Monitoring ER / SR Calciumvrijstelling met de gerichte Ca 2+ Sensor CatchER +

Samenvatting

Wij presenteren protocollen voor de toepassing van onze genetisch gecodeerde calciumindicator (GECI) CatchER ⁺ voor het monitoren van snelle calcium transiënten in het endoplasmatische / sarcoplasmatische reticulum (ER / SR) van HEK293 en skeletspier C2C12 cellen met behulp van real-time fluorescentiemicroscopie. Een protocol voor de in-situ K _d meting en kalibratie wordt ook besproken.

Samenvatting

Intracellulaire calcium (Ca ²⁺ ) transiënten die door extracellulaire stimuli worden opgewekt, beginnen een groot aantal biologische processen in levende organismen. In het centrum van intracellulaire calciumvrijstelling zijn de belangrijkste intracellulaire calciumopslagorganellen, het endoplasmatische reticulum (ER) en het meer gespecialiseerde sarcoplasmatische reticulum (SR) in spiercellen. De dynamische afgifte van calcium uit deze organellen wordt gemedieerd door de ryanodine-receptor (RyR) en de inositol 1,4,5-trifosfaatreceptor (IP ₃ R) met hervulling die plaatsvindt via de sarco / endoplasmatische reticulum calcium ATPase (SERCA) pomp. Een genetische gecodeerde calciumsensor (GECI) genaamd CatchER werd gecreëerd om de snelle calciumvrijstelling van de ER / SR te controleren. Hier zijn de gedetailleerde protocollen voor de transfectie en expressie van de verbeterde, ER / SR-gerichte GECI CatchER ⁺ in HEK293- en C2C12-cellen en zijn toepassing bij het monitoren van IP ₃ R, RyR en SERCA pompgemedieerde calcium transientS in HEK293 cellen met behulp van fluorescentiemicroscopie wordt geschetst. De gekozen receptor-agonist of -remmer wordt in de kameroplossing gedispergeerd en de intensiteitsveranderingen worden in real time opgenomen. Met deze methode wordt een vermindering van ER-calcium gezien met RyR-activering met 4-chlor-m-cresol (4 cmc), de indirecte activatie van IP ₃ R met adenosintrifosfaat (ATP) en remming van de SERCA-pomp met cyclopiazonzuur Zuur (CPA). We bespreken ook protocollen om de in situ K _d en kwantificerende basale [Ca ²⁺ ] in C2C12 cellen te bepalen. Samenvattend kunnen deze protocollen, gebruikt in combinatie met CatchER ⁺ , receptor-gemedieerde calciumvrijstelling van het ER ontlokken bij toekomstige toepassing bij het bestuderen van ER / SR-calcium gerelateerde pathologieën.

Inleiding

De spatio-temporale eigenschappen van intracellulaire calcium (Ca ²⁺ ) transiënten activeren verschillende biologische functies ¹ . Deze Ca ²⁺ signalerende gebeurtenissen worden extracellulaire door middel van verschillende stimuli geactiveerd en intracellulair geregeld door de grote Ca ²⁺ opslagorganelle en door talrijke Ca ²⁺ pompen, kanalen en Ca ²⁺ bindende eiwitten. Ca ²⁺ transiënten kunnen significant worden veranderd als gevolg van defecten met signaalmodulatie, die leiden tot verschillende ziekten ² . Vanwege de snelheid en ingewikkeldheid van het Ca ²⁺ signaleringssysteem, met het endo- (ER) en sarcoplasmatische reticulum (SR) in het centrum, zijn genetisch gecodeerde Ca ²⁺ -probes die zijn geoptimaliseerd voor zoogdieruitdrukking met snelle kinetiek nodig Global en lokale Ca ²⁺ veranderingen in verschillende cellen waarnemen ³ .

