Method Article

Atoomschaal structurele Studies van macromoleculaire samenstellen door Solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

DOI:

10.3791/55779

⸱

September 17th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Chemistry, Biology of Membranes, Nanoobjects, UMR5248 CNRS, Université de Bordeaux

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Structuren van supramoleculaire eiwit samenstellingen met atomaire resolutie zijn van groot belang vanwege hun cruciale rol in een verscheidenheid van biologische fenomenen. Hierin presenteren wij een protocol voor het uitvoeren van high-resolution structurele studies op onoplosbare en niet-kristallijne macromoleculaire eiwit samenstellen door magie-angle spinning solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (MAS SSNMR).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Supramoleculaire eiwit assembly's spelen een fundamentele rol in biologische processen, variërend van host-pathogen interactions, virale infectie tegen verspreiding van neurodegeneratieve aandoeningen. Deze assemblages bestaan uit meerdere eiwit subeenheden georganiseerd in een niet-covalente manier vormen grote macromoleculaire objecten die kunnen uitvoeren van een verscheidenheid van cellulaire functies of nadelige gevolgen veroorzaken. Atomaire inzicht in de mechanismen van de vergadering en de werking van deze macromoleculaire vergaderingen sinds hun inherente oplosbaarheid vaak schaars blijven en niet-kristalliniteit vaak drastisch vermindert de kwaliteit van de gegevens die zijn verkregen van de meeste technieken gebruikt in structurele biologie, zoals röntgendiffractie en oplossing nucleaire magnetische resonantie (NMR). Hier presenteren we de magie-hoek spinnen solid-state NMR spectroscopie (SSNMR) als een krachtige methode om te onderzoeken structuren van macromoleculaire samenstellingen met atomaire resolutie. SSNMR kan onthullen atomaire details op de geassembleerde complex zonder grootte en oplosbaarheid beperkingen. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft de essentiële stappen van de productie van 13C /15N isotoop-geëtiketteerden macromoleculaire eiwit assembly's voor de verwerving van standaard SSNMR spectra en hun analyse en interpretatie. Als voorbeeld laten we de pijpleiding van een structurele analyse van de SSNMR van een draadvormige proteïne-vergadering.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vooruitgang in de magie-hoek spinnen solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (SSNMR) bieden een efficiënt instrument is om de structurele karakterisering van macromoleculaire eiwit assemblages op een atomaire resolutie. Deze eiwit-assemblages zijn alomtegenwoordige systemen die spelen een essentiële rol in vele biologische processen. Hun moleculaire structuren, interacties en dynamiek zijn toegankelijk door SSNMR studies, zoals is gebleken voor virale (capsids1) en mechanismen van bacteriële infectie (secretie systemen2,3, pili4), membraan eiwit complexen5,6,7,8 en functionele amyloids 9,10,11. Dit type van moleculaire vergadering kan ook provoceren pathologieën zoals in neurodegeneratieve ziekten waar eiwitten monteren in misfolded, amyloïde Staten en leiden tot afwijkend cel gedrag of 12,13van de dood van de cel. Eiwit assemblages zijn vaak gebouwd door de symmetrische oligomerisatie van veelvouden kopieën van eiwit subeenheden in grote supramoleculaire objecten van verschillende vormen, met inbegrip van fibrillen, door samensmelting van filamenten, poriën, buizen of nanodeeltjes. De quaternaire structuur wordt gedefinieerd door zwakke interacties tussen eiwitten subeenheden te organiseren van de vergadering van de ruimtelijke en temporele en toe te staan voor de verfijnde biologische functies. Structurele onderzoeken op atomaire schaal op deze vergaderingen zijn een uitdaging voor hoge resolutie technieken sinds hun intrinsieke oplosbaarheid en heel vaak hun niet-kristalliniteit beperkt het gebruik van conventionele röntgendiffractie of oplossing NMR benaderingen. Magic-hoek spinnen (MAS) SSNMR is een opkomende techniek atomaire resolutie op onoplosbare macromoleculaire verzamelingen gegevens en haar efficiëntie te lossen 3D atomaire modellen voor een toenemend aantal complexe biomoleculaire systemen waaronder heeft bewezen bacteriële filamenten, amyloïde assemblages en virale deeltjes 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Technische vooruitgang op hoge magneetvelden, methodologische ontwikkelingen en bereiding van de monsters opgezet MAS SSNMR in een robuuste methode te onderzoeken van onoplosbare eiwitten in verschillende omgevingen, met name in hun biologisch relevante macromoleculaire in de cellulaire membranen, waardoor de techniek zeer complementair aan cryo-elektronenmicroscopie of staat gemonteerd. In veel gevallen kenmerkt een zeer hoge graad van symmetrie deze eiwit-assemblages. MAS SSNMR exploiteert deze functie, zoals alle eiwit subeenheden in een homomolecular vergadering dezelfde lokale structuur zou hebben en dus vrijwel dezelfde SSNMR handtekening, drastisch verminderen van de complexiteit van de analyse.

Een efficiënt protocol voor structurele studies van macromoleculaire eiwit samenstellen door matige MAS (< 25 kHz) SSNMR wordt gepresenteerd in deze video en kan worden onderverdeeld in verschillende stappen (Figuur 1). Zullen we laten zien van de kritische fasen van de workflow van een SSNMR structurele studie wordt geïllustreerd op een draadvormige proteïne vergadering (Zie gemarkeerd stappen in Figuur 1), met uitzondering van de subeenheid EiwitReiniging, verschillen voor elk eiwit vergadering maar van cruciaal belang voor structurele studies, en zonder in te gaan op de technische/methodologische details van SSNMR berekening van de spectroscopie en structuur voor welke gespecialiseerde tutorials zijn online beschikbaar. Terwijl dit protocol zich voornamelijk op Solid state NMR experimenten uitgevoerd onder voorwaarden van MAS richten zal, het gebruik van biologische omgevingen 23,24,25,26 uitgelijnd , 27, zoals uitgelijnde bicelles, voorzien in het onderzoek van eiwitten bevleesdheid en dynamische eiwit-eiwit interactie in membraan-achtige media zonder MAS technologie. We zullen laten zien de eiwituitdrukking en montage stappen, evenals de opname van de cruciale SSNMR spectra en hun analyse en interpretatie. Ons doel is om het inzicht verwerven in de structurele analyse pijpleiding waardoor de lezer een structurele studie van de atomaire resolutie van een macromoleculaire vergadering uitvoeren door SSNMR technieken.

Het protocol omvat 3 secties:

1. Solid state NMR monster productie

Als een voorwaarde voor een solid state NMR-analyse, de proteïne componenten macromoleculaire vergadering moet worden uitgedrukt, isotope-label, gezuiverd en gemonteerd in vitro in de native-achtige complexe toestand (voor een voorbeeld Zie Figuur 2) . Om ervoor te zorgen de hoge gevoeligheid van de NMR, is isotope verrijking in 13C en labelen van 15N vereist door het gebruik van minimale bacteriële expressie media aangevuld met 13C en 15N bronnen, zoals uniform 13 C-label glucose/glycerol en 15NH4Cl respectievelijk. In de latere fase van het protocol, selectief 13C-gelabeld monsters geproduceerd met selectief 13C-gelabeld bronnen zoals (1,3 -13C)- en (2 -13C)-glycerol (of (1 -13C)- en (2 -13C)- glucose) worden gebruikt om de analyse van de NMR. Gemengd gelabelde monster overeenkomt met een mengsel mengsel van ofwel 50% 15N- en 50% 13C-label of 50% (1,3 -13C)- en 50% (2 -13C)-glucose worden ingevoerd om te beschrijven de detectie van intermoleculaire interacties. Een hoge mate van zuiverheid van de proteïne evenals strenge voorwaarden tijdens de vergadering stap zijn belangrijke factoren om te verzekeren van een homogene structurele orde van het eindmonster.

2. preliminaire structurele karakterisering op basis van een eendimensionale (1D) Solid state NMR

We presenteren de essentiële experimenten voor een structurele analyse per SSNMR. Eendimensionale (1D) kruis-polarisatie (CP) en INEPT / RINEPT28 experimenten, ontdekt op 13C kernen worden gebruikt voor het detecteren van stijve en flexibele eiwit segmenten in de vergadering, respectievelijk, en schatting van de mate van structurele homogeniteit en lokale polymorfisme (voor een voorbeeld Zie Figuur 3).

Rong > 3. Bepaling van de structuur van de Conformationele analyse en 3D

Onderafdelingen 1 en 2 hebben betrekking op de Conformationele analyse, die is gebaseerd op de SSNMR resonantie toewijzing van alle starre residuen van de eiwit-vergadering, zoals de chemische shifts zeer gevoelige sondes voor de plaatselijke omgeving zijn en kunnen worden gebruikt voor het voorspellen van de phi/psi dihedrale hoeken en daarmee de secundaire structuur te bepalen. Figuur 4 illustreert een voorbeeld van een toewijzing van de sequentiële resonantie in de stijve kern van een eiwit vergadering. De bepaling van de 3D-structuur is gebaseerd op de verzameling van structurele gegevens zoals afstand beperkingen codering sluiten proximities (< 7-9 Å), die zowel intra- als intermoleculaire informatie bevatten. Subsecties 3 en 4 beschrijven lange-afstands verre terughoudendheid collectie en interpretatie. Lange-afstands contacten worden gedefinieerd als intramoleculaire 13C -13C proximities als gevolg van residuen ik j, met | i-j | ≥4, waardoor de tertiaire eiwit Vouw de monomere subeenheid of als intermoleculaire 13C -13C proximities definiëren, definiëren de intermoleculaire interfaces tussen eiwit subeenheden in de vergadering. Intra- en intermoleculaire interfaces worden geïllustreerd in Figuur 5. SSNMR beperkingen gedetecteerd via 13C -13C en 15N -13C schade experimenten meestal coderen voor internuclear afstanden < 1 nm. Onderafdeling 4 verklaart de detectie van intermoleculaire afstand beperkingen. In de symmetrische eiwit vergaderingen, het gebruik van homogeen gelabelde monsters (d.w.z. 100% uniform of selectief label) identificeren intermoleculaire subeenheid-subunit interacties is beperkt, als beide intra - en intersite - molecular contacten leiden tot detecteerbare signalen. De ondubbelzinnige detectie van intermoleculaire proximities wordt bereikt met behulp van gemengde gelabelde monsters, die een mengsel mengsel van twee anders gelabelde monsters, gecombineerd vóór aggregatie. Subsectie 5 introduceert kort structuur modellering.

