Miljoenen mensen lijden aan retinale degeneratieve ziekten die leiden tot onomkeerbare blindheid. Een gemeenschappelijk element van veel van deze ziekten is het verlies van retinale ganglioncellen (RGC's). Dit gedetailleerde protocol beschrijft de isolatie van primaire murine RGC's door positieve en negatieve selectie met flowcytometrie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van Primaire Murine Retinale Ganglioncellen (RGC's) door Flow Cytometry
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Neurodegeneratieve ziekten hebben vaak een verwoestende invloed op de getroffen personen. Retinal ganglion cell (RGC) verlies is betrokken bij een reeks ziektes, waaronder diabetische retinopathie en glaucoom, naast normale veroudering. Ondanks hun belang zijn RGC's tot nu toe extreem moeilijk te bestuderen, onder meer doordat ze slechts een klein percentage van de grote verscheidenheid van cellen in het netvlies bevatten. Bovendien gebruiken huidige isolatiemethoden intracellulaire markers om RGC's te identificeren, die niet-levensvatbare cellen produceren. Deze technieken omvatten ook lange isolatieprotocollen, zodat er geen praktische, gestandaardiseerde en betrouwbare methoden zijn om RGC's te verkrijgen en te isoleren. Dit werk beschrijft een efficiënte, uitgebreide en betrouwbare methode om primaire RGC's van muizenretinae te isoleren met behulp van een protocol gebaseerd op zowel positieve als negatieve selectiecriteria. De gepresenteerde methodes maken het mogelijk om de toekomstige studie van RGC's te beantwoorden, met als doel het beter te begrijpen van de hoofdvakDaling van de gezichtsscherpte die voortvloeit uit het verlies van functionele RGC's in neurodegeneratieve ziekten.
Inleiding
RGC's zijn terminale gedifferentieerde neuronen, en daarom zijn primaire cellen nodig voor experimenten. De ontwikkeling van een protocol voor het isoleren en verrijken van primaire murine retinale ganglioncellen (RGC's) is essentieel om de mechanismen van RGC gezondheid en degeneratie in vitro te onthullen. Dit is vooral belangrijk voor studies die proberen potentiële therapieën te genereren om de RGC-functie te bevorderen en hun dood te minimaliseren. De degeneratie van RGC's is geassocieerd met retinale degeneratieve ziekten, zoals glaucoom, diabetische retinopathie en normale veroudering. Hoewel de specifieke cellulaire mechanismen die het RG....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures die in het volgende protocol zijn beschreven, werden goedgekeurd door het Inspectie Comité voor de Diervoeding en -gebruik (IACUC) bij het University of Tennessee Health Science Center (UTHSC) en volgden de ARVO-verklaringen voor het gebruik voor gebruik in de visie- en oogheelkunde (ARVO) Van dieren in oogheelkunde en visie onderzoek, naast de richtlijnen voor laboratoriumdierproeven (Instituut voor Laboratorium Diervoeder, Volksgezondheidszorgbeleid inzake Humane Verzorging en Gebruik van Laboratoriumdieren).
1. Voorbereiding van instrumenten, oplossingen en media
Opmerking: Al....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De diepgaande studie van RGC's wordt belemmerd door vele factoren, waaronder hun lage frequentie en het ontbreken van een robuuste en gestandaardiseerde methodologie voor hun isolatie. Figuur 1 toont de methodologie die wordt gebruikt voor retinae isolatie. Variaties in de enucleatieprocedure bestaan op basis van het soort analyse, zoals als de enucleatie onderdeel uitmaakt van in vivo experimenten 27 . Enucleatie.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
FACS is de gewenste techniek om celpopulaties te zuiveren. Andere isolatiemethoden omvatten immunopanning, magnetische kralen en complement-fixatie-uitputting. Het voordeel van FACS over deze andere methodologieën is gebaseerd op de gelijktijdige identificatie van celoppervlakmarkers met verschillende intensiteitsgraden. De fluorescerende intensiteit van het molecuul is evenredig aan de hoeveelheid eiwituitdrukking. Tot nu toe was de isolatie van RGCs uitsluitend gebaseerd op Thy1 (CD90) positiviteit en CD48 negativitei.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs willen de heer Tim Higgins, Senior Illustrator van de afdeling Microbiologie, Immunologie en Biochemie, bedanken voor technische video assistentie; Dr. Matthew W. Wilson voor discussies en de leden van de laboratoria Jablonski en Morales-Tirado voor hun nuttige opmerkingen. Dit werk werd ondersteund door de Alcon Research Institute Young Onderzoeker Award (VMM-T), de Universiteit van Tennessee Research Foundation (VMM-T), het National Eye Institute EY021200 (MMJ), de Gerwin Fellowship (VMM-T); De Gerwin Pre-doctoral Society (ZKG), het ministerie van Defensie Army Medical Research and Materiel Command (VMM-T) en de onbeperkte subsidie van onderzoek om bli....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Anti-mouse CD15 PE | BioLegend | 125606 | Clone MC-480 |
