Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van Primaire Murine Retinale Ganglioncellen (RGC's) door Flow Cytometry

15.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55785

⸱

5 juli 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Hamilton Eye Institute, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Microbiology, Immunology and Biochemistry, University of Tennessee Health Science Center, 3Department of Anatomy and Neurobiology, University of Tennessee Health Science Center, 4Department of Pharmaceutical Sciences, University of Tennessee Health Science Center

In dit artikel

Samenvatting

Miljoenen mensen lijden aan retinale degeneratieve ziekten die leiden tot onomkeerbare blindheid. Een gemeenschappelijk element van veel van deze ziekten is het verlies van retinale ganglioncellen (RGC's). Dit gedetailleerde protocol beschrijft de isolatie van primaire murine RGC's door positieve en negatieve selectie met flowcytometrie.

Samenvatting

Neurodegeneratieve ziekten hebben vaak een verwoestende invloed op de getroffen personen. Retinal ganglion cell (RGC) verlies is betrokken bij een reeks ziektes, waaronder diabetische retinopathie en glaucoom, naast normale veroudering. Ondanks hun belang zijn RGC's tot nu toe extreem moeilijk te bestuderen, onder meer doordat ze slechts een klein percentage van de grote verscheidenheid van cellen in het netvlies bevatten. Bovendien gebruiken huidige isolatiemethoden intracellulaire markers om RGC's te identificeren, die niet-levensvatbare cellen produceren. Deze technieken omvatten ook lange isolatieprotocollen, zodat er geen praktische, gestandaardiseerde en betrouwbare methoden zijn om RGC's te verkrijgen en te isoleren. Dit werk beschrijft een efficiënte, uitgebreide en betrouwbare methode om primaire RGC's van muizenretinae te isoleren met behulp van een protocol gebaseerd op zowel positieve als negatieve selectiecriteria. De gepresenteerde methodes maken het mogelijk om de toekomstige studie van RGC's te beantwoorden, met als doel het beter te begrijpen van de hoofdvakDaling van de gezichtsscherpte die voortvloeit uit het verlies van functionele RGC's in neurodegeneratieve ziekten.

Inleiding

RGC's zijn terminale gedifferentieerde neuronen, en daarom zijn primaire cellen nodig voor experimenten. De ontwikkeling van een protocol voor het isoleren en verrijken van primaire murine retinale ganglioncellen (RGC's) is essentieel om de mechanismen van RGC gezondheid en degeneratie in vitro te onthullen. Dit is vooral belangrijk voor studies die proberen potentiële therapieën te genereren om de RGC-functie te bevorderen en hun dood te minimaliseren. De degeneratie van RGC's is geassocieerd met retinale degeneratieve ziekten, zoals glaucoom, diabetische retinopathie en normale veroudering. Hoewel de specifieke cellulaire mechanismen die het RGC-verlies hebben, onduidelijk zijn, zijn er een aantal risicofactoren geïdentificeerd. Gebrek aan zuurstof bij de optische zenuwkop 1 , 2 , 3 veroorzaakt RGC-dood 4 en fungeert als de verstoring van de homeostase tussen de activatie van excitatoire en iInhibitorische receptoren binnen individuele RGC's 5 , 6 . Een reeks uitdagingen belemmert de vooruitgang naar het gebruik van deze cellen voor diepgaande studies. Ten eerste is het aantal RGC's aanwezig in een murina retina klein. RGC's vertegenwoordigen minder dan 1% van de totale retinale cellen 7 , 8 , 9 . Ten tweede zijn de meeste RGC-specifieke markers intracellulaire eiwitten 10 , 11 , 12 . Selectie op basis van deze markers laat de cellen niet levensvatbaar, wat de stroomafwaartse functionele analyses uitsluit. Tenslotte zijn de beschikbare protocollen langdurig en ontbreken standaardisatie 13 , 14 . Vroege RGC isolatieprotocollen waren gebaseerd op immunopanning methoden. Barres et al. 15 Aangepast aan de klassieke immuunAnningstechniek en voegde een tweede stap toe, die monocyten en endotheelcellen uit het grootste deel van retinale cellen uitgesloten voorafgaand aan positieve selectie op basis van immunopositiviteit tegen anti-thymocytantigeen (aka Thy1), een celoppervlakmarkering. Jaren later, Hong et al. Gecombineerde magnetische kraal isolatie technieken met cel sortering strategieën om RGC's te isoleren met hogere zuiverheid 16 . Het gebruik van magnetische kralen wordt nog steeds in veel wetenschappelijke toepassingen gebruikt. Samen verbeterden magnetische kralen en flowcytometrieprotocollen de zuiverheid van geïsoleerde cellen. Echter, deze zuiveringssystemen zijn nog niet gestandaardiseerd voor de isolatie van murine RGC's uit gedissocieerde retinae.

Flowcytometrie is een krachtige analytische methode die de optische en fluorescentie eigenschappen van cel suspensies meet. Cellen worden zowel kwantitatief als kwalitatief geanalyseerd met een hoge mate van gevoeligheid, waardoor een multidimensionale analyse van de celbevolkingatie. Cellulaire discriminatie is gebaseerd op twee hoofd fysieke eigenschappen: celgrootte of oppervlakte en granulariteit of interne complexiteit 17 . Een multidimensionale analyse kan worden uitgevoerd door het combineren van antilichamen die zijn gemarkeerd met fluorochromen die soortgelijke excitatie golflengten en verschillende emissies hebben. Flowcytometrie is snel, reproduceerbaar en gevoelig. Multitpe lasers maken het mogelijk om nog meer multidimensionale analyses van enkele cellen door flowcytometrie toe te passen. Zo is het een aantrekkelijke methodologie voor de studie van cytologische monsters. Fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) gebruikt de multidimensionale fenotypische verschillen die zijn geïdentificeerd door flowcytometrie om individuele cellen te sorteren in verschillende subpopulaties.