figure-introduction-1
Figuur 1 : Workflow van een structurele studie van de atomaire resolutie van Solid state NMR. 13 C, 15N isotoop label eiwitproductie, subeenheid zuivering, de assemblage van de subeenheid, controle van vergadering formatie, SSNMR-experimenten, SSNMR experiment analyse en extractie van afstand beperkingen en modellering van de structuur worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. solid-state NMR monster productiona

  1. productie van uniform 13 C / 15 N-geëtiketteerden eiwit subeenheden plasmide-bevattende
    1. gebruik vers getransformeerd, pET24-peptide-6his BL21 E. coli (DE3) cellen, oogsten van de bereid agarplaat.
    2. Enten een 15 mL pre cultuur van voorverwarmde LB medium met één kolonie. Incubeer bij 37 ° C met 200 rpm's nachts schudden.
    3. Breng de pre cultuur in 1 L van de belangrijkste cultuur van voorverwarmde M9 medium (zie samenstelling in tabel 1), met de vereiste isotoop-geëtiketteerden koolstof en stikstof bronnen.
      Opmerking: Dit kan worden uniform 13 C-gelabeld glucose, selectief (1 - 13 C)- of (2 - 13 C)-label glucose 29 , 30 , 31 of () 1,3 - 13 C)- of (2 - 13 C)-label glycerol 32 , 33.
    4. Dit Incubeer bij 37 ° C en meet de OD 600 zodra de cultuur troebel wordt. Wanneer de OD 600 een waarde van 0,8 bereikt heeft, induceren eiwit expressie met 0,75 mM IPTG voor 4 h.
      Opmerking: De optimale inductie voorwaarden kunnen variëren van één eiwit naar de andere.
    5. De cellen te herstellen door middel van centrifugeren voor 30 min op 6000 x g- en 4 ° C.
  2. Zuivering sketch (niet afgebeeld in het protocol van de video)
    1. Lyse cellen met behulp van standaard technieken zoals ultrasoonapparaat of lysozym behandeling en zuiveren de subeenheid van de eiwitten met behulp van technieken opgericht of aangepast voor de eiwit vergadering onderzocht.
      Opmerking: Het eiwit kan worden uitgedrukt in integratie organen, Controleer voor de lokalisatie van de eiwitten door lysis van de cel en latere centrifugeren. Als het eiwit wordt gevonden in het sediment met de cel puin, het is geaccumuleerd in integratie organen.
    2. Test expressie en zuiverheid van de eiwitSteekproef bijvoorbeeld door een standaard 12-15% Tris-Tricine SDS-pagina, Zie figuur 2A. Als de zuiverheid voldoende is, het eiwit kan worden gemonteerd, anders een aanvullende zuivering stap uitvoeren.
  3. In vitro vergadering van de eiwitten door samensmelting van filamenten
    1. eiwitconcentratie in de gezuiverde oplossing te controleren. Als het eiwit absorberende residuen bevat, meten de absorptie in een UV spectrofotometer op 280 nm. De zuivere buffer invoegen de spectrofotometer als kalibratie en meet vervolgens het eiwit extinctie.
    2. Berekenen de eiwitconcentratie met behulp van de absorptiecoëfficiënt van de subeenheid van de eiwitten met de aangepaste wet van Lambert-Beer: een λ = ε λ x l x c; hier A is de optische dichtheid bij een bepaalde golflengte λ; ε is de specifieke d'absorption acoustique; l is de lengte van de optische traject cm; c is de concentratie in mol/L.
    3. Concentreren het eiwit tot een concentratie van 1 mM in een centrifugaal filter eenheid. Introduceren van het monster in de centrifugale filter eenheid en centrifugeer bij 4000 x g gedurende 30 min, meng de oplossing in de eenheid van het filter zachtjes met een pipet te vermijden van eiwit depositie op het filter. Herhaal de procedure totdat de gewenste concentratie wordt bereikt.
      Opmerking: De vergadering van de optimale concentratie hangt af van het systeem en dient te worden geoptimaliseerd (meestal tussen 0,1 - 1 mM). Als een mengsel gemengd gelabelde monster twee verschillende gelabelde eiwit partijen bereid is (b.v. (50/50) (U - 15 N)-/ (U - 13 C)-label), mengen moet plaatsvinden vóór of na de concentratie stap om ervoor te zorgen homogenisering van de gemengde oplossing.
    4. Overbrengen van het monster in een buis en het onder de agitatie voor een week bij kamertemperatuur incuberen.
    5. Meestal de polymerisatie van de subeenheden in filamenten gaat gepaard met de oplossing die steeds troebel. Check de microscopische fibril morfologie en homogeniteit bijvoorbeeld door elektronenmicroscopie (vergroting 6300 X - 45000 X), Zie figuur 2B.
    6. Centrifuge het monster gedurende 1 uur op 20000 x g- en 4 ° C. verwijderen de meerderheid van de bovendrijvende substantie, laat alleen genoeg vloeistof ter dekking van het oppervlak om te voorkomen dat het monster drogen. Controleer het supernatant voor niet-samengevoegde subeenheden op de UV spectrofotometer.
    7. Wassen de steekproef door het toevoegen van H 2 O en zorgvuldige resuspendeer de inhoud met een pipet. Doen niet vortex. Draai het monster gedurende 30 minuten bij 22000 x g- en 4 ° C. Herhaal de wassen stap 3 keer. Controleer tijdens alle stappen van het wassen als de pellet behoudt haar aspect na het centrifugeren en controleer het supernatant voor niet-samengevoegde subeenheden op de UV spectrofotometer.
    8. Toevoegen van 0,02% (m/v) natriumazide (NaN 3) om bacteriële besmetting te voorkomen en op te slaan van het monster tot meting bij 4 ° C.
  4. Solid-state NMR rotor vullen
    1. Centrifugeer tweemaal gedurende 30 min op 22000 x g en 4 ° C. verwijderen maximumbedrag van de bovendrijvende substantie; de resulterende monster samenhang hangt af van de vergadering van de eiwitten, en is meestal een gel-achtige storting.
    2. Gebruiken een capillaire Pipetteer invoegen van het monster in de rotor SSNMR.
      Opmerking: Hier, presenteren we de procedure op een 4 mm diameter rotor.
      1. Centrifuge de rotor op een tafel centrifuge om voorzichtig het monster in de rotor. Herhaal de procedure totdat de rotor is opgevuld. Houd minimaal ruimte om te sluiten van de rotor met de dop van de rotor. Als de hoeveelheid van het monster niet voldoende is, voeren een verkrijgbare invoegen te vullen van de resterende ruimte om ervoor te zorgen de monster distributie homogeniteit in de rotor.
        Opmerking: Afhankelijk op de consistentie van de geassembleerde monster, het is wellicht meer voldoende om het gebruik van een dunne spatel, met name voor de zeer dichte monsters. Rotors met een diameter van 2,5 tot 4 mm worden gebruikt bij matige MAS frequenties.
    3. Sporen van 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic zuur (DSS) toevoegen voor interne chemische shift en temperatuur kalibratie.
    4. Sluit het GLB met een sluitingsmechanisme.
    5. Kijk onder een vergrootglas als het GLB is goed geplaatst en volledig gesloten.

figure-protocol-1
Figuur 2: vertegenwoordiger resultaten voor subeenheid EiwitReiniging en vergadering. A) 15% Tris-tricine SDS-pagina van eiwit subeenheid (met inbegrip van zijn 6-tag) in verschillende stadia van zuivering. Lane 1 - eiwit molecuulgewicht marker; Lane 2 - BL21 E. coli (DE3) cellen uninduced controle; Lane 3 - BL21 E. coli (DE3) cellen geïnduceerde met 0,75 mM IPTG; Lane 4 - ontbindend opneming organen steeg 5 - supernatant breuken van cel lysate; Lane 6 - gezuiverde fractie na nikkel geïmmobiliseerd metal affiniteitchromatografie (IMAC) FPLC en ontzouten. B) negatief gekleurd eiwit fibrillen door TEM imaging. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

2. prejudiciële structurele karakterisering gebaseerd op eendimensionale (1D) Solid state NMR