| Anti-mouse CD48 PE-Cy7 | BioLegend | 103424 | Clone HM48-1 |
| Anti-mouse CD57 | Sigma Aldrich | C6680-100TST | Clone VC1.1 |
| Anti-mouse CD90.2 AF700 | BioLegend | 105320 | Clone 30-H12 |
| Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgG | BioLegend | 405317 | Clone Poly4053 |
| Purified Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | FcgRII/III block, Clone 93 |
| Zombie Aqua | BioLegend | 423102 | Live cell/ Dead cell discrimination |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | U.S. origin |
| AbC Total Antibody Compensation Bead Kit | Thermo Fisher Scientific | A10497 | Multi-species Ig |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Add serum to media prior to culture. |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | Saline solution |
| Dissection Microscope | Olympus | SZ-PT Model | Stereo Microscope |
| Sorvall Centrifuge | Thermo Scientific | ST 16R | All centrifugation performed at RT |
| Base Plate – Dissection Pan | Fisher Scientific | SB15233FIM | A wax plate can also be used |
| Forceps | Aesculap | 5002-7 | 4 ½ inches |
| Iris Scissors, Straight | Aesculap | 1360 | 5 ½ inches |
| Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352097 | Polypropylene tubes |
| Falcon 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352098 | Polypropylene tubes |
| BD FACS Tubes | Fisher Scientific | 352003 | Polypropylene tubes |
| 40 mm dishes | MidSci | TP93040 | Tissue culture treated |
| 70 μm nylon strainer | MidSci | 70ICS | sterile |
| 40 μm nylon strainer | MidSci | 40ICS | sterile |
| BD 10 mL syringe | Fisher Scientific | 301604 | Disposable Syringe without needle |
| Pestles | MidSci | PEST | sterile |
| Wheaton Vials | Fisher Scientific | 986734 | No Liner |
| BD 30 G needle | Fisher Scientific | 305128 | 1 inch |
| Hausser Scientific Bright-Line Glass Counting Chamber | Fisher Scientific | 0267151B | Hemocytometer |
| Gibco Trypan blue 0.4% Solution | Fisher Scientific | 15250061 | Viability Dye |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | 1.5mL |
| EVOS Floid Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | 447113 | Fluorescence Imaging with a 20X objective |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-452 | Used to make 70% Ethanol |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Rainin | 17014282 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Rainin | 17014391 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Rainin | 17014392 | LTS Pipette |
| Rack LTS 1000 mL – GPS-L1000S | Rainin | 17005088 | Blue Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 250 mL – GPS-L250S | Rainin | 17005092 | Green Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 20 mL – GPS-L10S | Rainin | 17005090 | Red Rack Sterile Tips |
| FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| LSR II Cytometer | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| Abca8a | Thermo Fisher Scientific | Mm00462440_m1 | Müller cells |
| Aldh1al | Thermo Fisher Scientific | Mm00657317_m1 | Müller cells |
| Aqp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00802131_m1 | Astrocytes |
| Calb2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00801461_m1 | Amacrine, Horizontal |
| Cd68 | Thermo Fisher Scientific | Mm03047340_m1 | Retinal Pigment Epithelial Cells |
| Gad2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00484623_m1 | Amacrine |
| Hprt | Thermo Fisher Scientific | Mm01545399_m1 | House keeping gene |
| Lhx1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01297482_m1 | Horizontal |
| Lim2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00624623_m1 | Horizontal |
| Nrl | Thermo Fisher Scientific | Mm00476550_m1 | Photoreceptors |
| Ntrk1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01219406_m1 | Horizontal |
| Pcp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00500973_m1 | Bipolar, Amacrine |
| Pou4f1 | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Prdx6 | Thermo Fisher Scientific | Mm00725435_s1 | Astrocytes |
| Prkca | Thermo Fisher Scientific | Mm00440858_m1 | Bipolar |
| Prox1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00435969_m1 | Horizontal |
| Pvalb | Thermo Fisher Scientific | Mm00443100_m1 | Amacrine |
| Rbpms | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Rom1 | Thermo Fisher Scientific | Mm004363 |
Referenties
- Flammer, J., Orgul, S. Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).
- Bathija, R. Optic nerve blood flow in glaucoma. Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).
- Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
