Methodenartikel

Screening tests karakteriseren roman Endothelial toezichthouders die betrokken zijn bij de ontstekingsreactie

6.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55824

⸱

15 september 2017

 ,  ,  ,  , 
1Pharmacological Therapies Unit, Research Institute for Rare Diseases, Institute of Health Carlos III

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Vasculaire endotheel bepaalt strak leukocyte werving. Onvoldoende leukocyte extravasation draagt bij tot de inflammatoire ziekten bij de mens. Daarom is zoeken naar nieuwe regelgevende elementen van endothelial activering om te ontwerpen van verbeterde therapieën voor inflammatoire aandoeningen. Hier beschrijven we een uitgebreide methodologie om te karakteriseren roman endothelial regelgevers die leukocyte handel tijdens ontsteking kunnen wijzigen.

Samenvatting

De endothelial laag is essentieel voor het behoud van de homeostase in het lichaam door het beheersen van veel verschillende functies. Regulering van de ontstekingsreactie door de endothelial laag is cruciaal voor het efficiënt bestrijden van schadelijke ingangen en hulp bij het herstel van beschadigde gebieden. Wanneer de endotheliale cellen worden blootgesteld aan een inflammatoire omgeving, zoals de buitenste component van gram-negatieve bacteriën membraan, lipopolysaccharide (LPS), ze uiten van oplosbare pro-inflammatoire cytokines, zoals Ccl5, Cxcl1 en Cxcl10, en leiden tot de activering van de circulerende leukocyten. Bovendien is de uitdrukking van celadhesie-moleculen E-selectine, VCAM-1 en ICAM-1 op het endotheel oppervlak kan de interactie en de hechting van de geactiveerde leukocyten aan het endotheel laag en uiteindelijk de extravasation naar het ontstoken weefsel. In dit scenario moet de endothelial functie strak geregeld omdat buitensporige of defecte activering in de aanwerving van leukocyten tot inflammatoire-gerelateerde aandoeningen leiden kan. Aangezien veel van deze aandoeningen niet over een effectieve behandeling beschikt, moeten nieuwe strategieën met een focus op de vasculaire laag worden onderzocht. Wij stellen voor uitgebreide tests die nuttig zijn voor het zoeken van nieuwe endothelial regelgevers die leukocyte functie wijzigen. We endotheel activering analyseren met behulp van de doelen van de specifieke expressie die betrokken zijn bij de aanwervingsprocedures van de leukocyten (bijvoorbeeld cytokines, chemokines en celadhesie-moleculen) met verschillende technieken, waaronder: real-time kwantitatieve polymerase kettingreactie () RT-qPCR), de western-blot, stroom cytometry en hechting testen. Deze benaderingen endothelial functie in de inflammatoire context bepalen en zijn zeer nuttig voor het uitvoeren van screening tests karakteriseren roman endothelial inflammatoire regelgevers die potentieel waardevolle voor het ontwerpen van nieuwe therapeutische strategieën.

Inleiding

Ontsteking is een gunstig biologische reactie tegen infectieuze agentia, met het grote doel te elimineren van het pathogene agens en het herstellen van beschadigd weefsel. Onder bepaalde voorwaarden, zoals chronische infecties of auto-immune ziekten, ontsteking niet is opgelost. In plaats daarvan is er een afwijkende reactie met continue infiltratie van leukocyten, resulterend in een langdurige immuunrespons die leidt tot weefselbeschadiging, fibrose, verlies van functie, en de algehele, handicap en in sommige gevallen dood van de patiënt. Deze menselijke aandoeningen, gecatalogiseerd als ontstekingsziekten, alle betrekking hebben op de bloedvaten voor de controle van leukocyten extravasation1,2.