  1. eerste set-up en 1 D Kruis-polarisatie (CP)
    1. Invoegen de rotor in de NMR-magneet
    2. beginnen te Draai de rotor met een frequentie van 5 kHz en wachten op een stabilisatie van ±10 Hz, dan versnellen tot 7 kHz. Tune en overeenkomen met 1 H, 13 C en 15 N kanalen. De temperatuur instellen tot 2-10 ° C (275-283 K); monster Verwarming op 7 kHz MAS is laag en kleurtemperatuur is meestal niet vereist op deze frequentie MAS.
    3. Opnemen een single-gepulseerde 1D 1 H spectrum met behulp van 16 scans.
      Opmerking: Power niveaus moeten eerder zijn geoptimaliseerd op een referentie-compound (zoals een 13 C / < sup > 15 N histidine of glycine), startende waarden te verstrekken voor het optimaliseren van de machtsniveaus in de experimenten op de doelsteekproef; deze procedure is een routine taak en daarom out voor scope in dit protocol.
    4. Houden de temperatuur tijdens alle experimenten tussen 2-10 ° C, in gehydrateerd monsters die de temperatuur wordt weerspiegeld in de relatieve verschuiving van de bulk water 1 H resonantie met betrekking tot de DSS signaal 34. Meet de temperatuur na de relatie δ (H 2 O) = 7.83-T/96,9 met een nauwkeurigheid van 1-2 ° C 35.
    5. Set up de gewenste MAS frequentie en wachten tot stabilisatie van ±10 Hz.
      Opmerking: Hier wordt aangetoond voor een frequentie van 11 kHz.
    6. Tune en wedstrijd 1 H 13 C kanalen opnieuw en aanpassen van de temperatuur met behulp van een 1 D 1 H experiment.
    7. Instellen van een 1D-1 H - 13 C CP 36.
      Opmerking: CP experimenten tonen de signalen als gevolg van residuen in een rigide bevleesdheid. Pulse kalibratie en ontkoppeling van parameters kunnen worden rechtstreeks geoptimaliseerd op monster wanneer de gevoeligheid hoog genoeg is om het waarnemen van signalen na minder dan 32 ~ scans. De eerste optimalisatie waarden zijn overgenomen van de optimalisering van de standaard op een referentie-compound. CP contacttijd en machtsniveaus worden gekozen op basis van maximale signaal intensiteit. In EiwitSteekproeven is de optimale CP contacttijd meestal tussen 200 µs en 2 ms. de ontkoppeling parameters moeten ook opnieuw worden aangepast vanaf de kalibratie op een referentie-compound.
      1. Zorgvuldig observeren de lokalisatie van de sidebands bij de bepaalde MAS frequentie spinnen.
    8. Opnemen van een 1D 13 C CP referentiespectrum die als 1 D spectrale vingerafdruk fungeert. Typische parameters zijn 128 scans, 1 ms CP contacttijd, 100 kHz ontkoppeling van sterkte, een recycle vertraging van 3 s en 25 ms overnamedatum.
    9. Kalibreren de 1 H en chemische shifts 13 C na de IUPAC-aanbevelingen 37. Bepalen van de resonantiefrequentie van het 1 H DSS signaal (chemische verschuiving van 0 ppm); 13 C chemische shifts wordt verwezen naar 1 H verschuivingen (meestal ~ 0.25144, afgeleid van de verhouding van de 13 C de 1 H resonantie frequentie 37).
    10. Proces de 1D 1 H - 13 C CP experimenteren zonder apodization functioneren (Zie figuur 3A en B voor de detectie op een homogeen welgeordende eiwit vergadering). Kies een geïsoleerde piek te schatten de linewidth in de steekproef, indicatieve van structurele orde en homogeniteit. Typische 13 C linewidths voor welgeordende biologische proteïne assemblages onder MAS op hoge magneetvelden variëren tussen 20-150 Hz (gemeten als de volle breedte op halve hoogte (FWHH)).
    11. Schatten de verhouding van de signal-to-noise (S/N) in het spectrum van CP.
      Opmerking: De S/N-verhouding hangt af van vele factoren, waaronder vooral de hoeveelheid monster in de rotor, de mate van stijfheid van de eiwitstructuur en de aanwezigheid van een enkele moleculaire bevleesdheid. Als een vuistregel, een monster moet geschikt zijn voor multidimensionale SSNMR spectroscopie als een signaal wordt waargenomen in een geoptimaliseerde 1D 1 H - 13 C CP spectrum opgenomen met 64 scans.
    12. Kunt u inzoomen op de spectrale regio van het eiwit ruggengraat carbonyl resonanties (voornamelijk) gelokaliseerd tussen 165-180 ppm. Schatten van de inhoud van de secundaire structuur in de vergadering door de positie van de eiwitten ruggengraat carbonyl resonanties met resonanties van residuen in α-Helix of β-strand conformation verschoven downfield of polja, respectievelijk (Zie figuur 3B voor een meestal α-Helix subeenheid) 38.
  2. 1 D INEPT experimenteren
    1. een 1 D 1 H - 13 C ONBEHOLPEN experiment instellen om sonde zeer mobiele delen (sub-µs) van de eiwit-vergadering.
      Opmerking: GARP ontkoppeling van een paar kHz tijdens overname 39 wordt vaak gebruikt, met het oog op korte interscan vertragingen (meestal 1 s) zonder beschadiging van de sonde.
    2. Opnemen van een ONBEHOLPEN referentiespectrum die als de vingerafdruk voor de mobiele eiwit segmenten fungeert; typische parameters zijn 128 scans en een Acquisitietijd van 25 ms.
    3. Proces de 1 H - 13 C ONBEHOLPEN experimenteren. Het bedrag en de standpunten van de signalen zijn indicatief voor de hoeveelheid mobiele residuen en de aminozuursamenstelling respectievelijk.
      Opmerking: Ook opnemen een 2D 1 H - 13 C ONBEHOLPEN experiment als signalen aanwezig in het ONBEHOLPEN spectrum van 1 D zijn (Zie Figuur 3 c voor een voorbeeld) om een meer specifiek aminozuur geïdentificeerd. In gevallen van onduidelijke toewijzing, is het raadzaam de buffer component signaal posities controleren door oplossing NMR.
    4. Gebruiken de BMRB database 40 en gepubliceerde gegevens 38 om de resonanties toewijzen aan hun overeenkomstige aminozuur in in de buurt van willekeurige spoel conformatie; het spectrum bevat alleen mobiele buffer onderdelen indien geen residuen zijn in een zeer mobiele regime.

figure-protocol-2
Figuur 3: representatieve resultaten van SSNMR spectra overname voor de montage van een goed gestructureerde eiwit. Een) 13 C-gedetecteerd FID voor een experiment 1 H - 13 C Kruis-polarisatie. B) 1 H - 13 C Kruis-polarisatie experiment. C) 1 H - 13 C ONBEHOLPEN experiment van een rigide eiwit vergadering; alleen de onderdelen van de buffer zijn zichtbaar. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

3. bepaling van de structuur van de Conformationele analyse- en 3D-

  1. sequentiële resonantie toewijzing
    1. instellen van een 2D 13 C - 13 C proton-gedreven spin diffusie (PDSD) 41 experimenteren om te detecteren intra-residu 13 C - 13 C correlaties, met inbegrip van zijketens. Overname van de waarden voor de eerste 1 H - 13 C Kruis-polarisatie stap van de 1 D-1 H - 13 C CP experiment.
      1. De mengen tijd instellen 50 ms voor uniform 13 C-gelabeld monsters en 100 ms voor selectief 13 C-gelabeld monsters. Instellen van de indirecte Acquisitietijd tussen 5-25 ms en de rechtstreekse aankoop tussen 15-25 ms afhankelijk van de intrinsieke spectrale resolutie, die kan worden geschat door de zichtbaar signaal in de lengte van de Free Induction Decay (FID) (geïllustreerd in figuur 3A).
      2. Test verschillende verwerkingsparameters om te zoeken naar optimale waarden met betrekking tot signal-to-noise en resolutie in het spectrum, meestal adequate behandeling kan worden bereikt met behulp van de functie van een qsine venster met een sinus bell verschuiving (SSB) van 2,5-4.
    2. Instellen, opnemen en proces een 2D 13 C - 13 C PDSD met een tussentijdse mengen tijd experiment te detecteren sequentiële 13 C - 13 C correlaties aansluiten meestal i - i±1, maar ook i±2 en i±3 residuen, afhankelijk van eiwit ruggengraat stijfheid en secundaire structuur elementen. Het mengen tijd moet worden ingesteld tussen de 100-200 ms voor uniform gelabelde monsters. Alle andere waarden kunnen worden overgenomen uit de korte tijd 2D 13 C - 13 C PDSD mengen.
    3. Instellen, opnemen en proces een 2D 15 N - 13 C N ik CA ik en N ik CO ik experimenteren met behulp van een CP 1 H - 15 N en een specifieke CP 15 N - 13 C-overdracht 42. de 15 N - 13 C polarisatie overdracht in een 1 D-mode rechtstreeks op het monster van belang, op basis van maximale intensiteit in de CA of carbonyl regio, respectievelijk te optimaliseren. TypiCAL waarden voor de specifieke CP contacttijd liggen tussen 2-6 ms.
    4. instellen, opnemen en proces een reeks 2D 15 N-(13 C-) 13 C voor het doel van de toewijzing experimenten.
      Opmerking: De eerste 15 N - 13 C polarisatie overdracht parameterwaarde kan over worden genomen uit de N ik CA ik / N ik CO ik experimenten. Intra-residu correlaties zijn gevestigd van N ik (CA ik) CB ik en N ik (CA ik) CO ik, met respectievelijk dromen 43 en PDSD 13 C - 13 C polarisatie transfers. Het residu (i) het residu (i-1) sequentiële connectiviteit wordt verkregen uit N ik (CO i-1) CA i-1 en N ik (CO i-1) CX i-1 experimenten, beide met behulp van een PDSD 13 C - 13 C polarisatie overdracht.
    5. Kies een NMR analyseprogramma zoals CcpNmr analyse 44 of SPARKY 45
    6. De 2D spectra geladen in de software (geïllustreerd met CcpNmr analyse) en de volgorde van de primaire eiwit worden geladen.
    7. Start met de identificatie van het aminozuur typen zichtbaar in de kort-mengen 13 C - 13 C PDSD spectrum. Verbinding maken met de koolstof-atomen van de spin-systemen te maken voor de " residu-type " specifieke toewijzing; Zie figuur 4A voor de toewijzing van een Threonine residu. Zo veel residuen identificeren als mogelijk; Dit zal afhangen van de grootte van de proteïne subeenheid, de spectrale resolutie en dispersie.
    8. Bedekken de kort-mengen met het intermediair-mengen 13 C - 13 C PDSD spectrum.
      Opmerking: De aanvullende pieken zichtbaar in de intermediate-mengen PDSD ontstaan meestal door sequentiële (residu i - residu i±1) contacten. Een voorbeeld voor een twee-residu sequentiële toewijzing wordt geïllustreerd in figuur 4B.
      1. Markeren de resonantie pieken van een rotatie-systeem en correlaties in de intermediate-mengen PDSD met resonantie frequenties van andere spin-systemen zoeken. In kleine proteïnen en peptides kunnen het mogelijk om de gehele sequentiële resonantie toewijzing op basis van 2D 13 C - 13 C PDSD experimenten.
        Opmerking: In β-onderdeel secundaire structuur motieven residu i - residu i±2 13 C - 13 C contactpersonen kunnen tonen intenser signalen dan sequentiële contacten vanwege hun nabijheid van in de ruimte; α-spiraalvormige secundaire structuur motieven residu kunnen i - residu i±3 13 C - 13 C contacten ook leiden tot intense signalen.
    9. Als intermediair-mengen PDSD experimenten op selectief 13 C-gelabeld monsters beschikbaar zijn, bedekken ze op de kort-mengen-spectrum (indien beschikbaar op het selectief 13 C-gelabeld monster) en de aanvullende toewijzen pieken, rekening houdend met de selectieve 13 C labeling patroon (1,3 - 13 C en 2 - 13 C glycerol 32 , 33 of 1 - 13 C en 2 13 C glucose 29 , 30 , 31.
      Opmerking: bijvoorbeeld, in een 2 - 13 C glycerol label monster verschillende aminozuur types worden aangeduid op het standpunt van de Cα zonder de aangrenzende koolstofatomen (Cβ en C ') aangeduid, daarom ten gunste van de Cα-Cα overdracht tussen aangrenzende residuen. In selectief gelabelde monsters, kunnen lange-afstands 13 C - 13 C correlaties opbouwen al in intermediair-mengen 13 C - 13 C PDSD experimenten. Als een piek niet kan worden verklaard door een sequentiële correlatie, zouden kunnen het voortvloeien uit een lange-afstands contactpersoon. Voor zeer homogene subeenheid structuren in de macromoleculaire vergadering besteld, wordt slechts één set resonanties zichtbaar in de spectra verwacht. Als verdubbeld (of verder vermenigvuldigd) resonanties zijn zichtbaar voor 13 C atomen of eiwit ruggengraat stukken, twee (of meer) conformaties voor de atom- of de primaire reeks rekken in de vergadering, respectievelijk bestaan.
    10. Gebruik het 2D NCA spectrum met intra-residu 15 N - 13 Cα correlaties te identificeren van de 15 N resonantie frequenties voor elk residu. Als de resolutie in de dimensie 13 C niet volstaat, gebruiken de aanvullende informatie over de resonantie van de Cβ in de 2D NCACB om te identificeren van de resonantiefrequentie van de intra-residu-15 N.
    11. Gebruiken de 2D NCACB- en NCACO spectra met intra-residu 15 N - 13 C - 13 C correlaties (i) het identificeren van de intra-residu 15 N frequentie en (ii) op te lossen van onduidelijkheden in de 13 C - 13 C PDSD met behulp van de extra 15 N-dimensie. De inversie van het signaal als gevolg van de droom-overdracht leidt tot de waarneming van typische Cα-Cβ-correlaties waarvoor het Cα signaal positieve is en de negatieve Cβ-signaal. Verder zijketen 13 C, als zichtbaar in het spectrum, zijn positieve weer.