De ER en de SR, Zijn tegenhanger in spiercellen, zijn de belangrijkste intracellulaire Ca ²⁺ opslagorganellen en fungeren als Ca ²⁺ wastafels die helpen om het Ca ²⁺ -signaal ^{4 te} versterken. De ER / SR is een integraal onderdeel in Ca ²⁺ signalering met dubbele rollen als een zender en ontvanger van signalen ⁵ . De ryanodine-receptor (RyR) en de inositol-1,4,5-trifosfaatreceptor (IP 3R) zijn Ca ²⁺ -vrijgegeven receptoren die zich bevinden op de membranen van de ER / SR die gereguleerd worden door Ca ^{2+ 6} . Andere agenten stimuleren de functie van deze receptoren direct of indirect. 4-chloor-m-cresol (4-cmc) is een krachtige agonist van het RyR, met een 10-voudige hogere gevoeligheid dan cafeïne voor het induceren van SR Ca ²⁺ vrijlating, waarbij beide regelmatig worden gebruikt om RyR-gemedieerde Ca ²⁺ -vrijgave te bestuderen in Gezonde en zieke cellen ⁷ . ATP verhoogt IP _3- gemedieerde Ca ²⁺ reHuur via het IP ₃ R ⁸ . ATP bindt aan de purinergere receptor P2YR, een G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR), waardoor de productie van IP _{3 wordt} geactiveerd die bindt aan de IP ₃ R om Ca ²⁺ van de ER ^{9 , 10} te laten vrijkomen. De pomp ATPase (SERCA) van de sarco-endoplasmatische reticulum-calcium ATPase is een P-type ATPase-pomp, ook op het ER / SR-membraan dat cytosolische Ca ²⁺ vermindert en de ER / SR refillert door de ion actief in de ER / SR lumen te pompen ¹¹ . Specifieke remmers van de SERCA-pomp omvatten thapsigargine, van Thapsia garganica , en cyclopiazonzuur (CPA), van Aspergillus en Penicillium . CPA heeft een lage affiniteit voor de pomp en reversibel blokkeert het Ca ²⁺ toegangspunt ¹² . Thapsigargin bindt daarentegen onherstelbaar aan de Ca ²⁺ vrije pomp bij residu F256 in de M3-helix met nanomolAr affiniteit ¹¹ . Het analyseren en kwantificeren van de veranderingen die betrokken zijn bij Ca ²⁺ gestimuleerde gebeurtenissen is en blijft een uitdaging. Aangezien de ER / SR het belangrijkste subcellulaire Ca ²⁺ bevattende compartiment is met een centrale functie bij de voortplanting van het Ca ²⁺ signaal, is veel werk gericht op het begrijpen van ER / SR Ca ²⁺ signalering ⁵ .

De creatie van synthetische Ca ²⁺ kleurstoffen hielp het veld en de praktijk van Ca ²⁺ beeldvorming. Hoewel kleurstoffen, zoals Mag-Fura-2, veel gebruikt zijn om gecompartementaliseerde Ca ²⁺ in verschillende cellen te meten, hebben ze ^{13 , 14 , 15} beperkingen zoals oneven kleurstofbelasting, fotobladen en het onvermogen om zich te richten op specifieke organellen . De ontdekking van het groene fluorescerende eiwit (GFP) en de bevordering van fluorescerende eiwit-Gebaseerde Ca ²⁺ probes heeft het veld van Ca ²⁺ beeldvorming naar voren gebracht ¹⁶ . Enkele van de bestaande GECI's zijn Förster resonantie energie-overdracht (FRET) paren die geel fluorescerend eiwit (YFP), cyaan fluorescerend eiwit (CFP), calmodulin en het M13 bindende peptide ^{17 , 18 omvatten} . Troponine C-gebaseerde GECI's zijn ook beschikbaar als FRET-paren CFP en Citrine en als enkele fluorofore probes ^{19 , 20 , 21} . Anderen, zoals GCaMP2 en R-GECO, zijn enkele fluorofoor sensoren die Calmodulin ^{22 , 23} betreffen. Om de beperkingen van de smalle afstemming van Kd's en coöperatieve binding te elimineren die geassocieerd zijn met meerdere Ca2 ⁺ bindingsplaatsen die in hun Ca2 ⁺ bindende domeinen ^{24 gevonden worden} , een nieuwe klasse van calcium senSors werd gecreëerd door een Ca ²⁺ bindingsplaats op het oppervlak van het bèta vat op te stellen in een chromofore gevoelige locatie van verbeterd groen fluorescerend eiwit (EGFP) ^{25 , 26} . Deze zeer voorspelde sensor, genaamd CatchER, heeft een Kd van ~ 0,18 mM, ak dichtbij de diffusielimiet en ak van 700 s ^-1 . CatchER is gebruikt om receptor-gemedieerde ER / SR calcium vrijgave in verschillende zoogdiercellijnen zoals HeLa, HEK293 en C2C12 ^{25 te} controleren. Door zijn snelle kinetiek werd CatchER gebruikt in flexor digitorum brevis (FDB) spiervezels van jonge en oude Friend Virus B NIH Jackson (FVB) muizen om te onthullen dat meer Ca ²⁺ in de SR achterblijft na 2 s depolarisatie in de FDB Vezels van oude muizen vergeleken met die van jonge muizen ²⁷ . Om zijn lage fluorescentie bij 37 ° C te overwinnen, die haar toepassingen bij het calciumbeelden van zoogdier verhindertCellen hebben we een verbeterde versie van CatchER ontwikkeld, genaamd CatchER ⁺ . CatchER ⁺ vertonen verbeterde fluorescentie bij 37 ° C voor betere toepassing in zoogdiercellen. Aanvullende mutaties werden opgenomen in CatchER om de thermostabiliteit en fluorescentie bij 37 ° C ^{28 , 29} te verbeteren om CatchER ⁺ te creëren. CatchER ⁺ vertoont een zesvoudige toename van de signaal-ruisverhouding (SNR) over CatchER ³⁰ .