De endotheliale cellen spelen een fundamentele rol in de regulatie van de ontstekingsreactie door het beheersen van de leukocyten mensenhandel. Wanneer het endotheel laag is blootgesteld aan inflammatoire mediatoren zoals LPS, de rust endotheel activeert en spreekt van pro-inflammatoire cytokines (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, enz.) en celadhesie-moleculen (E-selectine, VCAM-1 en ICAM-1) die gunst werving van circulerende leukocyten op de site van de infectie. De leukocyten primer door de vrijgegeven cytokines dan bemiddelen rollen en interactie met de endothelial laag door de correspondent zelfklevende tegenhangers: PSGL-1 selectine, α4β1 integrine aan VCAM-1 en αLβ2 integrine aan ICAM-1. Tot slot migreren de leukocyten over de therapieën richting de focus ontsteking3.

De essentiële rol van het endotheel bij het reguleren van de inflammatoire respons is aangetoond op muizen die werden genetisch gewijzigd om uit te drukken de LPS receptor, toll-like receptor 4 (TLR4), alleen op de endotheliale cellen. Deze endotheel-TLR4 dieren konden reageren op een ontsteking LPS-gemedieerde en detecteren de infectie gegenereerd na inoculatie van de bacteriën, en bijgevolg bereiken infectie resolutie en overleven op een vergelijkbaar niveau als de muizen wild type4 , 5.

Voor het endotheel-gereglementeerde ontstekingsreactie traject, heeft het is gepostuleerd dat de remming in bepaalde stadia van de leukocyten-endotheel interactie zou resulteren in de vermindering van de trans-endothelial migratie en een betere prognose voor inflammatoire-gerelateerde ziekten. In feite, zijn verschillende strategieën gericht op de endotheliale activering en leukocyten-endotheel interactie te hinderen extravasation van immune cellen als een behandeling voor inflammatoire aandoeningen6,7ontworpen.

In dit verslag beschrijven we een grondige groep van in vitro technieken om de endothelial activiteit in reactie op de inflammatoire stimulans LPS en haar rol bij activering van de leukocyten en hechting aan de vasculaire laag volledig te karakteriseren. De endothelial cell model gebruikt in dit manuscript was de muis Long endothelial cellijn (MLEC-04), zoals beschreven door Hortelano et al. 8. de MLEC-04 cellijn is gevalideerd in de literatuur als een passend systeem om te studeren endothelial activering9,10. Op basis van het onderzoeksinteresses, deze benaderingen kunnen worden gemakkelijk geëxtrapoleerd naar ieder endothelial of leukocyten systemen en inflammatoire profiel. Zodra de endothelial parameters in de geselecteerde voorwaarden zijn gedefinieerd, kan het systeem nieuwe medicijnen op de voorgestelde experimenten te evalueren van de vasculaire activering testen. In deze inflammatoire context, de cellen van de endotheel getest met de stof van belang kunnen worden vergeleken met de controlevoorwaarden van de cellen en eventuele resulterende verschillen kunnen in kennis stellen van de drug prognostische resultaat op de ontwikkeling en de vooruitgang van ontsteking. Tot slot stellen wij voor een relevante systeem karakteriseren nieuwe drug targets op de endotheliale cellen, die invloed op het ontwerp van nieuwe vasculaire-specifieke therapieën tegen inflammatoire-gerelateerde ziekten uitoefenen kunnen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. endothelial celcultuur