figure-protocol-3
Figuur 4: 2-dimensionale 13 C - 13 C SSNMR PDSD experimenteert op een geordende, uniform 13 C, 15 N-geëtiketteerden eiwit assemblage. A) korte tijd PDSD mengen (50 ms mengen). B) toewijzing van de 2-residu stretch Ile32 - Thr33 met behulp van de overlay van de korte mengen tijd PDSD met een lange mengen tijd PDSD (200 ms mengen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. secundaire structuurbepaling
    1. 13 Cα gebruiken, 13 Cβ chemische verschuiving waarden voor het berekenen van de secundaire chemische verschuiving 46 ΔδCα-ΔδCβ , indicatieve van de secundaire structuur. Berekenen van 13 Cα(assigned) - 13 Cα (willekeurige spoel) en 13 Cβ(assigned) - 13 Cβ (willekeurige spoel).
      Opmerking: Chemische verschuiving waarden voor residuen in willekeurige spoel conformatie kunnen worden verkregen bij 38.
      1. Plot ΔδCα-ΔδCβ, negatieve of positieve waarden voor > 3 residuen in een rij aangeven β-strand of α-Helix conformatie respectievelijk; glycine en proline residuen kunnen laten zien van ongebruikelijke chemische verschuiving waarden, als Zij fungeren vaak als " secundaire structuur breakers ".
    2. Voorspellen de eiwit dihedrale hoeken van de toegewezen chemische shifts via TALOS + 47 , 48 of PREDITOR 49 , 50. De voorspelde Phi/Psi dihedrale hoeken weerspiegelen de secundaire structuur van het eiwit subunit en worden gebruikt als structurele beperkingen gedurende het gehele proces modellering.
  2. Collectie van structurele beperkingen
    1. Set up en een 2D 13 C - 13 C PDSD experiment met een lang mengen tijd om op te sporen van lange-afstands 13 C - 13 C correlaties opnemen. Typische mengen keer bereik van 400 ms 1 s. gebruik selectief 13 C-gelabeld monsters, zoals het spin-verdunning sterk verbetert de overdracht van de polarisatie tussen de koolstofatomen verre.
    2. De lange-mengen 2D 13 C - overlay 13 C PDSD opgenomen op selectief gelabelde monster op het intermediair-mengen 13 C - 13 C PDSD, indien mogelijk vastgelegd op hetzelfde selectief gelabelde monster. Aanvullende pieken voortvloeien uit correlaties tussen meer verre 13 C-atomen. Tijdens de resonantie toewijzing, rekening houden met de selectieve labelschema.
    3. Zorgvuldig beoordelen de resolutie van het spectrum te definiëren een tolerantie toewijzingsvenster, d.w.z. afhankelijk van de spectrale resolutie resonanties in een bepaald bereik ppm die dit aan het signaal bijdragen kan. De standaarddeviatie van de precisie van de toewijzing wordt automatisch berekend in NMR toewijzing programma's zoals CcpNmr analyse of SPARKY.
    4. Als een signaal kan worden verklaard door een sequentiële (residu i - residu i±1) of een contactpersoon medium-range 13 C - 13 C (residu i - residu ik ± 2, 3 of 4), handhaven van deze toewijzing sinds indirecte polarisatie overdracht kan verklaren de zelfs indien de afstand van 13 C - 13 C boven het verwachte zichtbaar contact bereik correlatie.
    5. Classificeren de toewijzingen voor lange-afstands 13 C - 13 C contacts in frequentie ondubbelzinnig en dubbelzinnige signalen. In het geval van frequentie ondubbelzinnige toewijzingen, slechts één resonantie toewijzing is mogelijk met betrekking tot de tolerantie toewijzingsvenster.
      Opmerking: Dubbelzinnig toewijzingen bevatten alle mogelijke resonantie toewijzingen binnen de tolerantie-venster. De dubbelzinnigheden kunnen worden opgeheven gelijktijdig bij de berekening van de structuur door de iteratieve rondes van doorverwijspagina gebaseerd op voorlopige structuren berekend aan de hand van alleen de duidelijke beperkingen, zoals uitgevoerd in computationele routines zoals ARIA 51 of UNIO 52. Bovendien, Landeninformatie uit verschillende biofysische bronnen (bijvoorbeeld gemuteerd of subeenheid structuur door oplossing NMR of röntgendiffractie, massa-per-length metingen, cryo-EM kaart afgevlakt) kan ook worden gebruikt om het niveau van dubbelzinnigheid, voor Zie voorbeelden 1 , 3 , 53, , 54 , 55 , 56 , 57 , 58.
  3. detectie van intermoleculaire afstand beperkingen in een symmetrische eiwit vergadering
    1. een 2D 15 N - 13 C pijn-CP 59 experiment instellen op een gemengd (50/50) U - 15 N - / U - 13 C-gelabeld monster. Signalen gedetecteerd op de pijn-CP-spectrum moeten voortvloeien uit tussen moleculaire 15 N - 13 C proximities. De eerder toegewezen resonanties gebruiken voor het uitvoeren van de toewijzing van de intermoleculaire contactpersonen.
    2. Instellen van een 2D 13 C - 13 C PDSD met een tijd lang mengen (> 600 ms) op een (50/50) gemengd (1,3 - 13 C)-/ (2 - 13 C)-glycerol of (1 - 13 C)-/ (2 - 13 C)-glucose monster.
      Opmerking: Signalen gedetecteerd in deze 13 C - 13 C spectrum voortvloeien uit intra moleculaire en inter moleculaire 13 C - 13 C proximities. Nochtans, laat de hoge complementariteit van de beide labeling regelingen bepaalde resonantie paren ontstaan ondubbelzinnig uit tussen moleculaire contacten, bijvoorbeeld een Serine CA in de (2 - 13 C)-glucose label subeenheden die correleren een CB Serine in het (1 - 13 C)-glucose label subeenheden.
      1. Overlay het spectrum van het gemengd monster tot de 2D 13 C - 13 C spectra opgenomen op homogeen label monsters ((1,3-13C) - en (2 - 13 C)-glycerol of (1 - 13 C)- en (2 - 13 C)-glucose Label monsters). Extra signalen in het spectrum opgenomen op de gemengd monster moeten voortvloeien uit tussen moleculaire interacties.
  4. Structuur modellering van SSNMR gegevens
    1. bereiden de SSNMR terughoudendheid lijsten die nodig zijn voor de berekening van de structuur: (1) eiwit volgorde; (2) intra-moleculaire ondubbelzinnig afstand beperkingen; (3) intra-moleculaire dubbelzinnig afstand beperkingen; (4) TALOS gebaseerde dihedrale hoek beperkingen; (5) Inter moleculaire ondubbelzinnig afstand beperkingen; (6) tussen moleculaire dubbelzinnig afstand beperkingen; (7) aanvullende gegevens uit andere biofysische technieken (bijvoorbeeld massa-per-length, symmetrie parameters).
    2. Diverse reviews geven inzicht in de structuur modellen op basis van SSNMR gegevens en in combinatie met aanvullende structurele gegevens 14 , 60, , 15 , 19 , 61 , 62 opmerking dat de dubbelzinnige afstand beperkingen kunnen worden disambiguated tijdens de berekening van de structuur met betrekking tot de inleiding structurele modellen op basis van duidelijke afstand beperkingen. Om de juistheid van de structuur, zorgvuldig observeren als de structuur naar een enkele vouw convergeert.