Hier worden de protocollen voor de cultuur en transfectie van HEK293- en C2C12-cellen met CatchER ⁺ en de toepassing ervan voor het monitoren van ER / SR-receptor-gemedieerde calciumtransiënten weergegeven. Representatieve resultaten worden getoond voor CatchER ⁺ uitgedrukt in HEK293 cellen behandeld met 4 cmc, CPA en ATP. We bieden ook een protocol voor de bepaling van de in situ K _d van CatchER ⁺ in C2C12 myoblastcellen en quaNtificatie van basale [Ca ²⁺ ].

Protocol

1. Slide Voorbereiding

1. Plaats 22 mm x 40 mm glasmicroscoopschuiven in 6 cm celcultuurschotels, 1 glijbaan per schotel.
2. Laat elke zijde van elke dia en de 6 cm gerecht aan ultraviolet (UV) licht gedurende 15-20 minuten blootstellen aan steriliseren in een steriele kap.
3. Bedek de afwas met glijbanen binnenkant met parafilm en berg bij 4 ° C tot gebruiksklaar.

2. Bereiding van media, buffers, oplossingen en reagentia

1. Bereid 1 liter van Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) in gedeïoniseerd water en voeg 10 mM HEPES, 5 mM NaHCO3 en 1 mM EGTA toe. Pas bij pH 7,2-7,3 met NaOH aan. Filterbuffer met een 0,22 μm filter in een geautoclaveerde fles.
2. Bereid 900 ml hoge glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) h in gedeïoniseerd water. Voeg 44 mM NaHCO3 toe en pas de pH aan op 7,2-7,3 met HC1. Filter media met een 0,22 μm filter in een geautoclaveerde fles. Voeg 100 ml foetale boeren toeNe serum (FBS) naar de media om de FBS-concentratie 10% te maken. Bewaren bij 4 ° C.
3. Bereid 1 liter intracellulaire buffer (125 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM CaCl2, 0,5 mM EGTA, 0,2 mM MgCl2) in gedeïoniseerd water en stel de pH op op 7,25. De laatste [Ca2 ⁺ ] zal ~ 100 nM zijn. Voeg voor gebruik 0,5 mM ATP toe. Bewaar op kamertemperatuur.
4. Bereid 1 L van Ringer's buffer (121 mM NaCl, 2,4 mM K2 HPO4, 0,4 mM KH2P04, 10 mM HEPES en 1,2 mM MgCl2) in gedeïoniseerd water en stel de pH op op 7.2. Bewaar op kamertemperatuur. Om te gebruiken, doseer 50 ml in een 50 ml buis en voeg 1,8 mM Ca ²⁺ en 10 mM glucose toe.
5. Bereid 1 liter KCl-spoeloplossing (125 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM MgCl2) in gedeïoniseerd water en stel de pH aan op 7,25.
6. Oplos 5 mg ionomycine in 1 ml dimethylsulfoxide (DMSO). Aliquot 30 μL in microtubes en opslaan bij -206; C.
7. Bereid de cyclopiazonzuur (CPA) voorraad op door CPA in DMSO op te lossen. Zorg ervoor dat het uiteindelijke percentage DMSO ≤ 1% is voor de CPA die aan de cellen wordt toegevoegd om apoptose te voorkomen. Bereid 20 mM 4-chloor-m-cresol (4 cm) door op te lossen in gefilterde H20 en laat het oplossen overnacht door schudden bij 37 ° C. Bereid de ATP-voorraad op door in gefiltreerde H20 tot 100 mM op te lossen.
8. Om de in situ Kd te bepalen, bereiden 15 ml elk van 1 mM EGTA, 0,2 mM, 0,6 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM en 100 mM Ca ²⁺ in KCl-buffer met een 100 MM EGTA voorraad en een 1 M CaCl2 voorraad opgelost in gedeïoniseerd water.

