden met 2-nitrobenzyl bromide (en) voor het genereren van een inactieve gekooide PKA, en het werd vervolgens via een elektrostatisch proces geïmmobiliseerd op het oppervlak van UCNP. UCNPs de upconverted licht uitstralen en dus photolytically het klieven van de o-nitrobenzyl groepen op Cys 199 en Cys 343, het genereren van de geactiveerde PKA. TE...

Discussie

Eerder, Hofmann en collega's vinden dat dramatische morfologische veranderingen werden waargenomen in de REF52 cellen na de microinjection van de gratis PKA-¹⁹. In een andere studie, de groep Lawrence aangetoond dat gekooide PKA geactiveerd in vivo worden kan, wat leidt tot morfologische veranderingen en het uiteenvallen van stress vezels wanneer onderworpen aan UV fotolyse²⁰. Eerder verslagen over het benutten van upconverted UV licht voor photoactivation toonde d...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagens
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma	154563
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272
MOPS	Sigma	M1254
HEPES	Sigma	H4034
Sodium chloride	Sigma	31434
Potassium chloride	Sigma	12636
Yttrium acetate hydrate	Sigma	326046	Y(C2H3CO2)3 · xH2O
Thulium(III) acetate hydrate	Alfa Aesar	14582	Tm(CH3CO2)3 · xH2O
Ytterbium(III) acetate tetrahydrate	Sigma	326011	Yb(C2H3O2)3 · 4H2O
1-Octadecene	Sigma	O806
Oleic acid	Sigma	364525
Methanol	macron	304168
Sodium hydroxide	Sigma	30620
Ammonium fluoride	J.T.Baker	69804
IGEPAL CO-520	Sigma	238643
Cyclohexane	J.T.Baker	920601
Ammonium hydroxide (28% - 30%)	J.T.Baker	972101	Ammoniak
Tetraethyl orthosilicate (TEOS)	Sigma	8658
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D0632
N-hydroxymaleimide (NHM)	Sigma	226351	PKA activiteitsremmer
Prionex eiwitstabilisatoroplossing uit varkenscollageen	Sigma	81662	Eiwitstabilisatoroplossing
2-nitrobenzyl bromide (NBB)	Sigma	107794	PKA cage-reagens
8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate natriumzout	Sigma	C3912	8-CPT-cAMP
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymen uit konijnsspier	Sigma	P0294	PK/LDH
Adenosine 5'-trifosfaat dinatrium	Sigma	A2387	ATP
β-NADH gereduceerd uit dikalium	Sigma	N4505
Phosfoenolpyruvaat	Sigma	P7127	PEP
Coomassie eiwit-assayreagens, 950 mL	Thermo Scientific	23200	Bradford-assayreagens
cAMP-afhankelijke eiwitkinase	Promega	V5161	PKA activiteitscontrole
pET15b-PKACAT plasmide	Addgene	#14921
pKaede-MC1 plasmide	CoralHue	AM-V0012
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4	Thermo Scientific	10010023
DMEM, hoge glucose, pyruvaat	Gibco	12800-017	Celcultuurmedium
Leibovitz L-15 Medium	Biological Industries	01-115-1A	Celcultuurmedium
Foetaal runderserum	Biological Industries	04-001-1A
Paraformaldehyde	ACROS	416785000
DAPI	Invitrogen	D1306	Kernkleuringskleurstof
Alexa 594-phalloidin	Invitrogen	A12381	F-actine kleuringskleurstof
5(6)-Carboxytetramethylrhodamine	Novabiochem	8.51030.9999
Pierce Coomassie (Bradford) Eiwit-assaykit	Thermo Scientific	23200
CelluSep T4 Slangen/Nominale filterbeoordeling MWCO 12.000 - 14.000 Da	Membrane Filtration Products, Inc.	1430-33	Dialysemembraan
Millex-HV Spuitfiltereenheid, 0,45 µm, PVDF, 13 mm, gamma gesteriliseerd	EMD Milipore	SLHVX13NL
Utrusting
Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS	Malvern	M104
Transmissie-elektronenmicroscoop	JEOL	JEM-1400
Fluorescentiespectrofotometer	Agilent Technologies	10075200	Cary Eclipse
UV-Vis spectrofotometer	Agilent Technologies	10068900	Cary 50
Fluorescentiemicroscoop	Olympus	IX-71
950 nm longpass-filter	Thorlabs	FEL0950
850 nm dichroische spiegel shortpass	Chroma	NC265609
RT3 kleur CCD-systeem	SPOT	RT2520
Fluorescentie-verlichting	PRIOR	Lumen 200
980 nm infrarood diodelaser	CNI	MDL-N-980-8W
UV LED-spotlichtbron	UVATA	UVATA-UPS412	Met een UPH-056-365 nm LED bij 200 mW/cm2
Thermische stapelsensor	OPHIR	12A-V1-ROHS
Picospritzer III	Parker Hannifin	052-0500-900	Intracellulaire Microinjectie Dispensing Systemen
PC-10 Naaldtrekker	Narishige	PC-10
MANOMETER Digitaal drukpeil	Lutron	PM-9100
Eén-assige oliehydraulische micromanipulator	Narishige	MMO-220A
Heraeus Fresco