In het laatste decennium zijn meerdere oppervlak- en intracellulaire eiwitten geïdentificeerd als potentiële biomarkers voor de selectie van cellen, inclusief neuronen. Aanvankelijke studies die RGC's van ratten wilden isoleren, gebruikt Thy1 als een ganglion celL marker. Helaas heeft Thy1, aka CD90, meerdere isoformen in andere knaagdier soorten 18 , 19 , 20 en wordt uitgedrukt door meerdere retinale cel typen 19 , 20 , waardoor het een niet-specifieke marker voor RGC's is. Een andere oppervlakte marker, CD48, is gevonden op monocytische populaties in het netvlies, waaronder macrofagen en microglia. Met behulp van deze twee oppervlaktemerkers werd een gewijzigde RGC-handtekening-Thy1 + en CD48 negcellen ontwikkeld 15 , 16 , 21 , 22 . Helaas zijn deze twee selectiecriteria niet voldoende om te kiezen voor een zeer verrijkte RGC-populatie. Om deze onvervulde behoefte aan te pakken, werd een flow cytometry protocol ontwikkeld 23 gebaseerd op multi-layered positieve en negatieve selectiecriteria usiNg bekende celoppervlakmarkers om primaire murine RGC's te verrijken en te zuiveren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures die in het volgende protocol zijn beschreven, werden goedgekeurd door het Inspectie Comité voor de Diervoeding en -gebruik (IACUC) bij het University of Tennessee Health Science Center (UTHSC) en volgden de ARVO-verklaringen voor het gebruik voor gebruik in de visie- en oogheelkunde (ARVO) Van dieren in oogheelkunde en visie onderzoek, naast de richtlijnen voor laboratoriumdierproeven (Instituut voor Laboratorium Diervoeder, Volksgezondheidszorgbeleid inzake Humane Verzorging en Gebruik van Laboratoriumdieren).

1. Voorbereiding van instrumenten, oplossingen en media

Opmerking: Alle informatie over materialen, reagentia, gereedschappen en instrumenten die in het protocol zijn vermeld, worden vermeld in de Tabel .

  1. Autoclaaf alle dissectie-instrumenten en sla ze op in een steriel gebied. Gebruik de volgende instrumenten: 4 standaardpincen (2 lange en 2 korte) en 2 scharen,Evenals 2 tang (1 lang en 1 kort) en 1 schaar voor de dissectie; Houd een extra set als back-up.
  2. Bereid 100 ml steriele PBS / 1% FBS oplossing voor gebruik tijdens wasingen, immunolabeling procedures en celsorteringsstappen. Houd de oplossing bij 4 ° C gekoeld.
    Opmerking: Voeg geen natriumazide (NaN 3 ) toe aan de oplossing, omdat het giftig is voor levende cellen.
    1. Bereid 100 ml PBS / 1% FBS op met 99 ml PBS en 1 ml FBS.
  3. Bereid 100 ml steriele neurale celmedium aangevuld met 3% FBS (zie de Tabel van Materialen ) voor gebruik als verzamel- en cultuurmedium. Houd celcultuurmedium steriel bij 4 ° C. Verwarm het voor kamertemperatuur (RT) alleen voor gebruik.
    1. Bereid 100 ml neuraal celmedium aangevuld met 3% FBS aan met gebruik van 97 ml neurale celmedium en 3 ml FBS.
  4. Pre-chill collectie buizen (15 ml buizen) vooraf bedekt met 5 ml verzamelmedium door t te plaatsenZoom in een ijsemmer. Gebruik alleen polypropyleenbuizen om te voorkomen dat de cellen aan het buisoppervlak vastkomen.
  5. Plaats 40 mm schotels, 70 μm nylon snippers, spuiten, pestles voor de celsilinder en steriele polypropyleen buizen in de biosafety kast. Steriliseer alle items vóór de procedures en houd ze op een steriele manier door de procedures.
    Opmerking: Alle stappen na de verzameling van de retinae worden uitgevoerd in de biosafety-kast.

2. Enucleatie

Opmerking: In dit experiment werden 10 jonge (5-7 weken oude) C57BL / 6J muizen gebruikt om 1,0 x 106 RGC's te isoleren met het fenotype CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg .

  1. Euthanize de muizen met behulp van CO 2 inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie. Gebruik altijd een secundaire euthanasiemethode om ervoor te zorgen dat het gezochte dier dood is.
    Opmerking: Isofluoraan kan als alternatief voor CO 2 worden gebruikt. Ketamine wordt niet aanbevolen, aangezien het geassocieerd wordt met een toename van de intraoculaire druk (IOP) wanneer deze gebruikt wordt als inducer van verdoving 24 , 25 .
  2. Steek pincet onder de bol van het oog, grijp de optische zenuw en trek het op; De globe wordt geucleateerd, met de optische zenuw intact. Plaats de verzamelde ogen in een injectieflacon met PBS en houd de injectieflacon op ijs tot de volgende stap.
    Opmerking: Iedere medewerker kan deze stap uitvoeren na ontvangst van de passende training van de Laboratorium voor dierenarts (LACU).