3. Celcultuur

1. Cultuur C2C12 myoblast- en HEK293-cellen volgens ATCC-protocollen voor elk met behulp van 10 cm celcultuurschotels in een steriele UV-kap.
   OPMERKING: C2C12 cellen mogen niet hoger worden dan 70% samenvloeiing, aangezien de myoblasten zullen beginnen differentiërenTe in myotubes. Zowel HEK293 als C2C12 cellen groeien gemakkelijk en mogen niet meer dan 100% confluentie groeien om de celintegriteit te behouden. Daarnaast mogen cellen niet meer dan 10 keer worden doorgegeven voordat ze gebruikt worden voor een experiment om de gezondheid van de cellen te behouden.

4. Transfectie van HEK293 cellen

1. Zaad HEK293 cellen op gesteriliseerde 22 mm x 40 mm glasmicroscoopschuiven in 6 cm gerechten zodat ze ~ 70% samenvloeien op de dag van transfectie.
2. Volg de volgende dag het protocol van de fabrikant voor het transfectie-reagens om cellen te transfecteren met behulp van 2 μg CatchER ⁺ cDNA en een 1: 3 (gewicht / volume) DNA-transfectie-reagensverhouding in het gereduceerde serummedium ( bijv. Opti-MEM).
3. Leg de DMEM media uit het gerecht en voeg 3 ml gereduceerde serummedia toe. Voeg DNA: transfectie-reagensmengsel aan de schotel toe en incubeer gedurende 4-6 uur bij 37 ° C.
4. Na incubatie wassen de cellen met 5-6 ml HBSS. Verwijder de HBSS fRoer de schotel en vervang met 3 ml frisse DMEM en incubeer ze gedurende 48 uur bij 37 ° C om expressie van de GECI toe te staan.
5. Transfectie van C2C12 myoblastcellen
   1. Voor C2C12 myoblastcellen, trypsineer cellen door voldoende trypsine toe te voegen om de bodem van de schotel (1-2 ml) te bedekken. Plaats de schotel in een 37 ° C incubator gedurende 2-6 minuten, zodat de trypsine de cellen van de bodem van de schotel loslaat.
   2. Zodra de incubatie is voltooid, verwijder de trypsine en aspireer de cellen in 8 ml DMEM. Pipetteer de cellen grondig met de DMEM om de cellen te gelijkmatig verspreiden en opnieuw op te schorten en zaad ze op steriele deklagen in 6 cm celcultuurschalen die 3 ml DMEM bevatten, zodat de uiteindelijke samenloop 60% is.
   3. Transfecteer de cellen op dezelfde dag als beschreven in stap 4.2-4.3. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C.
   4. Herhaal stap 4.4.