figure-protocol-4
Figuur 5 : Intra - en intermoleculaire contacten in symmetrische eiwit assemblages. Schematische weergave van intra - vs. intermoleculaire 13 C - 13 C lange-afstands contactpersonen in een spiraalvormige macromoleculaire vergadering. De subeenheden worden gekleurd in wit en rood om te illustreren de gemengde labeling van de subeenheden; dat wil zeggen vóór de vergadering een 1:1-mengsel van twee verschillende labeling regelingen werd uitgevoerd (bijvoorbeeld 1 - 13 C glucose en 1 - 13 C glucose). A) intramoleculaire 13 C - 13 C contacten op het gebied van luchtverontreiniging over lange afstand (blauwe onderbroken pijl); B) intermoleculaire 13 C - 13 C contacten op het gebied van luchtverontreiniging over lange afstand (rood onderbroken pijlen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De doorsnee werkstroom voor SSNMR omvat verschillende stappen aangegeven in Figuur 1. Meestal zijn de subeenheden eiwit geproduceerd door in vitro heterologe expressie in E. coli, gezuiverd en geassembleerd onder schudden, maar soms ook in statische toestand. Meningsuiting en zuivering van de eiwit-subeenheid worden gevolgd door SDS gel chromatografie (figuur 2A). De vorming van macromoleculaire assembly's kan vervolgens worden bevestigd door middel van elektronenmicroscopie (EM) analyse (Zie figuur 2B voor een voorbeeld van een draadvormige vergadering).

Na invoering van de vergadering van de eiwitten in de rotor van de SSNMR, de rotor de spectrometer wordt ingevoegd en de frequentie van de MAS en temperatuur worden geregeld de spectra worden geregistreerd. Eerste inzichten kunnen worden verkregen door 1D SSNMR technieken. Figuur 3 toont een typische SSNMR FID aangetroffen op het 13C-kanaal op een structureel homogene eiwitSteekproef, een 1H -13C CP spectrum, onthullen de13C resonanties aanwezig in de stijve kern van de subeenheid van de eiwitten in de vergadering, en een 2D 1H -13C ONBEHOLPEN spectrum, vertegenwoordigen de mobiele residuen. Voor atomaire inzichten in de harde kern van de verzamelingsstructuur moeten multidimensionale SSNMR experimenten worden opgenomen op uniform en selectief label monsters om eerst de SSNMR resonanties toewijzen en vervolgens het detecteren van lange-afstands proximities (zie figuur 4 ).

Alle spectra worden verwerkt en geanalyseerd met voldoende software voor het toewijzen van de SSNMR resonanties en uitpakken van de intra- en intermoleculaire afstand beperkingen (Figuur 5). De SSNMR afstand beperkingen dienen hetzij alleen of in combinatie met gegevens van complementaire technieken, die kunnen worden geïntegreerd in het programma van de modellering.

Figuur 6 illustreert voor representatieve atomaire structuren van macromoleculaire assembly's opgelost door SSNMR technieken verschillende filamenteuze assemblages van bacteriële aanhangsels en amyloïde fibrillen.

figure-results-1
Figuur 6:filamenteuze macromoleculaire structuur bepaald door een solid-state NMR-aanpak: bacteriële filamenten en amyloïde eiwitten fibrillen. A) Type 1 pilus van uropathogenic E. coli, VOB code 2N7H 4; B) ASC gloeidraad, VOB code 2N1F 63; C) Type III secretie systeem naalden, VOB codes 2MME, 2LPZ en 2MEX 2,3,64; D) Amyloid-bèta AB42 fibrillen, VOB code 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,66,,67 en Osaka mutant VOB code 2MVX 57, Iowa mutant VOB code 2MPZ 58; E) Alpha-synuclein fibrillen, VOB code 2N0A 68; F) HET-s prion domein, VOB code 2RNM, 2KJ3 69,70. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Solid state NMR (SSNMR) is een methode van keuze voor het karakteriseren van macromoleculaire eiwit assemblages op atomaire niveau. Een van de centrale kwesties in SSNMR gebaseerde structuurbepaling is de spectrale kwaliteit van de onderzochte systeem, waarmee het tot de oprichting van 3D-structurele modellen van verschillende precisie, meestal variërend van lage-resolutie modellen (met de secundaire structuur van de elementen en weinig 3D informatie) aan pseudo-atomaire 3D structuren. De kwantiteit en kwaliteit van structurele gegevens uit multi-dimensionale SSNMR experimenten is de sleutel tot het berekenen van een hoge resolutie NMR-structuur van de vergadering.

Het beschreven protocol is gebaseerd op de detectie van 13C -13C en 15N -13C structurele beperkingen die de opname van verschillende spectra van 2D (en soms 3D) met hoge signaal-ruis. Bij matige MAS frequenties (< 25 kHz), het monster rotoren met maten van 3.2-4 mm doorsnede waardoor eiwitten hoeveelheden tot ~ 50 mg, afhankelijk van de hydratatie van de steekproef is binnengebracht. De hoeveelheid monster binnen de rotor is recht evenredig met de signal-to-noise verhouding in SSNMR spectra, een beslissende factor voor de detectie van lange-afstands afstand beperkingen en hun ondubbelzinnige toewijzing.

De spectrale resolutie is een cruciale parameter tijdens de opeenvolgende resonantie-toewijzing en de beperkingen-collectie. Voor het verkrijgen van optimale resultaten, moeten de steekproef voorbereiding parameters worden geoptimaliseerd, met name in de zuivering van de subeenheid en de voorwaarden van de vergadering (pH, buffer, schudden, temperatuur, enz.). Voor de optimalisatie van de steekproef, het verdient om labelloze monsters voor verschillende afzonderlijke voorwaarden die vergadering heeft waargenomen, te bereiden en het opnemen van een 1D 1H -13C CP spectrum (beschreven in stap 2.1) op elke voorbereide monster. De spectra dienen te vergelijken spectrale resolutie en spreiding tussen de verschillende preparaten, gebaseerd op de optimale omstandigheden kunnen u vaststellen.

De kwaliteit van de gegevens van de SSNMR hangt sterk af van de keuze van de NMR overname parameters, met name voor de polarisatie overdracht stappen. Het gebruik van hoge magnetische Veldsterkten (frequentie ≥600 MHz 1H) is essentieel voor de hoge gevoeligheid en spectrale resolutie, vereist wanneer geconfronteerd met complexe doelen zoals macromoleculaire eiwit assemblages.

Een beperkende factor in veel gevallen is de beschikbaarheid van de spectrometer. Daarom een verstandige keuze van de monsters worden voorbereid moet voorafgaan aan de spectrometer-sessie. In ieder geval, een uniform 13C, 15N-geëtiketteerden monster is een voorwaarde voor het uitvoeren van de sequentiële en intra residuele resonantie-toewijzing. Zie71voor eiwitten toegewezen door Solid state NMR technieken. Structuurbepaling van macromoleculaire assemblages op gematigde MAS frequenties vereist selectief 13C-gelabeld monsters; voor de detectie van lange-afstands 13C -13C en 13C -15N monsters op basis van 1,3 contacten -13C- en 2 -13C-gylcerol en/of 1 -13C- en 2 -13C-glucose labeling zijn gebruikte, zoals hierboven beschreven. De keuze tussen de twee stelsels van labeling is gebaseerd op de spectrale signal-to-noise verhouding en resolutie. Om deze te onderscheiden van intra- en intermoleculaire lange-afstands contacten, is gemengd met het label en het verdunde monsters efficiënt gebleken.

Kortom, de kritische stappen voor een atomaire SSNMR structurele studie zijn: (i) de voorbereiding van de subeenheden en de noodzaak van de vergadering moet worden geoptimaliseerd voor uitstekende monster kwantiteit en kwaliteit, (ii) spectrometer veldparameters sterkte en overname moeten worden gekozen zorgvuldig; (iii) selectieve labeling strategieën zijn nodig voor de bepaling van een 3D-structuur en het bedrag van de vereiste gegevens is afhankelijk van de kwaliteit van de gegevens en de beschikbaarheid van aanvullende gegevens.

Ondanks de toepasbaarheid op een breed scala van supramoleculaire systemen, variërend van membraaneiwitten op homomultimeric nano-objecten, wordt de SSNMR vaak beperkt door de behoefte aan mg-hoeveelheden ionenpaar gelabelde materiaal. De recente technologische ontwikkelingen in ultra-snelle MAS (≥100 kHz) SSNMR de laan op 1H-gedetecteerd NMR openstellen, en duw de limiet van minimal steekproef hoeveelheid tot en met sub-mg 72,73,74. Voor gedetailleerde structurele studies zijn 13C-gelabeld monsters echter onmisbaar, die de toepassing van SSNMR aan monsters geassembleerd in vitro of systemen uitgedrukt in organismen die op een minimale voedingsbodem waar beperkt overleven in cel SSNMR is een opkomende methode (Zie voor de beoordelingen 75,76,77,78).

Een belangrijke factor in SSNMR aanvraag tot het verkrijgen van hoge resolutie 3D structuren is de spectrale resolutie: intrinsieke conformationele heterogeniteit in een vergadering spectrale resolutie en spectra analyse kunt beperken. Labelen van residu-specifieke 13C kan in sommige gevallen een alternatief bieden specifieke afstand om informatie te verkrijgen over strategische residuen met het oog op de structurele modellen (voor een recente voorbeelden Zie 79,80).