3. Bereiding van de retinale cel suspensie

  1. Plaats het verzamelde oog op de basisplaat van een dissectiemicroscoop om de hoornvliesdissectie te beginnen. Dissect elk oog individueel.
  2. Houd de klok voorzichtig vast op de optische zenuwbasis met behulp van tang. Voor deze stap, gebruik een lonG, en een korte standaardpincet.
  3. Gebruik een 30-gauge (30G) scherpe naald om de hoornvlies te punkeren om de waterige humor te laten evacueren vanuit het oog, waardoor het makkelijker wordt om het oog vast te houden met de tang.
  4. Houd de hoornvlies met de tang en gebruik een schaar om een ​​kleine incisie in de hoornvlies te maken. Schud de hoornvlies en sclera voorzichtig met behulp van de tang. Wanneer de bol half wordt geschild, rol dan de retina en lens uit met behulp van de tang. Gooi de hoornvlies, sclera en lens weg.
    Opmerking: deze methode zorgt ervoor dat het netvlies volledig loskomt van de rest van het oog.
  5. Plaats het netvlies in een kleine 40 mm Petri-schotel met PBS / 1% FBS.
    Opmerking: Als alternatief voor de Petri-schotel kan een celcultuurschotel gebruikt worden. Zorg ervoor dat de retinae altijd vochtig blijft, zoals bij fysiologische omstandigheden.
    1. Was elk retina driemaal met verse steriele PBS / 1% FBS in de biosafety-kast.
  6. Plaats maximaal 12 retinae aanEen steriel 70 μm nylon straal bevochtigd met PBS / 1% FBS. Gebruik het achterkant van een 10 ml spuit, maak de retinae voorzichtig met behulp van een cirkelvormige beweging om de cellen los te maken.
    1. Als alternatief gebruik je een stamper voor de maceratie van de celstraal of gebruik enzymatische vertering met een combinatie van 15 IE / ml papain, 5 mM L-cysteïne en 200 U / ml DNase I gedurende 15 minuten bij 37 ° C, gevolgd door inactivering met PBS / 10% FBS.
      Opmerking: Er werden geen veranderingen in het percentage teruggekomen cellen waargenomen wanneer enzymatische spijsvertering werd vergeleken met maceratie met het achterkant van de injectiespuit of de stamper.
  7. Om de geïsoleerde cellen over te brengen, plaats de steriele 70 μm nylon filter over de polypropyleen collectie buis. Pass de verzamelde cellen door de filter met een P1000 pipet. Spoel de zeef ( stap 3.6 ) met PBS / 1% FBS om eventuele resterende cellen vrij te geven en over te brengen naar de verzamelbuis.
  8. Voeg PBS / 1% FBS toe aan achEen eindvolume van 1 ml per netvlies. Centrifugeer de cel suspensie gedurende 7 minuten bij 200 xg en RT.
    Opmerking: Afhankelijk van het aantal gesmolten retinae (<6 retinae), kan de celpelletje te klein zijn om zichtbaar te zijn.
    1. Verwijder de cel supernatant en resuspendeer de celpellet in PBS / 1% FBS met een verhouding van 1 ml per 5 retinae.
  9. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
    1. Maak een glazen hemocytometer en deklaag met 70% alcohol schoon. Wissel de buis die de cellen bevat zorgvuldig om om ervoor te zorgen dat de retina cel suspensie gelijkmatig verdeeld is. Plaats 20 μL 0,4% trypan blauw in een microcentrifugebuis en meng met 20 μl van de celsuspensie.
    2. Meng zachtjes en voeg 10 μL van de 0,4% trypanblauw / cel suspensie mix toe aan de hemocytometer, vul beide kamers; Capillaire werking trekt de 0,4% trypan blauw / cel suspensie mix onder de deklaag. Met behulp van een microscoop tellen alle trypan-blauw-negatieve cellen; thiHet getal vertegenwoordigt de levende cellen.
    3. Bepaal de levensvatbaarheid van de cel met behulp van de volgende formule: aantal levende cellen / totale celtelling =% levensvatbaarheid.
      Opmerking: Als de levensvatbaarheid van de cellen kleiner is dan 95%, is het gebruik van fluorescerende kleurstof voor discriminatie van celliviteit vereist tijdens FACS.
  10. Gebruik een fluorescerende levensvatbaarheid kleurstof die niet-permeant is voor levende cellen. Was de cellen met PBS om elke sporen van serum te verwijderen. Voeg 1 μL fluorescerende kleurstof toe voor discriminatie op cellevendigheid per 5,0 x 106 cellen in een 100 μl eindvolume. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten, beschermd tegen licht. Voeg 10x het volume PBS / 1% FBS toe. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 xg en RT.
  11. Incubeer de celsuspensie overnacht bij 4 ° C, indien nodig. Als dit gedaan is, vul de cel suspensie buis met neurale cel medium in plaats van PBS / 1% FBS. Plaats de buis horizontaal en houd deze bij 4 ° C.