5. Bereiding van Slide en Fluorescentie Microscoop

1. Schakel m aanMicroscoop en lichtbron, open dan het Simple PCI-programma. Laat de microscoop gedurende 15-20 minuten opwarmen of tot de CCD-camera op -65 ° C koelt. Bereid de kamer en doei met cellen terwijl u wacht.
2. Bedek de bodem van de lage profiel open diamantbadafbeeldingskamer met een dunne laag afdichtmiddel, met een katoenen doek.
3. Neem de dia met getransfecteerde cellen uit de incubator en schud driemaal met 1 ml Ringer's buffer met 10 mM glucose en 1,8 mM Ca ²⁺ voorverwarmd tot 37 ° C.
4. Laat 1 ml Ringer's buffer in de schotel, om te voorkomen dat cellen drogen, en gebruik een tang om de glijbaan uit de schotel te nemen. Laat de overmaat oplossing op een laboratoriumweefsel opnemen door de rand van de dia aan een laboratoriumweefsel aan te raken. Plaats vervolgens op de kant van de kamer die het vet bevat met cellen naar boven gericht naar vet en bevestig de kamer op de podiumbevestiging met een schroevendraaier.
5. Voeg 1 toeML Ringer's buffer naar de kamer om te voorkomen dat cellen drogen terwijl de kamer op het podium wordt geplaatst en de rest van de microscoopopstelling voltooit. Zodra de vacuümzuigerslang aan de kamer is bevestigd, is het eindvolume dat de kamer bevat ~ 450 μL.
6. Schakel de microscoopdoelstelling in op de 40X-oliedempingsdoelstelling.
7. Gebruik lenspapier en lensreinigingsoplossing om het doel te reinigen en te drogen. Wrijf niet de doelstelling. Druppel zachtjes tot het oppervlak schoon is.
8. Voeg een druppel van de dompelolie toe aan het doel.
9. Plaats de berg op de microscoopfase en voeg de vacuümtip toe aan de kamer. Zodra de vacuümzuigerslang aan de kamer is bevestigd en ingeschakeld is, is het eindvolume dat de kamer bevat ~ 450 μL. Dit laatste volume is vlak bij de zijkanten van de kamer. Het is absoluut noodzakelijk dat de kameroplossing tijdens het experiment gelijk is om te voorkomen dat de oplossing in de doelstelling komt doordat het overvol is.
10. Verhoog het doel en gebruik de grove aanpassing tot de olie op het objectief de bodem van de dia raakt.
11. Gebruik de heldere veldmodus, stel de winst aan op 175 en de belichtingstijd naar 0,03 s om de cellen te concentreren.
12. Zodra cellen gefocust zijn, schakel over naar de fluorescentiemodus met behulp van 488 nm excitatie. Verander de belichtingstijd naar 0,07 s. Zoek een zichtveld dat voldoende cellen heeft die gezond zijn met voldoende fluorescentie op het beeld.
13. Zodra een selectieveld gekozen is, neem foto's in de fluorescentie en de heldere veldmodus.
14. Omcirkel een regio van belang (ROI) in de cellen of om de hele cel om de intensiteit van het gekozen gebied op te nemen.

