Method Article

Hypoxische preconditioning van merg-afgeleide progenitorcellen als bron voor de generatie van volwassen Schwann-cellen

DOI:

10.3791/55794

⸱

June 14th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Sciences, The University of Hong Kong, 2Department of Orthopaedics and Traumatology, The University of Hong Kong

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spiercellen (MSC's) met neurale potentieel bestaan ​​in het beenmerg. Ons protocol verrijkt deze populatie van cellen via hypoxische preconditioning en wijst hen vervolgens op om volwassen Schwann cellen te worden.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit manuscript beschrijft een middel om te verrijken voor neurale voorliefhebbers van de MSC-populatie en daarna te leiden naar het volwassen Schwann-cellot. Wij ondervonden ratten- en menselijke MSC's voor transiente hypoxische condities (1% zuurstof gedurende 16 uur), gevolgd door uitbreiding als neurospheren bij substratum met een lage bindingstijd, met supplementatie van de epidermale groeifactor (EGF) / basis fibroblastgroeifactor (bFGF). Neurospheren werden gepolijst op poly-D-lysine / laminine-beklede weefselkweekplastic en gekweekt in een gliogene cocktail die β-Heregulin, bFGF en bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF) bevat om Schwann-celachtige cellen te genereren (SCLC's). SCLC's werden gedurende 2 weken door middel van cocultuur door middel van cocultuur geregeld met gezuiverde Dorsal root Ganglia (DRG) neuronen verkregen uit E14-15 zwangere Sprague Dawley ratten. Volwassen Schwann cellen tonen aanhoudendheid in S100p / p75 expressie en kunnen myeline segmenten vormen. Cellen die op deze manier zijn gegenereerd hebben potentieel aPplicaties bij autologe celtransplantatie na ruggenmergletsel, evenals bij ziekte-modellering.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De transplantatie van neurale progenitoren en hun derivaten toont belofte als een behandelingsstrategie na traumatische zenuwletsel 1 , 2 en neurodegeneratie 3 , 4 . Voorafgaand aan de klinische toepassing is het essentieel om te verzekeren: i) een methode om toegang te krijgen tot en uit te breiden op een autologe bron van stam- / stamcellen en ii) een middel om hen naar relevante volwassen cellen te brengen 3 . Onze interesse in celtherapie voor ruggenmergbesering heeft ons geleid tot het zoeken naar een robuuste, autologe ce....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures met betrekking tot dieren werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals en goedgekeurd door het Comité voor het gebruik van levende dieren voor onderwijs en onderzoek, Li Ka Shing Faculteit Geneeskunde, Universiteit van Hong Kong. Menselijke beenmergmonsters werden verkregen uit de iliac crest van gezonde donors na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming. Protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Review Board, De Universiteit van Hong Kong.

1. Bereiding van Rat MSC Cultures

  1. Oogst van MSC's van de femur
    1. Autoclaaf ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een overzicht van de belangrijkste fasen in ons protocol is geïllustreerd in figuur 1 . Samenvattend worden rat- en menselijke MSC's geselecteerd door aanhechting aan weefselkweekplastic. Uitgebreide MSC's zijn voorgeschreven met hypoxie en zijn dan onderworpen aan neurosfeervormende condities. Neurospheren zijn geplateerd en mogen onderscheiden in SCLC's. SCLC's worden gecultiveerd met gezuiverde DRG-neuronen om schaduwcellen te genereren. <.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het is essentieel om de "stevigheid" van MSC's te behouden voorafgaand aan de verrijking van neurale voorvaders via hypoxische preconditioning en neurosfeercultuur. Uit onze ervaring kunnen multipotente MSC's betrouwbaar worden geïdentificeerd door hun langwerpige fibroblastachtige morfologie. In tegenstelling hiermee, MSCs die een meer platgemaakte, vierhoekige morfologie, met prominente cytoskeletale stressvezels hebben aangenomen, nemen niet gemakkelijk neurale celpartijen vast en dienen weggegooid .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs van dit manuscript hebben geen onthullingen om te verklaren.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs zouden graag Dr. Nai-Sum Wong willen erkennen voor het leveren van de hypoxie kamerapparatuur en mevrouw Alice Lui voor de technische ondersteuning.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
αMEMSigmaaldrichM4526
DMEM/F12Thermofisher scientific12400-024
Neurobasal mediumThermofisher scientific21103-049
FBSBioseraFB-1280/500
B27Thermofisher scientific17504-001
Epidermal growth factor (EGF)Thermofisher scientificPHG0313
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Peprotech100-18B/100UG
Nerve growth factor (NGF) MilliporeNC011
Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA)Peprotech100-13A
Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her)Millipore01-201
UridineSigmaaldrichU3003
5-Fluro-2' - deoxyuridine (FDU)SigmaaldrichF0503
Poly-D-lysine (PDL)SigmaaldrichP7886-1G
LamininThermofisher scientific23017015
GlutaMAXThermofisher scientific35050061
Penicillin / streptomycin (P/S)Thermofisher Scientific15140-122
TrypLE ExpressThermofisher Scientific12604-013
10 cm plate for adherent cultureTPP93100Used for selection of MSCs by tissue culture adherence
6-well plate for adherent cultureTPP92006Used for expansion of MSCs following passaging
UltraLow 6-well plate for non-adherent cultureCorning3471Used for neural progenitor enrichment
anti-human CD90(Thy-1)BD Biosciences555593
anti-human CD73BD Biosciences550256
anti-human/rat STRO-1R&D SystemsMAB1038
anti-human nestinR&D SystemsMAB1259
anti-human CD45BD Biosciences555480
anti-rat CD90(Thy-1)BD Biosciences554895
anti-rat CD73BD Biosciences551123
anti-rat nestinBD BiosciencesMAB1259
anti-rat CD45BD Biosciences554875
Anti-S100βDakoZ031101
Anti-p75MilliporeMAB5386
Anti-GFAPSigmaaldrichG3893
Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1)CovanceMMS-435P
Anti-Human nucleiMilliporeMAB1281
Hypoxia chamberBillups-RothenbergMIC-101
HEPES bufferSigmaaldrichH4034-100G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wiliams, R. R., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury? Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).
  2. Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hypoxic PreconditioningMarrow Stromal CellsNeural ProgenitorsSchwann Cell DifferentiationNeurosphere CultureDorsal Root GangliaCo culture TechniqueGlial Induction MediumS100 Beta ExpressionMyelin Segment Formation

Related Articles