4. Immunolabeling van de ReTinale cellen

  1. Gebruik de volgende omzetting om het volume van antilichaam per celnummer te bepalen: 2 μl antilichaam per 5,0 x 106 cellen in een volume van 100 μl.
  2. Was de cellen en houd ze in PBS / 1% FBS. Neem een ​​kleine aliquot van cellen (5,0 x 10 6 cellen) om als negatieve controle (ongemerkt) te gebruiken op het moment van de sorteringsinstelling.
    Opmerking: Deze negatieve controle is van cruciaal belang voor de juiste kalibratie van de celsoort.
  3. Om de niet-specifieke binding van antilichamen tegen de cellen die de Fcγ-receptoren II en III uitdrukken te minimaliseren, voeg 1 μl van een anti-muis CD16 / 32-antilichaam per 1,0 x 106 cellen toe in een 50 μl eindvolume onder gebruikmaking van PBS / 1% FBS. Incubeer gedurende 10 minuten bij RT.
  4. Voeg de antilichaamcocktail toe aan het monster en meng zachtjes door pipettering. Incubeer gedurende 30 minuten in een ijsemmer. Zorg ervoor dat het ijsemmer is bedekt, omdat licht het experiment kan veroorzaken door het fotobakken van de gemarkeerde fluorphores.
    1. Bereid de antilichaamcocktail aan met behulp van de volgende fluorescente gelabelde anti-muis antilichamen: CD90.2 AF-700, CD48 PE-Cyanine7, CD15 PE en niet-gelabelde CD57.
      Opmerking: Voor elk antilichaam gebruik de volgende concentraties per 5,0 x 106 cellen: CD90.2 AF700, 1 μg; CD48 PE-Cyanine7, 0,4 μg; CD15 PE, 0,02 μg; En ongecodeerde CD57, 0,4 μg.
      1. Gebruik de volumes volgens de volgende berekeningen (gebaseerd op de in de tabel van materialen verkrijgbare antilichamen): totaal van 5,0 x 107 cellen die gemerkt moeten worden; 2 μL per 5,0 x 106 cellen = 20 μl van elk antilichaam; 4 verschillende antilichamen = 80 μl antilichaamcocktail; Eindvolume = [(5,0 x 10 7 totale cellen) / 5,0 x 10 6 cellen] x 100 = 1000 μL; 80 μl Abs + 50 μl anti-muis CD16 / 32 + 870 μl PBS / 1% FBS = 1.000 μl.
        Opmerking: deze combinatie gaf deOptimale combinatie van fluorochromen voor de instrumentconfiguratie. De volgende parameters samenvatten de emissie en excitatie: AF-700, emissie van 719 nm wanneer opgewonden met een rode diode laser van 638 nm; PE-Cyanine7, emissie van 767 nm wanneer opgewonden met een 488 nm blauwe diode laser; En PE, emissie van 575 nm wanneer opgewonden met een 488 nm blauwe diode laser.
  5. Na de 30 minuten incubatie breng het volume tot 5 ml met PBS / 1% FBS. Was de monsters door ze gedurende 7 minuten bij 200 xg en RT te centrifugeren. Herhaal de procedure eenmalig om alle ongebonden antilichamen te verwijderen.
  6. Voeg 2 μL secundair antilichaam (0,1 μg) toe, dat de CD57 van 5,0 x 106 cellen bindt. Incubeer gedurende 30 minuten in een ijsbak, zoals in stap 4.4 . Was de cellen tweemaal, zoals in stap 4.5 .
    1. Benoem de cellen met secundair antilichaam als een un-tagged primair antilichaam werd gebruikt in stap 4.4 .
      Opmerking: de tweedeAry antilichaam van de keuze voor deze configuratie is vermeld in de Tabel van Materialen ; Het heeft een emissie golflengte van 421 nm. Gebruik het met een bandpassfilter van 450/50 nm wanneer u op 405 nm opgewekt bent met de violette diode laser.
    2. Gebruik volumes volgens de volgende berekeningen (gebaseerd op het in de tabel van materialen verkrijgbare antilichaam): 2 μL per 5,0 x 106 cellen = 20 μL secundair antilichaam; Eindvolume = [(5,0 x 10 7 totale cellen) / 5,0 x 106 cellen] x 50 = 500 μl; 20 μl Abs + 480 μl PBS / 1% FBS = 500 μl.
  7. Houd de gelabelde cellen in PBS / 1% FBS. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer; Gebruik een definitieve retinale celconcentratie van 3,0 - 4,0 x 107 cellen / ml.
    Opmerking: Gebruik geen celcultuurmedium om de cellen te verdunnen, omdat het fenolrode de autofluorescentie kan verhogen, waardoor de resolutie tussen de negatIve en positieve cellen. De uiteindelijke celconcentratie per volume hangt sterk af van de volumestroom van de instrumentconfiguratie.
  8. Gebruik een-kleurcontroles tijdens het instellen om de fluorescentie te voorkomen.
    Opmerking: Deze stap, ook wel compensatie genoemd, wordt toegepast om het geluid dat is gecreëerd door de combinatie van fluoroforen te corrigeren. Polystyreenmicrobolletjes in PBS / 0,1% BSA / 2 mM NaN3 met de capaciteit om fluorescent gemerkte immunoglobuline (Ig) isotypen van meerdere soorten te binden, bieden positieve controles om de compensatie in te stellen.
    1. Plaats 3 druppels polystyreenmicrobolletjes in steriele FACS-buizen, waarbij één per fluorofoor wordt toegewezen. Voeg 1 μg van de respectieve fluorofoor aan elke buis toe. Incubeer gedurende 15 minuten bij RT, beschermd tegen licht. Voeg 3 ml PBS / 1% FBS toe aan de monsterbuizen. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 xg en RT. Verwijder het supernatant zorgvuldig en resuspendeer in 250 μl PBS / 1% FBS.
    2. Om de negatieve contr. Op te zettenOls, gebruik polystyreen microbolletjes die niet binden aan Ig. Voer deze stap de dag ervoor uit, indien nodig.

5. Cell Sortering Strategie

Opmerking: Specifieke instructies voor instrumentopstelling voor FACS met 355 nm, UV; 405 nm, violet; 488 nm, blauw; En 640 nm, rode lasers met respectievelijk 2, 2, 5 en 3 fluorescentie kanaalverdeling. De operating software was DIVA versie 8.0.1. Cellsortering werd uitgevoerd met een 70 μm spuitmond, 70 psi schede druk, 87,5 frequentie, 48,6 amplitude met eerste druppelafbreking bij 333, gapverdeling van 6, soort precisie ingesteld op vierwegzuiverheid met standaard (32) zuiverheidsmasker en druppel Vertraging aangepast aan 42,98 met behulp van kralen.