6. Imaging Drug-geïnduceerde Ca ²⁺ Transiënten en In Situ K _d Kalibratie

1. Start intensiteitsmeting met frame rate ingesteld op 1 om de 5 s.
2. Laat de basisintensiteit stabiliseren voor 20-30 frames (100-150 s). Indien nodig, verlaag de frAmes / s tijdens deze stap om photobleaching te voorkomen.
3. Bereken de hoeveelheid 4 cmc die nodig is van een 20 mM voorraad op basis van het eindkamer volume van ~ 450 μl om een ​​uiteindelijke concentratie van 200 μM te maken. Maak indien nodig verdunningen van de voorraad.
4. Neem 60 μL Ringer's buffer voorzichtig uit de kamer en plaats in een microcentrifugebuis. Verdun de berekende hoeveelheid van 4 cmc met deze oplossing en voeg terug in de kamer om de beoogde reactie op te roepen van de cellen die worden afgebeeld.
5. Voeg de berekende hoeveelheid van 4 cmc toe aan de microcentrifugebuis en meng door pipettering.
6. Voeg de oplossing voorzichtig toe op het zichtveld, terwijl u de gebeurtenismerker in de intensiteitsmeting tegelijkertijd toevoegt.
7. Laat de tijd toe om het geneesmiddel te binden aan de receptor en de daaropvolgende signaalvermindering, dan wassen met 3-6 ml Ringer's buffer met 1,8 mM Ca ²⁺ en 10 mM glucose terwijl tegelijkertijd de gebeurtenismerker wordt toegevoegd. Aangezien het kamervolume 450 &# 181; L en is verbonden met een vacuüm, waarbij 3-6 ml buffer wordt toegevoegd, zorgt ervoor dat de voormalige oplossing die het geneesmiddel bevat, weggewassen is en met de nieuw toegevoegde oplossing is vervangen.
8. Herhaal 6.1-6.7 voor 100 μM ATP en 15 μM CPA, met behulp van een nieuwe dia van getransfecteerde cellen voor elke test.
9. Zodra de meting is voltooid, beëindig de dataverzameling in het intensiteitsmetingsvenster in het Simple PCI-programma.
10. Neem fluorescentie en brightfieldbeelden van de cellen.
11. Open het gegevensbestand voor het experiment. Hercirculeer de cellen of regio's van belang om de intensiteitswaarden opnieuw te berekenen, indien nodig.
12. Om de in situ K _d in C2C12 myoblastcellen te bepalen, volg het protocol zoals omschreven in sectie 4.2 en sectie 5 en zet 1 ml 0 mM Ca ²⁺ Ringer's buffer in de kamer.
    1. Permeabiliseer de cellen gedurende 15-30 s met 0,002-0,005% saponine in intracellulaire buffer om de cellen van elkeCatchER ⁺ die in de cytosol mag zijn. Was de cellen met 3-6 ml 1 ml EGTA in KCl buffer met 10 μM ionomycine. Laat de intensiteit afnemen tot een plateau is bereikt.
    2. Spoel met 3-6 ml KCl buffer met 10 μM ionomycine en laat de intensiteit stabiliseren en voeg vervolgens elke Ca ²⁺ oplossing die gedetailleerd is in stap 2.7. Laat de intensiteit tussen elke toevoeging een plateau bereiken.
13. Om de sensor te kalibreren voor basale [Ca ²⁺ ] kwantificering, volg stap 6.12. Gebruik de EGTA en de 100 mM Ca ²⁺ buffer van stap 2.7 om de minimale en maximale fluorescentie-intensiteit te verkrijgen.

7. Data Processing

1. Download het spreadsheetbestand van de intensiteitsmetingsgegevens.
2. Normaliseer de gegevens voor elke cel naar de basisintensiteit (F / F ₀ ). Bepaal de genormaliseerde data versus de tijd in een grafisch programma.
3. Om de% verandering te berekenen, trek je de genormaliseerde piekval afUe van 1 en vermenigvuldigen met 100. Bereken de gemiddelde en standaardafwijking als meerdere cellen werden afgebeeld.
4. Om de signaal-ruisverhouding te berekenen, opent SNR het beeldbestand dat is opgeslagen uit het experiment in een beeldverwerkingssoftware, zoals ImageJ, en meet het signaal, getransfecteerde cellen en geluid, achtergrond. Bereken de SNR met behulp van de vergelijking SNR = signaal / geluid.
5. Om de in situ Kd van de verzamelde fluorescentiebeeldingsgegevens te berekenen, gemiddelde de intensiteitsgegevens, die de plateaus omvatten, na de toevoeging van elke Ca ²⁺ -concentratie en EGTA (0 mM Ca ²⁺ ). Bereken de fractieverzadiging (relatieve intensiteit) met θ = (F - F _min ) / (F _max - F _min ), waarbij θ de relatieve intensiteit is, F de fluorescentie op elk moment is, F _min de minimale fluorescentieintensiteit is en F _max is de maximale fluorescentie-intensiteit, om de verandering in de intensiteit van t te zienHij probeert met de toevoeging van Ca ²⁺ in vergelijking met de minimumintensiteit. Bepaal de relatieve intensiteitsgegevens tegen de [Ca ²⁺ ] in elk grafisch en curve montageprogramma. Gebruik de 1: 1 bindingsvergelijking θ = [M _T ] / (K _d + [M _T ]) vertaald voor elk grafisch en curve fitting programma om de K _d te berekenen. M _T is de totale metaalconcentratie.
6. Om het basale calcium te kwantificeren uit de in 6.13 beschreven kalibratie, gemiddelde de intensiteitsgegevens, die de plateaus omvatten, na de toevoeging van 1 mM EGTA (F _min ) en 100 mM Ca ²⁺ (Fmax). Gebruik de kalibratievergelijking [Ca ²⁺ ] = K _d ([F - F _min ) / (F _max - F)] om het basale calcium te berekenen.