  1. Weefselkweek behandeld platen
    1. jas 100 mm weefselkweek platen met gelatine van 2.5 mL oplossing (gesteriliseerde met autoclaaf, 0,1% gelatine in gedestilleerd water) gedurende 30 minuten bij 37 ° C; dit kunnen worden geëxtrapoleerd naar de vereist goed formaat. De gelatine oplossing gecombineerd en laat platen te drogen in de weefselkweek kap.
  2. Weefsel kweekomstandigheden
    1. de MLEC-04-cellen binnen een biologische incubator (37 ° C, luchtvochtigheid van 95%, 5% CO 2) cultiveren. De cellen in volledige media van Dulbecco groeien ' s gewijzigd Eagle Medium: nutriënt mengsel F-12 (DMEM/F-12) aangevuld met 10% foetale boviene Serum (FBS) en 100 eenheden/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine (P/S).
    2. De cellen tellen de standaardmethode voor het Neubauer-kamer en de MLEC-04-cellen toevoegen aan de 100 mm gelatine-behandelde platen in 10 mL volledige media, bij een lage dichtheid van 2-11 x 10 4 cellen/cm 2. Splits de cellen 1:3, wanneer ze samenvloeiing bereiken.
      Opmerking: Dit gebeurt meestal na twee tot drie dagen in cultuur.
    3. Subcultuur de cellen door het wassen van de platen met 10 mL steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gevolgd door toevoeging van 2 mL trypsine-EDTA-oplossing (0,25% trypsine, 5 mM EDTA) en incubeer gedurende 3 minuten bij 37 ° C.
    4. Stop de reactie trypsine-EDTA en de zwevende cellen te herstellen door het toevoegen van 10 mL volledige media. Spin down de cellen (300 x g, 5 min), verwijder het supernatant, resuspendeer de cellulaire pellet in volledige media en subcultuur adequaat.

2. LPS behandeling en bemiddelaars

  1. plaat van de MLEC-04-cellen in volledige media aan sub samenvloeiing naar het volgende goed formaat: 7 x 10, 5 cellen/putje op 6-Wells-platen en 2.5 x 10 5 cellen/putje op 96-wells-platen.
  2. Broeden de cultuur gedurende 6 uur in een cel incubator (37 ° C, luchtvochtigheid van 95%, 5% CO 2). De cellen naar onvolledige media (DMEM-F12, P/S) en overnachting (ON) te synchroniseren en te verlagen van de activiteit van de cel verlaten.
  3. Verwijder het medium en testen van nieuwe farmacologische stoffen door het broeden van de endotheliale cellen met (of zonder) de drug in kwestie (bijvoorbeeld DT 10) verdund in de onvolledige media (30 min, 37 ° C); Voeg 1,4 mL/goed voor 6-well plaat of 0.14 mL/putje voor 96-wells-platen).
  4. Daag de cellen door toevoeging van LPS aan de incubatie-media (100 ng/mL, eindconcentratie) voor de periode van de tijd die is opgegeven bij elke test. PBS gebruiken als besturingselement.