  1. Gebruik 15-ml conische buizen van polypropyleen als verzamelbak. Voeg 5 ml van het verzamelmedium (celcultuurmedium) toe aan elke buis en draai de buis om de muren te bekleden.
    Opmerking: deze stap voorkomt dat de cellen aan de zijkant van t vallenHij verzamelbuis. Als alternatief kan de buis worden bekleed met onverdunde FBS.
  2. Houd rekening met de efficiëntie van de cel sorteren om de uiteindelijke opbrengst van cellen te schatten.
    Opmerking: De efficiëntie van het soort is afhankelijk van de gebruikte flowcytometer. RGC's met het CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg fenotype omvatten ongeveer 1% van alle retinale cellen.
  3. Laat de celsortering uitvoeren door een opgeleide operator (meestal in een kernfaciliteit). Zorg ervoor dat het instrument voorafgaand aan de aankoop van het monster wordt gereinigd en gesteriliseerd met 70% ethanol. Veeg de buitenkant van de collectiebuisjes met 70% ethanol ook voorzichtig af.
  4. Als de cellen zijn opgelost of geaggregeerd, pipetteer de cellen omhoog en omlaag en filter de suspensie door een steriele 40-nm nylon zeef voorafgaand aan de overname. Zorg ervoor dat u de temperatuur controleert en het bij 4 ° C houdt terwijl de celsortering wordt uitgevoerd; Als u dit niet doet, zal de cel verminderenIk geef.
  5. Bespreek de details van het soort met de cel sorteringsoperator voorafgaand aan het uitvoeren van de experimenten.
    Opmerking: op het moment van het experiment heeft de cel sorteringsoperator een reeks knoppen geklikt van de werkbalk werkbalk van de acquisitie software voor de cytometer. Dit zijn de Browser- , Cytometer- , Inspector- , Worksheet- en Acquisition Dashboard . De strategie die hier gebruikt wordt, is bekend als een 2-weg sorteren. Er worden twee populaties verzameld: de verrijkte RGC's en alle andere celtypen. Als er extra populaties worden verzameld, kunnen maximaal twee extra populaties worden geïsoleerd als een 4-weg sorteren. Als er extra populaties worden verzameld, vereist de cel sorteren verschillende verzamelbuizen en opstelling.
  6. Compensatie uitvoeren om te corrigeren voor spectrale overlap van de fluorophoren.
    Opmerking: dit proces kan handmatig worden gedaan door aan te passenElke instelling, of het kan automatisch worden gedaan als onderdeel van de software die in gebruik is. De meeste software voor celsorteringsapparatuur heeft de mogelijkheid tot automatische compensatie. Het wordt beschouwd als de gouden standaard en het meest nauwkeurige type compensatie. Het negatieve (geen fluorofoor) monster en de enkele controles die zijn bereid met polysterenmikrobolletjes (Compensatiekralen) die specifiek zijn vervaardigd om alle relevante monoklonale antilichamen die in het experiment werden gebruikt, zullen in deze stap worden gebruikt.
    1. Selecteer Experiment> Compensatieinstellingen> Compensatiecontroles maken . Voeg de fluorofoor-specifieke controles toe van de lijst die op het scherm wordt weergegeven. Klik op OK .
      Opmerking: een compensatiebuis voor elk van de bedieningselementen wordt weergegeven.
      1. Gebruik een niet-gemarkeerde controle (geen fluorofoor, stap 4.2 ) om het voorgestrooide licht (FSC), het zijdestrooide licht (SSC) te controleren en de initiële populatie (P1) te verzekeren.
    2. Installeer de negatieve controlebuis op de cytometer en klik op Load. Controleer of de populatie van interesse wordt weergegeven en selecteer het. Dit is populatie 1 (P1). Klik met de rechtermuisknop op de P1-poort en kies Apply to All Compensation Controls . Klik op Record Data . Zodra de opname is gedaan, klik op Unload en verwijder de buis.
    3. Installeer de volgende buis op de cytometer, zoals weergegeven op het scherm. Herhaal stap 5.6.2 totdat alle gegevens van de bedieningselementen zijn opgenomen.
    4. Selecteer Experiment> Compensatieinstelling> Compensatie berekenen . Sla de setup op en noem het experiment. Klik op Koppeling en opslaan .
      Opmerking: Compensatie is een noodzakelijke stap, omdat het de overlapping van het spectrum tussen de detectors verwijdert.
    5. Als handmatige compensatie nodig is, doe dit door de middelen van de positieve signalen aan te passen, zodat ze de negatieven voor eac gelijkenH van de gebruikte fluorochromen.
      Opmerking: deze stap wordt gedaan door de cel sorteringsoperatie en kan 30 minuten duren.
  7. Gatingstrategie ( Figuur 3A ).
    1. Stel P1 op door FSC versus SSC te plotten; De FSC is indicatief voor de grootte en het SSC geeft de interne complexiteit van de cellen aan. Zie figuur 3A .
    2. Teken een pseudocolor plot van SSC-H (hoogte) versus SSC-W (breedte) met de geselecteerde populatie in stap 5.7.1 (P1); Het pseudocolor plot zorgt voor de visuele weergave van de dichtheid van cellen ten opzichte van elkaar.
      Opmerking: een lagere celdichtheid wordt weergegeven door blauw en groen, terwijl rode en oranje gebieden hoge celdichtheid vertegenwoordigen.
      1. Voer deze stap uit om alleen enkele cellen te verzamelen; De enkele celpoort heet P2. Zie figuur 3A .
    3. Herhaal stap 5.7.2 totPlot FSC-H versus FSC-W met P2. Zorg ervoor dat de selectie van enkele cellen als "doublets" of cell clumps zowel een positieve als een negatieve markering bevat, waardoor valse positiviteit wordt gegeven.
    4. Teken een pseudocolour plot van CD90.2 versus CD48. Selecteer alle CD90.2 + CD48 negcellen om monocyten uit de RGC-verrijking te elimineren; Bel deze poort CD90.2 + CD48 neg , of P3. Zie figuur 3A .
    5. Gebruik de geselecteerde CD90.2 + CD48 neg populatie of P3 poort, teken een pseudocolor plot van CD57 versus CD15 om amacriene celverontreinigingen uit de RGC verrijking te elimineren. Poort de CD15 neg CD57 neg populatie. Zie figuur 3A .
  8. Definieer de populaties die voor het monster moeten worden verzameld in het venster 'Sorteren layout' en ga verder met de celsortering; Het monster dat u verzamelt is CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg p>.
    Opmerking: de te sorteren populatie is geselecteerd in het vervolgkeuzemenu Toevoegen in het sorteervenster. Na het toevoegen van de populatie zal het vragen om doelgebeurtenissen of hoeveel gebeurtenissen moeten worden verzameld. Op elk gewenst moment kan de soort layout worden bewerkt door te klikken op het sorteerveld met de populatie. 0,9% ± 0,3 van RGC's met het fenotype CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg worden verkregen bij jonge (5-7 weken oud) en 0,5% ± 0,3 en oude (> 12 maanden oude) C57BL / 6J muizen 23 .
  9. Gebruik 25.000 cellen, voer een zuiverheidscontrole uit 23 . Zie figuur 3B -E.
    Opmerking: de zuiverheidscontrole is het proces om de gesorteerde cellen opnieuw te analyseren om de nauwkeurigheid van de celsoort te verifiëren. Een kleine aliquot van gesorteerde cellen zal op de cytometer geladen worden om de effectiviteit van het soort te verifiëren.
_title "> 6. Bevestiging op RGC Intracellulaire Markers