SSNMR voor 3D structuurbepaling vereist nog steeds de collectie van verschillende datasets met vaak lange gegevens collectie keer op geavanceerde instrumenten, afhankelijk van de benadering en het systeem enkele dagen tot weken op een 600-1000 MHz (1H/bClk frequentie) spectrometer. Daarom kunnen de toegang tot de spectrometer tijd een beperkende factor in een diepgaande studie van de SSNMR.

In het geval van homomultimeric eiwit assemblages, leidt tot SSNMR gegevens van voldoende kwaliteit om te identificeren van een groot aantal structurele beperkingen zoals in 3,57,64,,70, SSNMR geeft nog steeds geen toegang tot de microscopische afmetingen. Daarom, in een DOVO SSNMR structuurbepaling van een vergadering van de homomultimeric, EM of massa-per-(MPL) lengtegegevens ideaal aanvullen SSNMR gegevens afleiden van de symmetrie-parameters. SSNMR gegevens alleen bieden de atomaire intra- en intermoleculaire interfaces

SSNMR is uiterst complementair met structurele technieken zoals EM of MPL metingen, maar de gegevens kan ook perfect gecombineerd worden met atomaire structuren die zijn verkregen door middel van röntgendiffractie of oplossing NMR op gemuteerde of afgekapte subeenheden. Een toenemend aantal studies kan worden gevonden in de literatuur waar de combinatie van de verschillende structurele gegevens is toegestaan voor de bepaling van de atomaire 3D-modellen van macromoleculaire assemblages (Zie Figuur 6 voor representatieve voorbeelden).

Op het gebied van Structural Biology, SSNMR komt te voorschijn als veelbelovende techniek om te studerenonoplosbare en niet-kristallijne assemblages op het atomaire niveau, dat wil zeggen met structurele gegevens op de atoomschaal. In dit opzicht is SSNMR de hanger oplossing NMR en röntgendiffractie voor moleculaire assembly's, met inbegrip van membraaneiwitten in hun inheemse milieu en eiwit assemblages zoals virale enveloppen, bacteriële filamenten of amyloids, evenals RNA en RNA-eiwitcomplexen (zie bijvoorbeeld81). De uiterst veelzijdige toepassingen in vitro en in de cellulaire context, zoals het bijhouden van secundaire, tertiaire en quaternaire structurele wijzigingen, interactie oppervlakken te identificeren met partner moleculen op de atoomschaal (bijvoorbeeld 82) en moleculaire dynamica van de toewijzing in het kader van de geassembleerde complexen, aangeven welke belangrijke mogelijkheden SSNMR in toekomstige structurele studies over complexe biomoleculaire assemblages.

ComponentM9 medium
NaCl0,5 g/L
KH2PO43 g/L
NB2HPO46,7 g/L
MgSO41 mM
ZnCl210 ΜM
FeCl31 ΜM
CaCl2100 ΜM
MEM vitamine mix 100 X10 mL/L
13 C-glucose2 g/L
15 NH4Cl1 g/L

Tabel 1: Samenstelling van minimale expressie medium voor recombinante eiwitten productie in E. coli BL21 cellen.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk wordt gefinancierd door de ANR (13-PDOC-0017-01 B.H. te ANR-14-CE09-0020-01 tot A.L.), "Investeringen voor de toekomst" programma IdEx Bordeaux/CNRS (PEPS 2016 naar B.H.) verwijst naar ANR-10-IDEX-03-02 tot B.H., de Fondation pour la Recherche Médicale) FRM-AJE20140630090 naar A.L.), het KP7-programma (KP7-mensen-2013-CIG aan A.L.) en de European Research Council (ERC) onder de Europese Unie Horizon 2020 onderzoek en innovatie programma (ERC Starting Grant aan A.L., overeenkomst No 639020) en project " WEAKINTERACT."

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Instruments
NMR Spectrometer (> 11.7 Tesla)Bruker-
triple resonance MAS SSNMR probehead Bruker-
SSNMR rotors 4mmBrukerK1910
Centrifuge 5804 R Eppendorf5805000629
GeneQuant 1300 spectrometerDutscher28-9182-13
IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 LDutscher228001
MaxQ 4450 bench top orbital shakerDutscher78376
Tube Revolver AgitatorDutscher79547
sonopuls HD 3100Bandelin3680
MicroPulser electroporatorBiorad165-2100 
mini-PROTEAN tetra cell systemBiorad165-8000
AKTA pure systemGE Healthcare29-0182-24
capillary microman M25 pipetGilson F148502
NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
amiconR ultra-15sigmaZ740199-8EA
capillaries and pistonsGilson F148112
spatulaFisher13263799
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
D-glucose 13C6Sigma389374
Ammonium-15N-chlorideSigma299251
1,3 13C2 glycerolSigma492639
2 13C glycerolSigma489484
KanamycinSigmaK1876
CarbenicillinSigmaC3416
Sodium phosphate dibasicSigmaS7907
Potassium phosphate monobasicSigmaP5655
Sodium chlorideSigma71380
calcium chlorideSigmaC1016
Magnesium sulfateSigma208094
Iron ChlorideSigma157740
Zinc chlorideSigma793523
MEM Vitamin Solution (100×)SigmaM68954
IPTGFisherBP1755
Trizma base SigmaT1503
TricineSigmaT0377
SDSSigma436143
sodium azidesigma71289
4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid Sigma178837
NameCompanyCatalog NumberComments
Softwares
Unicorn 6.3GE HealthcareAkta systems
ccpNMRCCPN spectrometer systems