3. Evaluatie van transcriptionele profiel op endotheel geactiveerd door RT-qPCR

  1. zaad de MLEC-04 cellen aan sub samenvloeiing in 6-well cultuur platen (7 x 10 5 cellen per putje). Incubeer gedurende 6 h (37 ° C, luchtvochtigheid van 95%, 5% CO 2) en daarna gaat u verder met serum honger (Incubeer ON).
  2. Verwijder het medium en de endothelial cel culturen met het geneesmiddel van belang verdund in de onvolledige media (incubeer 30 min, 37 ° C); Voeg 1,4 mL/goed voor 6-well plaat (30 min, 37 ° C) behandelen (of niet behandelen).
  3. Uitdaging van de cellen door toevoeging van 100 ng/mL LPS aan de bebroede media (zoals beschreven in stap 2.3) en incubeer voor 6 h. Zet de reactie Stop door wassen tweemaal met koude PBS en houden van platen bij-80 ° C tot monster verwerking.
  4. RNA extractie
    1. ontdooien van de platen en voeg 1 mL/putje RNA extractie buffer (38% fenol en 0,8 M guanidinium isothiocyanaat; zie tabel van materialen). Laat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) onder agitatie en verzamelen homogenaat in buizen van 1,5 mL.
    2. Toevoegen van 200 µL chloroform en zachtjes doorroeren voor 15 s. Incubate gedurende 3 minuten op RT en centrifuge (11,600 x g, 15 min, 4 ° C).
    3. Waterfase overbrengen in een andere 1,5 mL-buis. Neerslag van RNA door toevoeging van 500 µL isopropanol en gevolgd door een 10 minuten incubatie bij RT en dan centrifugeren (11.600 x g, 4 ° C).
    4. Verwijder het supernatant en wassen van de pellet met 75% ethanol door vortex agitatie en vervolgens centrifugeren (7500 x g, 4 ° C).
    5. Luchtdroog de pellet en solubilize van RNA in 25 µL pure H 2 O door incubatie gedurende 10 minuten bij 55 ° C. Houd RNA bij-80 ° C tot monster verwerking.
  5. Hoeveelheid en zuiverheid van RNA
    1. de concentratie van RNA te kwantificeren door het meten van de extinctie van het monster bij 260 nm in een spectrofotometer (Zie Tabel of Materials).
    2. Maatregel op 230 nm en 280 nm tot het bepalen van de zuiverheid van het RNA.
      Opmerking: De verhouding tussen enerzijds tegen 260/280 geeft eiwit of fenol besmetting. Een verhouding dicht bij 2 is aanvaardbaar. De verhouding op 260/230 geeft EDTA, koolhydraten of fenol contaminanten. Waarden tussen 2.0-2.2 zijn aanvaardbaar.
  6. Controleren RNA integriteit
    1. Run 2 µg totaal RNA en een RNA ladder op een 1,5% agarose gel denaturering; visualiseren op een documentatiesysteem gel (Zie Tabel of Materials).
      Opmerking: Een verhouding van 2:1 van helder en scherp 28 en 18S rRNA bands geeft een intact RNA. Gedeeltelijk afgebroken RNA Lost als een vlekkerig verschijning.
  7. RT-qPCR
    1. de cDNA (cDNA) te synthetiseren vanuit een enkele gestrande RNA na de standaard protocol (Zie Tabel van materialen) 11.
  8. Evalueren genexpressie door RT-qPCR
    1. het reactiemengsel voor elk monster bereiden: Meng 2 µL cDNA, 7 µL fluorescerende samengestelde 300 nM voorwaartse primer en 300 nM omgekeerde primer (tabel 1) in een eindvolume van 13 µL, en toevoegen aan de 96-Wells reactie plaat (Zie Tabel of Materials).
    2. Zegel van de plaat met een optische zelfklevende deksel, centrifuge (300 x g, 1 min) en het uitvoeren van de reactie op een Real-Time PCR systeem (warme start 95 ° C gedurende 20 s gevolgd door 40 cycli: 95 ° C voor 3 s en 60 ° C gedurende 30 s) (Zie Tabel of Materials).
    3. Analyseren de resultaten door relatieve kwantificatie met behulp van de vergelijkende methode 2 -ΔΔCt met de huishouding genen glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) of zuur ribosomal phosphoprotein P0 (36B4) 12 .

4. Beoordelen Endothelial activering door Stroom Cytometry

  1. de MLEC-04-cellen na de in punt 2 beschreven voorwaarden behandelen en evalueren van de wijzigingen in de endotheliale oppervlakte eiwitten door stroom cytometry.
  2. Ontkoppelen de cellen na 6 h van LPS stimulatie met de trypsine-EDTA-methode, beschreven in stap 1.2.3, en wassen met de onvolledige media bij 4 ° C.
  3. Met behulp van de methode van de kamer Neubauer cellen tellen en 10 x 10 4 cellen plaats in u-onder 96-wells-platen. Centrifuge (300 x g, 5 min) en teruggooi bezinken door een 180° breuk van de pols van boven naar de beneden en snel herstel naar de oorspronkelijke positie.
  4. 50 µL van het geselecteerde antilichaam verdund in de onvolledige media (10 µg/mL, eindconcentratie) aan de cellen toevoegen en (30 min, 4 ° C) incuberen.
  5. Wassen de cellen tweemaal wITH de onvolledige media na de procedure die wordt beschreven stap 4.3, en broeden met 50 µL bij 10 µg/mL van de overeenkomstige secundair antilichaam gekoppeld aan FITC of een soortgelijk geconjugeerde (30 min, 4 ° C in een donkere ruimte).
  6. Was eens de cellen met de onvolledige media gevolgd door een PBS-wassen. Herstellen van de cellen met 300 µL PBS met behulp van 1 mL pipet tips en plaatsen in cytometry buizen.
  7. Evalueren de monsters in de stroom cytometry systeem (Zie Tabel van materialen). De bevolking van de cel door de naar voren en kant verstrooiing parameters aanpassen. Poort de bevolking van belang. Poorten op basis van de negatieve controle uit cellen geïncubeerd met isotype besturingselement aanpassen. Analyseren van de resultaten als het percentage positieve cellen of betekenen fluorescentie intensiteit 8.