  1. Intracellulaire etikettering.
    1. Fixeer gesorteerde cellen gedurende 1 uur en permeabiliseer bij 4 ° C om de cellen metabolisch inactief te maken en de penetratie van intracellulaire antilichamen mogelijk te maken.
    2. Verdun de volgende antilichamen in de permeabiliseringsoplossing: anti-RNA bindend eiwit met meerdere splitsing (RBPMS) bij een verdunning van 1: 100 in een 100 μg / ml voorraad; Anti-synucleine gamma (SNCG), 1: 100 in een 1 mg / ml voorraad; Hersenspecifieke homeobox / POU domein eiwit 3A (BRN3A), 1: 100 in een 200 μg / ml voorraad; En anti-neuron-specifieke klasse III bèta tubuline (TUJ1), 1: 100 in een 1 mg / ml voorraad. Incubeer de cellen en antilichaamoplossingen gedurende 1 uur in een overdekte ijsemmer.
    3. Was de monsters tweemaal met PBS / 1% FBS.
    4. Resuspendeer de cellen in een geschikt AF488-getagd secundair antilichaam bij een 1: 200 verdunning gedurende 30 minuten in een ijsemmer.
    5. Was de monsters zoals in stap 6.1.3. Houd de cellen inPBS / 1% FBS (250 μL) tot klaar om te analyseren.

7. Validatie van de cel Sorteer op qPCR Analyse

Opmerking: zie figuur 4 .

  1. RNA-extractie 23 .
    1. Extracteer het RNA van 5,0 x 10 5 gesorteerd cellen door cellysis en homogenisatie gevolgd door de toevoeging van chloroform.
    2. Breng de bovenste kleurloze fase over naar een schone microtube voor alcoholafzetting, gevolgd door extractconcentratie in een spin kolom. Doe DNA-spijsvertering op de kolom.
    3. Was de kolom met RNase-vrij water voor RNA-elutie.
    4. Bepaal de RNA-concentratie door spectrofotometrie.
  2. CDNA synthese en pre-amplificatie.
    1. Gebruik 100 ng RNA materiaal en meng met een oplossing die reverse transcriptase enzym bevat, recombinante ribonuclease remmers (om RNA afbraak te voorkomen), magnesiumchloride (MgCL2) en deoxynucleotiden.
    2. Meng de buisinhoud en incubeer gedurende 10 minuten bij 25 ° C gevolgd door 60 minuten bij 42 ° C. Beëindig de reactie met een 5 minuten incubatie bij 85 ° C. Bewaar het resulterende cDNA bij -20 ° C tot klaar om te gebruiken.
      Opmerking: cDNA-materiaal kan maximaal een maand bij -20 ° C worden opgeslagen als de pre-amplificatie stap niet onmiddellijk kan worden uitgevoerd.
  3. Pre-amplificatie van cDNA.
    1. Pre-amplificeren cDNA materiaal met behulp van een reeks primers die specifiek zijn voor meerdere retinale cel typen, waaronder: retinale ganglioncellen, amacrine cellen, astrocyten, Müller, bipolaire, horizontale, fotoreceptoren en epitheelcellen van retinale pigmenten, zoals gedetailleerd in Referentie 23 en in de tabel Van materialen .
      Opmerking: De pre-amplificatiereactie is bereid om de gevoeligheid van detectie voor kwantificering te verhogen. De pre-amplificatiereactie bevat een mengsel van de primerMengt uit de tabel van materialen ; 2,5 μl cDNA, dat begon bij 100 ng RNA; Reverse transcriptase enzym; En nuclease-vrij water in een eindvolume van 10 μl.
    2. Voer de enzymactiveringsstap bij 95 ° C gedurende 10 minuten uit, gevolgd door 14 cycli bij 95 ° C gedurende 15 s, gevolgd door 60 ° C gedurende 4 minuten. Verdun het voorversterkte materiaal 1:10 in Tris EDTA-buffer en hou het bij -20 ° C tot het klaar is voor gebruik.
  4. 7.4 qPCR reactie.
    1. Bereid alle qPCR reacties op in een eindvolume van 10 μL met behulp van de verdunde, voorversterkte cDNA (2,5 μL), primers (vermeld in de Tabel van Materialen ), nuclease-vrij water en een concentraat met DNA-polymerase en deoxynucleotiden.
    2. Gebruik de volgende instrumentomstandigheden om de qPCR te laten draaien: een vasthoudstap van 50 ° C gedurende 2 minuten, gevolgd door 95 ° C gedurende 10 minuten. Loop in totaal 40 cycli bij 95 ° C gedurende 15 s gevolgd door 60 ° C gedurende 1 minuut. Voer alle maten uitEmenten in replicaten van drie.
    3. Bereken relatieve kwantificering met behulp van de vergelijkende drempel (C T ) na het bepalen van de waarden van C T voor het huishoudingsgen en de doelgenen in elk monster. Bereken de relatieve vouwverandering (R q ) aan de hand van de volgende vergelijking: R q = 2 T- AC , waar ΔC T = C T doelgenen - C T referentie gen 23 .
      Opmerking: De CT wordt gedefinieerd als de PCR cyclus waarbij het fluorescerende signaal van de reporter kleurstof een willekeurig geplaatste drempel 26 overschrijdt. De C T is omgekeerd gerelateerd aan de hoeveelheid amplicon (PCR-product) in de reactie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De diepgaande studie van RGC's wordt belemmerd door vele factoren, waaronder hun lage frequentie en het ontbreken van een robuuste en gestandaardiseerde methodologie voor hun isolatie. Figuur 1 toont de methodologie die wordt gebruikt voor retinae isolatie. Variaties in de enucleatieprocedure bestaan ​​op basis van het soort analyse, zoals als de enucleatie onderdeel uitmaakt van in vivo experimenten 27 . Enucleatie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