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The NMR-Rosetta capsid model of M13 bacteriophage reveals a quadrupled hydrophobic packing epitope. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (4), 971-976 (2015).">Morag, O., Sgourakis, N. G., Baker, D., Goldbourt, A. The NMR-Rosetta capsid model of M13 bacteriophage reveals a quadrupled hydrophobic packing epitope. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (4), 971-976 (2015).
  2. Atomic model of the type III secretion system needle. Nature. 486 (7402), 276-279 (2012).">Loquet, A., et al. Atomic model of the type III secretion system needle. Nature. 486 (7402), 276-279 (2012).
  3. High-resolution structure of the Shigella type-III secretion needle by solid-state NMR and cryo-electron microscopy. Nat Commun. 5 (4976), (2014).">Demers, J. P., et al. High-resolution structure of the Shigella type-III secretion needle by solid-state NMR and cryo-electron microscopy. Nat Commun. 5 (4976), (2014).
  4. Hybrid Structure of the Type 1 Pilus of Uropathogenic Escherichia coli. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (40), 11691-11695 (2015).">Habenstein, B., et al. Hybrid Structure of the Type 1 Pilus of Uropathogenic Escherichia coli. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (40), 11691-11695 (2015).
  5. Structure of the amantadine binding site of influenza M2 proton channels in lipid bilayers. Nature. 463 (7281), 689-692 (2010).">Cady, S. D., et al. Structure of the amantadine binding site of influenza M2 proton channels in lipid bilayers. Nature. 463 (7281), 689-692 (2010).
  6. Structure of the chemokine receptor CXCR1 in phospholipid bilayers. Nature. 491 (7426), 779-783 (2012).">Park, S. H., et al. Structure of the chemokine receptor CXCR1 in phospholipid bilayers. Nature. 491 (7426), 779-783 (2012).
  7. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12 (7), 649-652 (2015).">Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12 (7), 649-652 (2015).
  8. Solid-state NMR spectroscopy structure determination of a lipid-embedded heptahelical membrane protein. Nat Methods. 10 (10), 1007-1012 (2013).">Wang, S., et al. Solid-state NMR spectroscopy structure determination of a lipid-embedded heptahelical membrane protein. Nat Methods. 10 (10), 1007-1012 (2013).
  9. Signal transduction by a fungal NOD-like receptor based on propagation of a prion amyloid fold. PLoS Biol. 13 (2), e1002059(2015).">Daskalov, A., et al. Signal transduction by a fungal NOD-like receptor based on propagation of a prion amyloid fold. PLoS Biol. 13 (2), e1002059(2015).
  10. Identification of a novel cell death-inducing domain reveals that fungal amyloid-controlled cell death is related to necroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2016).">Daskalov, A., et al. Identification of a novel cell death-inducing domain reveals that fungal amyloid-controlled cell death is related to necroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2016).
  11. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150 (2), 339-350 (2012).">Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150 (2), 339-350 (2012).
  12. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (6), 384-396 (2014).">Knowles, T. P., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (6), 384-396 (2014).
  13. Cell Biology of Prions and Prionoids: A Status Report. Trends Cell Biol. 26 (1), 40-51 (2016).">Aguzzi, A., Lakkaraju, A. K. Cell Biology of Prions and Prionoids: A Status Report. Trends Cell Biol. 26 (1), 40-51 (2016).
  14. Solid-state NMR: An emerging technique in structural biology of self-assemblies. Biophys Chem. , (2015).">Habenstein, B., Loquet, A. Solid-state NMR: An emerging technique in structural biology of self-assemblies. Biophys Chem. , (2015).
  15. The structure of fibrils from 'misfolded' proteins. Curr Opin Struct Biol. 30, 43-49 (2015).">Meier, B. H., Bockmann, A. The structure of fibrils from 'misfolded' proteins. Curr Opin Struct Biol. 30, 43-49 (2015).
  16. Solid state NMR and protein-protein interactions in membranes. Curr Opin Struct Biol. 23 (6), 919-928 (2013).">Miao, Y., Cross, T. A. Solid state NMR and protein-protein interactions in membranes. Curr Opin Struct Biol. 23 (6), 919-928 (2013).
  17. Advanced solid-state NMR approaches for structure determination of membrane proteins and amyloid fibrils. Acc Chem Res. 46 (9), 2080-2088 (2013).">Tang, M., Comellas, G., Rienstra, C. M. Advanced solid-state NMR approaches for structure determination of membrane proteins and amyloid fibrils. Acc Chem Res. 46 (9), 2080-2088 (2013).
  18. Solid-state NMR-based approaches for supramolecular structure elucidation. Acc Chem Res. 46 (9), 2037-2046 (2013).">Weingarth, M., Baldus, M. Solid-state NMR-based approaches for supramolecular structure elucidation. Acc Chem Res. 46 (9), 2037-2046 (2013).
  19. Structural investigations of molecular machines by solid-state NMR. Acc Chem Res. 46 (9), 2070-2079 (2013).">Loquet, A., Habenstein, B., Lange, A. Structural investigations of molecular machines by solid-state NMR. Acc Chem Res. 46 (9), 2070-2079 (2013).
  20. Probing structure and dynamics of protein assemblies by magic angle spinning NMR spectroscopy. Acc Chem Res. 46 (9), 2047-2058 (2013).">Yan, S., Suiter, C. L., Hou, G., Zhang, H., Polenova, T. Probing structure and dynamics of protein assemblies by magic angle spinning NMR spectroscopy. Acc Chem Res. 46 (9), 2047-2058 (2013).
  21. Molecular structures of amyloid and prion fibrils: consensus versus controversy. Acc Chem Res. 46 (7), 1487-1496 (2013).">Tycko, R., Wickner, R. B. Molecular structures of amyloid and prion fibrils: consensus versus controversy. Acc Chem Res. 46 (7), 1487-1496 (2013).
  22. Membrane protein structure and dynamics from NMR spectroscopy. Annu Rev Phys Chem. 63, 1-24 (2012).">Hong, M., Zhang, Y., Hu, F. Membrane protein structure and dynamics from NMR spectroscopy. Annu Rev Phys Chem. 63, 1-24 (2012).
  23. High-Resolution Three-Dimensional Solid-state NMR Spectroscopy of a Uniformly 15N-Labeled Protein. J Am Chem Soc. 117, 12348-12349 (1995).">Jelinek, R., Ramamoorthy, A., Opella, S. J. High-Resolution Three-Dimensional Solid-state NMR Spectroscopy of a Uniformly 15N-Labeled Protein. J Am Chem Soc. 117, 12348-12349 (1995).
  24. Bicelle-enabled structural studies on a membrane-associated cytochrome B5 by solid-state MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (41), 7864-7867 (2008).">Xu, J., et al. Bicelle-enabled structural studies on a membrane-associated cytochrome B5 by solid-state MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (41), 7864-7867 (2008).
  25. The magic of bicelles lights up membrane protein structure. Chem Rev. 112 (11), 6054-6074 (2012).">Durr, U. H., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelles lights up membrane protein structure. Chem Rev. 112 (11), 6054-6074 (2012).
  26. Probing the transmembrane structure and topology of microsomal cytochrome-p450 by solid-state NMR on temperature-resistant bicelles. Sci Rep. 3, 2556(2013).">Yamamoto, K., et al. Probing the transmembrane structure and topology of microsomal cytochrome-p450 by solid-state NMR on temperature-resistant bicelles. Sci Rep. 3, 2556(2013).
  27. Probing the transmembrane structure and dynamics of microsomal NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase by solid-state NMR. Biophys J. 106 (10), 2126-2133 (2014).">Huang, R., et al. Probing the transmembrane structure and dynamics of microsomal NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase by solid-state NMR. Biophys J. 106 (10), 2126-2133 (2014).
  28. Solid-state NMR reveals structural and dynamical properties of a membrane-anchored electron-carrier protein, cytochrome b5. J Am Chem Soc. 129 (21), 6670-6671 (2007).">Durr, U. H., Yamamoto, K., Im, S. C., Waskell, L., Ramamoorthy, A. Solid-state NMR reveals structural and dynamical properties of a membrane-anchored electron-carrier protein, cytochrome b5. J Am Chem Soc. 129 (21), 6670-6671 (2007).
  29. Determination of multiple phi-torsion angles in proteins by selective and extensive (13)C labeling and two-dimensional solid-state NMR. J Magn Reson. 139 (2), 389-401 (1999).">Hong, M. Determination of multiple phi-torsion angles in proteins by selective and extensive (13)C labeling and two-dimensional solid-state NMR. J Magn Reson. 139 (2), 389-401 (1999).
  30. Fractional 13C enrichment of isolated carbons using [1-13C]- or [2- 13C]-glucose facilitates the accurate measurement of dynamics at backbone Calpha and side-chain methyl positions in proteins. J Biomol NMR. 38 (3), 199-212 (2007).">Lundstrom, P., et al. Fractional 13C enrichment of isolated carbons using [1-13C]- or [2- 13C]-glucose facilitates the accurate measurement of dynamics at backbone Calpha and side-chain methyl positions in proteins. J Biomol NMR. 38 (3), 199-212 (2007).
  31. 13C spin dilution for simplified and complete solid-state NMR resonance assignment of insoluble biological assemblies. J Am Chem Soc. 133 (13), 4722-4725 (2011).">Loquet, A., Lv, G., Giller, K., Becker, S., Lange, A. 13C spin dilution for simplified and complete solid-state NMR resonance assignment of insoluble biological assemblies. J Am Chem Soc. 133 (13), 4722-4725 (2011).
  32. Structure of a protein determined by solid-state magic-angle-spinning NMR spectroscopy. Nature. 420 (6911), 98-102 (2002).">Castellani, F., et al. Structure of a protein determined by solid-state magic-angle-spinning NMR spectroscopy. Nature. 420 (6911), 98-102 (2002).
  33. Assigning large proteins in the solid state: a MAS NMR resonance assignment strategy using selectively and extensively 13C-labelled proteins. J Biomol NMR. 44 (4), 245-260 (2009).">Higman, V. A., et al. Assigning large proteins in the solid state: a MAS NMR resonance assignment strategy using selectively and extensively 13C-labelled proteins. J Biomol NMR. 44 (4), 245-260 (2009).
  34. Characterization of different water pools in solid-state NMR protein samples. J Biomol NMR. 45 (3), 319-327 (2009).">Bockmann, A., et al. Characterization of different water pools in solid-state NMR protein samples. J Biomol NMR. 45 (3), 319-327 (2009).
  35. Protein NMR spectroscopy, principles and practice. , Academic. San Diego. (1996).">Cavanagh, J., Fairbrother, W. J., Palmer, A. G., Skelton, N. J. Protein NMR spectroscopy, principles and practice. , Academic. San Diego. (1996).
  36. Nuclear Double Resonance in the Rotating Frame. Phys Rev. 128 (5), 2042-2053 (1962).">Hartman, S. R., Hahn, E. L. Nuclear Double Resonance in the Rotating Frame. Phys Rev. 128 (5), 2042-2053 (1962).
  37. Further conventions for NMR shielding and chemical shifts IUPAC recommendations 2008. Solid State Nucl Magn Reson. 33 (3), 41-56 (2008).">Harris, R. K., et al. Further conventions for NMR shielding and chemical shifts IUPAC recommendations 2008. Solid State Nucl Magn Reson. 33 (3), 41-56 (2008).
  38. Probability-based protein secondary structure identification using combined NMR chemical-shift data. Protein Sci. 11 (4), 852-861 (2002).">Wang, Y., Jardetzky, O. Probability-based protein secondary structure identification using combined NMR chemical-shift data. Protein Sci. 11 (4), 852-861 (2002).
  39. Computer-Optimized Scheme for Wideband Applications and Low-Level Operation. J Magn Reson. 64, 547-552 (1985).">Shaka, A. J., Baker, P. B., Freeman, R. Computer-Optimized Scheme for Wideband Applications and Low-Level Operation. J Magn Reson. 64, 547-552 (1985).
  40. http://bmrb.wisc.edu/ (2017).">BMRB - Biological Magnetic Resonance Bank. , http://bmrb.wisc.edu/ (2017).
  41. Observation of Spin Exchange by Two-Dimensional Fourier-Transform C-13 Cross Polarization-Magic-Angle Spinning. J Magn Reson. 47, 462-475 (1982).">Szeverenyi, N. M., Sullivan, M. J., Maciel, G. E. Observation of Spin Exchange by Two-Dimensional Fourier-Transform C-13 Cross Polarization-Magic-Angle Spinning. J Magn Reson. 47, 462-475 (1982).