Resultaten

Dit gedeelte zal de resultaten illustreren die zijn bereikt met behulp van de eerder beschreven methodes met behulp van de geoptimaliseerde ER / SR-gerichte GECI CatchER ⁺ om veranderingen in ER / SR Ca ²⁺ te monitoren via verschillende receptor gemedieerde pathways.

Figuur 1 illustreert ER leeglopen door de RyR gestimuleerd met 200 μM 4 cmc. 4 cmc is een agonist van de RyR. ...

Discussie

Live single-cell imaging van fluorescerende probes, zoals CatchER ⁺ , is een effectieve techniek om ingewikkelde ER / SR Ca ²⁺ signalering processen in elke cel te analyseren in reactie op receptor agonisten of antagonisten. Deze techniek is ook bruikbaar voor imaging met meerdere golflengten tegelijkertijd, zoals nodig voor Fura-2 of image CatchER ⁺ en Rhod-2 samen om respectievelijk respectievelijk ER en cytosolische calciumveranderingen te controleren. Er zijn verschillende kritische ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
4-Chloro-3-methylfenol (4-CmC)	Sigma-Aldrich	C55402
515DCXR dichroic spiegel	Chroma Technology Corp.	NC338059
Adenosine 5′-trifosfaat dinatriumzout hydraat	Sigma-Aldrich	A26209
Calciumchloride dihydraat	EMD Millipore	102382
Corning weefselkweek gereedschap behandelde kweekschalen (100 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430167
Corning weefselkweek gereedschap behandelde kweekschalen (60 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430166
Cyclopiazonic Zuur (CPA)	EMD Millipore	239805
D(+)-Glucose	ACROS Organics	41095-0010
Dow Corning 111 Ventiel Smeermiddel & Sealer	Warner Instruments	64-0275
Dulbecco’s Gemodificeerd Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D7777
Ethylenebis(oxyethyleennitrilo) tetraazijnzuur (EGTA)	ACROS Organics	409911000
Fetaal bovien serum (FBS)	ThermoFisher	26140087
Fisherbrand Dekglasjes 22x40 mm	Fisher Scientific	12-544B
Hanks’ Balanced Salts (HBSS)	Sigma-Aldrich	H4891
HEPES, Vrije Zuur, Moleculaire Biologie Grad	EMD Millipore	391340
Dompelolie zonder autofluorescentie	Leica	11513859
Ionomycin, Vrij Zuur	Fisher Scientific	50-230-5804
Leica DM6100B omgekeerde microscoop met een gekoelde EM-CCD camera	Hamamatsu	C9100-13
Lipofectamine 2000 Transfectie Reagens	ThermoFisher	11668019
Lipofectamine 3000 Transfectie Reagens	ThermoFisher	L3000015
Low Profile Open Diamond Bath Imaging Kamer	Warner Instruments	RC-26GLP
Magnesiumchloride Hexahydraat	Fisher Scientific	M33-500
Opti-MEM	ThermoFisher	51985034
Kaliumchloride	EMD Millipore	PX1405
Kaliumfosfaat, Dibasic	EMD Millipore	PX1570
Kaliumfosfaat, Monobasic	EMD Millipore	PX1565
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
SimplePCI Beeldanalyse Software	Hamamatsu	N/A
Natriumbicarbonaat	Fisher Scientific	S233-3
Natriumchloride	Fisher Scientific	S271-500
Sterivex-GV 0.22 µm filter	EMD Millipore	SVGVB1010
Till Polychrome V Xenon lamp	Till Photonics	N/A
Trypsine (2,5%), geen fenol rood (10x)	ThermoFisher	15090046