FACS is de gewenste techniek om celpopulaties te zuiveren. Andere isolatiemethoden omvatten immunopanning, magnetische kralen en complement-fixatie-uitputting. Het voordeel van FACS over deze andere methodologieën is gebaseerd op de gelijktijdige identificatie van celoppervlakmarkers met verschillende intensiteitsgraden. De fluorescerende intensiteit van het molecuul is evenredig aan de hoeveelheid eiwituitdrukking. Tot nu toe was de isolatie van RGCs uitsluitend gebaseerd op Thy1 (CD90) positiviteit en CD48 negativitei...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs willen de heer Tim Higgins, Senior Illustrator van de afdeling Microbiologie, Immunologie en Biochemie, bedanken voor technische video assistentie; Dr. Matthew W. Wilson voor discussies en de leden van de laboratoria Jablonski en Morales-Tirado voor hun nuttige opmerkingen. Dit werk werd ondersteund door de Alcon Research Institute Young Onderzoeker Award (VMM-T), de Universiteit van Tennessee Research Foundation (VMM-T), het National Eye Institute EY021200 (MMJ), de Gerwin Fellowship (VMM-T); De Gerwin Pre-doctoral Society (ZKG), het ministerie van Defensie Army Medical Research and Materiel Command (VMM-T) en de onbeperkte subsidie ​​van onderzoek om blindheid te voorkomen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-mouse CD15 PEBioLegend125606Clone MC-480
Anti-mouse CD48 PE-Cy7BioLegend103424Clone HM48-1
Anti-mouse CD57Sigma AldrichC6680-100TSTClone VC1.1
Anti-mouse CD90.2 AF700BioLegend105320Clone 30-H12
Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgGBioLegend405317Clone Poly4053
Purified Anti-mouse CD16/32BioLegend101302FcgRII/III block, Clone 93
Zombie Aqua BioLegend423102Live cell/ Dead cell discrimination
Fetal Bovine SerumHycloneSH30071.03U.S. origin
AbC Total Antibody Compensation Bead KitThermo Fisher ScientificA10497Multi-species Ig
Neurobasal MediumThermo Fisher Scientific21103049Add serum to media prior to culture.
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific10010049Saline solution
Dissection MicroscopeOlympusSZ-PT ModelStereo Microscope
Sorvall CentrifugeThermo ScientificST 16RAll centrifugation performed  at RT
Base Plate – Dissection PanFisher ScientificSB15233FIMA wax plate can also be used
ForcepsAesculap5002-74 ½ inches
Iris Scissors, StraightAesculap13605 ½ inches
Falcon 15 mL conical tubesFisher Scientific352097Polypropylene tubes
Falcon 50 mL conical tubesFisher Scientific352098Polypropylene tubes
BD FACS TubesFisher Scientific352003Polypropylene tubes
40 mm dishesMidSciTP93040Tissue culture treated
70 μm nylon strainerMidSci70ICSsterile
40 μm nylon strainerMidSci40ICSsterile
 BD 10 mL syringeFisher Scientific301604Disposable Syringe without needle
PestlesMidSciPESTsterile
Wheaton VialsFisher Scientific986734No Liner
BD 30 G needleFisher Scientific3051281 inch
Hausser Scientific Bright-Line Glass Counting ChamberFisher Scientific0267151BHemocytometer
Gibco Trypan blue 0.4% SolutionFisher Scientific15250061Viability Dye
Eppendorf tubesFisher Scientific05-402-251.5mL
EVOS Floid Cell ImagingThermo Fisher Scientific447113Fluorescence Imaging with a 20X objective
100% EthanolFisher Scientific04-355-452Used to make 70% Ethanol
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+Rainin17014282LTS Pipette
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+Rainin17014391LTS Pipette
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+Rainin17014392LTS Pipette
Rack LTS 1000 mL – GPS-L1000SRainin17005088Blue Rack Sterile Tips
Rack LTS 250 mL – GPS-L250SRainin17005092Green Rack Sterile Tips
Rack LTS 20 mL – GPS-L10SRainin17005090Red Rack Sterile Tips
FACSAria II Cell SorterBD BiosciencesN/ACustom order
LSR II CytometerBD BiosciencesN/ACustom order
Abca8aThermo Fisher ScientificMm00462440_m1Müller cells
Aldh1alThermo Fisher ScientificMm00657317_m1Müller cells
Aqp4Thermo Fisher ScientificMm00802131_m1Astrocytes
Calb2Thermo Fisher ScientificMm00801461_m1Amacrine, Horizontal
Cd68Thermo Fisher ScientificMm03047340_m1Retinal Pigment Epithelial Cells
Gad2Thermo Fisher ScientificMm00484623_m1Amacrine
HprtThermo Fisher ScientificMm01545399_m1House keeping gene
Lhx1Thermo Fisher ScientificMm01297482_m1Horizontal
Lim2Thermo Fisher ScientificMm00624623_m1Horizontal
NrlThermo Fisher ScientificMm00476550_m1Photoreceptors
Ntrk1Thermo Fisher ScientificMm01219406_m1Horizontal
Pcp4Thermo Fisher ScientificMm00500973_m1Bipolar, Amacrine
Pou4f1Thermo Fisher ScientificMm02343791_m1Retinal Ganglion Cells
Prdx6Thermo Fisher ScientificMm00725435_s1Astrocytes
PrkcaThermo Fisher ScientificMm00440858_m1Bipolar
Prox1Thermo Fisher ScientificMm00435969_m1Horizontal
PvalbThermo Fisher ScientificMm00443100_m1Amacrine
RbpmsThermo Fisher ScientificMm02343791_m1Retinal Ganglion Cells
Rom1Thermo Fisher ScientificMm004363