  42. Cross polarization in the tilted frame: assignment and spectral simplification in heteronuclear spin systems. Mol Phys. 95 (5), 1197-1207 (1998).">Baldus, M., Petkova, A. T., Herzfeld, J., Griffin, R. G. Cross polarization in the tilted frame: assignment and spectral simplification in heteronuclear spin systems. Mol Phys. 95 (5), 1197-1207 (1998).
  43. Adiabatic dipolar recoupling in solid-state NMR: the DREAM scheme. J Magn Reson. 150 (1), 81-99 (2001).">Verel, R., Ernst, M., Meier, B. H. Adiabatic dipolar recoupling in solid-state NMR: the DREAM scheme. J Magn Reson. 150 (1), 81-99 (2001).
  44. http://www.ccpn.ac.uk/software/analysis (2017).">CcpNmr Analysis — Collaborative Computational Project for NMR. , http://www.ccpn.ac.uk/software/analysis (2017).
  45. https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ (2017).">Sparky - NMR Assignment and Integration Software. , https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ (2017).
  46. Secondary chemical shifts in immobilized peptides and proteins: a qualitative basis for structure refinement under magic angle spinning. J Biomol NMR. 20 (4), 325-331 (2001).">Luca, S., et al. Secondary chemical shifts in immobilized peptides and proteins: a qualitative basis for structure refinement under magic angle spinning. J Biomol NMR. 20 (4), 325-331 (2001).
  47. http://spin.niddk.nih.gov/bax/software/TALOS/ (2017).">TALOS+: Prediction of Protein Backbone Torsion Angles from NMR Chemical Shift. , http://spin.niddk.nih.gov/bax/software/TALOS/ (2017).
  48. SPARTA+: a modest improvement in empirical NMR chemical shift prediction by means of an artificial neural network. J Biomol NMR. 48 (1), 13-22 (2010).">Shen, Y., Bax, A. SPARTA+: a modest improvement in empirical NMR chemical shift prediction by means of an artificial neural network. J Biomol NMR. 48 (1), 13-22 (2010).
  49. http://wishart.biology.ualberta.ca/shiftor/ (2017).">SHIFTOR Dihedral angles from chemical shifts and homology. , http://wishart.biology.ualberta.ca/shiftor/ (2017).
  50. PREDITOR: a web server for predicting protein torsion angle restraints. Nucleic Acids Res. 34 (Web Server issue), W63-W69 (2006).">Berjanskii, M. V., Neal, S., Wishart, D. S. PREDITOR: a web server for predicting protein torsion angle restraints. Nucleic Acids Res. 34 (Web Server issue), W63-W69 (2006).
  51. ARIA for solution and solid-state NMR. Methods Mol Biol. 831, 453-483 (2012).">Bardiaux, B., Malliavin, T., Nilges, M. ARIA for solution and solid-state NMR. Methods Mol Biol. 831, 453-483 (2012).
  52. Comprehensive automation for NMR structure determination of proteins. Methods Mol Biol. 831, 429-451 (2012).">Guerry, P., Herrmann, T. Comprehensive automation for NMR structure determination of proteins. Methods Mol Biol. 831, 429-451 (2012).
  53. beta-Helical architecture of cytoskeletal bactofilin filaments revealed by solid-state NMR. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (2), E127-E136 (2015).">Vasa, S., et al. beta-Helical architecture of cytoskeletal bactofilin filaments revealed by solid-state NMR. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (2), E127-E136 (2015).
  54. Structure determination of helical filaments by solid-state NMR spectroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (3), E272-E281 (2016).">He, L., et al. Structure determination of helical filaments by solid-state NMR spectroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (3), E272-E281 (2016).
  55. High-resolution membrane protein structure by joint calculations with solid-state NMR and X-ray experimental data. J Biomol NMR. 51 (3), 227-233 (2011).">Tang, M., et al. High-resolution membrane protein structure by joint calculations with solid-state NMR and X-ray experimental data. J Biomol NMR. 51 (3), 227-233 (2011).
  56. Molecular structural basis for polymorphism in Alzheimer's beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18349-18354 (2008).">Paravastu, A. K., Leapman, R. D., Yau, W. M., Tycko, R. Molecular structural basis for polymorphism in Alzheimer's beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18349-18354 (2008).
  57. Atomic-resolution three-dimensional structure of amyloid beta fibrils bearing the Osaka mutation. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 331-335 (2015).">Schutz, A. K., et al. Atomic-resolution three-dimensional structure of amyloid beta fibrils bearing the Osaka mutation. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 331-335 (2015).
  58. Modeling an in-register, parallel "iowa" abeta fibril structure using solid-state NMR data from labeled samples with rosetta. Structure. 23 (1), 216-227 (2015).">Sgourakis, N. G., Yau, W. M., Qiang, W. Modeling an in-register, parallel "iowa" abeta fibril structure using solid-state NMR data from labeled samples with rosetta. Structure. 23 (1), 216-227 (2015).
  59. Proton assisted insensitive nuclei cross polarization. J Am Chem Soc. 129 (4), 728-729 (2007).">Lewandowski, J. R., De Paepe, G., Griffin, R. G. Proton assisted insensitive nuclei cross polarization. J Am Chem Soc. 129 (4), 728-729 (2007).
  60. How to tackle protein structural data from solution and solid state: An integrated approach. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 92-93, 54-70 (2016).">Carlon, A., et al. How to tackle protein structural data from solution and solid state: An integrated approach. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 92-93, 54-70 (2016).
  61. Solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy for membrane protein structure determination. Methods Mol Biol. 1261, 331-347 (2015).">Judge, P. J., Taylor, G. F., Dannatt, H. R., Watts, A. Solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy for membrane protein structure determination. Methods Mol Biol. 1261, 331-347 (2015).
  62. Recent advances in magic angle spinning solid state NMR of membrane proteins. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 82, 1-26 (2014).">Wang, S., Ladizhansky, V. Recent advances in magic angle spinning solid state NMR of membrane proteins. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 82, 1-26 (2014).
  63. Structure and assembly of the mouse ASC inflammasome by combined NMR spectroscopy and cryo-electron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (43), 13237-13242 (2015).">Sborgi, L., et al. Structure and assembly of the mouse ASC inflammasome by combined NMR spectroscopy and cryo-electron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (43), 13237-13242 (2015).
  64. Atomic structure and handedness of the building block of a biological assembly. J Am Chem Soc. 135 (51), 19135-19138 (2013).">Loquet, A., et al. Atomic structure and handedness of the building block of a biological assembly. J Am Chem Soc. 135 (51), 19135-19138 (2013).
  65. Atomic-resolution structure of a disease-relevant Abeta(1-42) amyloid fibril. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E4976-E4984 (2016).">Walti, M. A., et al. Atomic-resolution structure of a disease-relevant Abeta(1-42) amyloid fibril. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E4976-E4984 (2016).
  66. Atomic Resolution Structure of Monomorphic Abeta42 Amyloid Fibrils. J Am Chem Soc. 138 (30), 9663-9674 (2016).">Colvin, M. T., et al. Atomic Resolution Structure of Monomorphic Abeta42 Amyloid Fibrils. J Am Chem Soc. 138 (30), 9663-9674 (2016).
  67. Abeta(1-42) fibril structure illuminates self-recognition and replication of amyloid in Alzheimer's disease. Nat Struct Mol Biol. 22 (6), 499-505 (2015).">Xiao, Y., et al. Abeta(1-42) fibril structure illuminates self-recognition and replication of amyloid in Alzheimer's disease. Nat Struct Mol Biol. 22 (6), 499-505 (2015).
  68. Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human alpha-synuclein. Nat Struct Mol Biol. 23 (5), 409-415 (2016).">Tuttle, M. D., et al. Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human alpha-synuclein. Nat Struct Mol Biol. 23 (5), 409-415 (2016).
  69. Amyloid fibrils of the HET-s(218-289) prion form a beta solenoid with a triangular hydrophobic core. Science. 319 (5869), 1523-1526 (2008).">Wasmer, C., et al. Amyloid fibrils of the HET-s(218-289) prion form a beta solenoid with a triangular hydrophobic core. Science. 319 (5869), 1523-1526 (2008).
  70. Atomic-resolution three-dimensional structure of HET-s(218-289) amyloid fibrils by solid-state NMR spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (39), 13765-13775 (2010).">Van Melckebeke, H., et al. Atomic-resolution three-dimensional structure of HET-s(218-289) amyloid fibrils by solid-state NMR spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (39), 13765-13775 (2010).
  71. http://www.bmrb.wisc.edu/data_library/solidstate.shtml (2017).">BMRB Solid-state NMR entries. , http://www.bmrb.wisc.edu/data_library/solidstate.shtml (2017).
  72. Solid-state NMR of a protein in a precipitated complex with a full-length antibody. J Am Chem Soc. 136 (48), 16800-16806 (2014).">Lamley, J. M., et al. Solid-state NMR of a protein in a precipitated complex with a full-length antibody. J Am Chem Soc. 136 (48), 16800-16806 (2014).
  73. De novo 3D structure determination from sub-milligram protein samples by solid-state 100 kHz MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (45), 12253-12256 (2014).">Agarwal, V., et al. De novo 3D structure determination from sub-milligram protein samples by solid-state 100 kHz MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (45), 12253-12256 (2014).
  74. NMR Spectroscopic Assignment of Backbone and Side-Chain Protons in Fully Protonated Proteins: Microcrystals, Sedimented Assemblies, and Amyloid Fibrils. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (50), 15504-15509 (2016).">Stanek, J., et al. NMR Spectroscopic Assignment of Backbone and Side-Chain Protons in Fully Protonated Proteins: Microcrystals, Sedimented Assemblies, and Amyloid Fibrils. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (50), 15504-15509 (2016).
  75. Characterization of membrane protein function by solid-state NMR spectroscopy. Curr Opin Struct Biol. 27, 48-55 (2014).">Baker, L. A., Baldus, M. Characterization of membrane protein function by solid-state NMR spectroscopy. Curr Opin Struct Biol. 27, 48-55 (2014).
  76. In-cell NMR: a topical review. IUCrJ. 4 (Pt 2), 108-118 (2017).">Luchinat, E., Banci, L. In-cell NMR: a topical review. IUCrJ. 4 (Pt 2), 108-118 (2017).
  77. Live cell NMR. Annu Rev Biophys. 43, 171-192 (2014).">Freedberg, D. I., Selenko, P. Live cell NMR. Annu Rev Biophys. 43, 171-192 (2014).
  78. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).">Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).
  79. Antiparallel beta-sheet architecture in Iowa-mutant beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (12), 4443-4448 (2012).">Qiang, W., Yau, W. M., Luo, Y., Mattson, M. P., Tycko, R. Antiparallel beta-sheet architecture in Iowa-mutant beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (12), 4443-4448 (2012).
  80. Experimentally derived structural constraints for amyloid fibrils of wild-type transthyretin. Biophys J. 101 (10), 2485-2492 (2011).">Bateman, D. A., Tycko, R., Wickner, R. B. Experimentally derived structural constraints for amyloid fibrils of wild-type transthyretin. Biophys J. 101 (10), 2485-2492 (2011).
  81. RNA structure determination by solid-state NMR spectroscopy. Nat Commun. 6, 7024(2015).">Marchanka, A., Simon, B., Althoff-Ospelt, G., Carlomagno, T. RNA structure determination by solid-state NMR spectroscopy. Nat Commun. 6, 7024(2015).
  82. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (26), 5956-5960 (2011).">Schutz, A. K., et al. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (26), 5956-5960 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Solid State NMRMacromolecular AssembliesIsotope LabelingMagic Angle SpinningProtein Filament AssemblyCP ExperimentPDSD ExperimentResonance AssignmentDistance RestraintsStructural Modeling

Related Articles