Referenties

  1. Flammer, J., Orgul, S. Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).
  2. Bathija, R. Optic nerve blood flow in glaucoma. Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).
  3. Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma. Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).
  4. Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye (Lond). 18 (11), 1089-1095 (2004).
  5. Tian, N., Hwang, T. N., Copenhagen, D. R. Analysis of excitatory and inhibitory spontaneous synaptic activity in mouse retinal ganglion cells. J Neurophysiol. 80 (3), 1327-1340 (1998).
  6. Schmidt, K. G., Bergert, H., Funk, R. H. Neurodegenerative diseases of the retina and potential for protection and recovery. Curr Neuropharmacol. 6 (2), 164-178 (2008).
  7. Dreher, B., Sefton, A. J., Ni, S. Y., Nisbett, G. The morphology, number, distribution and central projections of Class I retinal ganglion cells in albino and hooded rats. Brain Behav Evol. 26 (1), 10-48 (1985).
  8. Williams, R. W., Strom, R. C., Rice, D. S., Goldowitz, D. Genetic and environmental control of variation in retinal ganglion cell number in mice. J Neurosci. 16 (22), 7193-7205 (1996).
  9. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  10. Surgucheva, I., Weisman, A. D., Goldberg, J. L., Shnyra, A., Surguchov, A. Gamma-synuclein as a marker of retinal ganglion cells. Mol Vis. 14, 1540-1548 (2008).
  11. Nadal-Nicolas, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3860-3868 (2009).
  12. Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (2), 1052-1058 (2010).
  13. Van Bergen, N. J., et al. Recharacterization of the RGC-5 retinal ganglion cell line. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (9), 4267-4272 (2009).
  14. Wood, J. P., Chidlow, G., Tran, T., Crowston, J. G., Casson, R. J. A comparison of differentiation protocols for RGC-5 cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (7), 3774-3783 (2010).
  15. Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1 (9), 791-803 (1998).
  16. Hong, S., Iizuka, Y., Kim, C. Y., Seong, G. J. Isolation of primary mouse retinal ganglion cells using immunopanning-magnetic separation. Mol Vis. 18, 2922-2930 (2012).
  17. Julius, R. S. The sensitivity of exponentials and other curves to their parameters. Comput Biomed Res. 5 (5), 473-478 (1972).
  18. Reif, A. E., Allen, J. M. The Akr Thymic Antigen and Its Distribution in Leukemias and Nervous Tissues. J Exp Med. 120, 413-433 (1964).
  19. Watanabe, M., Noguchi, T., Tsukada, Y. Regional, cellular, and subcellular distribution of Thy-1 antigen in rat nervous tissues. Neurochem Res. 6 (5), 507-519 (1981).
  20. Haeryfar, S. M., Hoskin, D. W. Thy-1: more than a mouse pan-T cell marker. J Immunol. 173 (6), 3581-3588 (2004).
  21. Sahagun, G., Moore, S. A., Fabry, Z., Schelper, R. L., Hart, M. N. Purification of murine endothelial cell cultures by flow cytometry using fluorescein-labeled griffonia simplicifolia agglutinin. Am J Pathol. 134 (6), 1227-1232 (1989).
  22. Shoge, K., et al. Rat retinal ganglion cells culture enriched with the magnetic cell sorter. Neurosci Lett. 259 (2), 111-114 (1999).
  23. Chintalapudi, S. R., et al. Isolation and Molecular Profiling of Primary Mouse Retinal Ganglion Cells: Comparison of Phenotypes from Healthy and Glaucomatous Retinas. Front Aging Neurosci. 8, 93(2016).
  24. Nagdeve, N. G., Yaddanapudi, S., Pandav, S. S. The effect of different doses of ketamine on intraocular pressure in anesthetized children. J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 43 (4), 219-223 (2006).
  25. Ding, C., Wang, P., Tian, N. Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model. Exp Eye Res. 92 (6), 512-520 (2011).
  26. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  27. Aerts, J., Nys, J., Arckens, L. A highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening. J Vis Exp. (92), e51936(2014).
  28. Li, X., et al. Loss of AP-2delta reduces retinal ganglion cell numbers and axonal projections to the superior colliculus. Mol Brain. 9 (1), 62(2016).
  29. Moshiri, A., et al. Near complete loss of retinal ganglion cells in the math5/brn3b double knockout elicits severe reductions of other cell types during retinal development. Dev Biol. 316 (2), 214-227 (2008).
  30. Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12), 5151-5162 (2003).
  31. Jakobs, T. C., Ben, Y., Masland, R. H. CD15 immunoreactive amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 465 (3), 361-371 (2003).
  32. Uusitalo, M., Schlotzer-Schrehardt, U., Kivela, T. Ultrastructural localization of the HNK-1 carbohydrate epitope to glial and neuronal cells of the human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (3), 961-964 (2003).
  33. Jackson, C. J., Garbett, P. K., Nissen, B., Schrieber, L. Binding of human endothelium to Ulex europaeus I-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium. J Cell Sci. 96 ( Pt 2), 257-262 (1990).
  34. Pennartz, S., Perraut, M., Pfrieger, F. Purification of retinal ganglion cells from postnatal rats by magnetic cell sorting. MACSmore. 12 (2), 16-18 (2010).
  35. Nadal-Nicolas, F. M., et al. Displaced retinal ganglion cells in albino and pigmented rats. Front Neuroanat. 8, 99(2014).
  36. Nadal-Nicolas, F. M., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo-Barriuso, M. Two methods to trace retinal ganglion cells with fluorogold: from the intact optic nerve or by stereotactic injection into the optic tract. Exp Eye Res. 131, 12-19 (2015).
  37. Barnstable, C. J., Drager, U. C. Thy-1 antigen: a ganglion cell specific marker in rodent retina. Neuroscience. 11 (4), 847-855 (1984).
  38. Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. (16), (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Celisolatieprimaire muiscellencel sorterenimmunolabelingCD90.2-positiefCD48-negatiefcompensatiecontroleslevensvatbare celpopulatie
Isolatie van Primaire Murine Retinale Ganglioncellen (RGC's) door Flow Cytometry
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.