5. Evalueren van Endothelial activering door de Western Blot

  1. zaad van het endotheel bij sub samenvloeiing in 6-well cultuur platen (7 x 10 5 cellen/well) en behandelen met LPS zoals beschreven in sectie 2. Analyseren van de inflammatoire eiwituitdrukking bij het volgende westelijke vlek protocol.
  2. Stoppen met de stimulatie van de LP's op verschillende tijdstippen ophelderen van verschillende aspecten van het endotheel antwoord:
    1. het profiel van de inflammatoire eiwitten gaan na 6 h van LPS stimulatie.
    2. Bepalen de cel signalering van elke 15 min een periode van 60 min door.
  3. In beide gevallen zet de reactie stop door het wassen tweemaal met koude PBS en bewaren van de monsters bij-80 ° C tot monster verwerking.
  4. Lyse cellen en eiwit extractie
    1. toevoegen 200 µL lysis buffer aan elk putje (1% niet-ionogene oppervlakteactieve stof, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, natriumchloride 150 mM, 30 mM natrium pyrofosfaat, 50 mM Natriumfluoride, 2.1 mM natrium orthovanadate op pH 7,6, aangevuld met proteaseinhibitor cocktail) (zie tabel van materialen).
    2. Voor 15 min bij 4 ° C onder agitatie, schrapen van putjes met een pipet tip en verzamelen van het homogenaat in 1,5 mL buizen Incubeer.
    3. De buizen bij 11.600 x g Centrifugeer bij 4 ° C.
    4. Bewaren de bovendrijvende substantie in schone 1,5 mL buizen bij-80 ° C tot verwerking.
  5. Maatregel de eiwitconcentratie door de bicinchoninic-zuur-bepaling na de standaard protocol (zie tabel van materialen) 13.
  6. Lossen de 30 µg totaal eiwit lysate voor elk monster door de standaard techniek van 0,1% natrium dodecyl sulfaat, 10% polyacrylamide-gel elektroforese (SDS-PAGE) 14. Voorbeelden uitvoeren met 10 mM β-mercaptoethanol (vermindering voorwaarden) of zonder (niet-reducerende omstandigheden) afhankelijk van het antilichaam gebruikt voor het opsporen van de proteïne van belang.
  7. De gescheiden eiwitten van het polyacrylamidegel overbrengen naar een Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride overdracht membraan met 0,45 µm poriegrootte via standaardprocedure.
  8. Na de overdracht, wassen van het membraan tweemaal met PBS, 0,1% Polysorbaat-20 (PBS-T) en blokkeren van aspecifieke bandplaatsen door toevoegen van 20 mL 2% BSA verdund in PBS-T voor gedetecteerde phosphoproteins of 5% non-fat droge melk in PBS-T voor totale eiwitten, onder agitatie (90 min, RT).
  9. Verdun het geselecteerde antilichaam in 10 mL van de juiste blokkeerbuffer bij de aanbevolen concentratie en Incubeer het membraan onder agitatie (ON, 4 ° C). Als alternatief, plaats het membraan in verzegelde plastic zakken en 5 mL van de verdunde antilichaam gebruikt.
  10. Volgende dag wassen het membraan drie keer (overtollige PBS-T, 15 min, RT).
  11. Incubate het membraan onder agitatie (30 min, RT) met 10 mL van de correspondent secundair antilichaam gekoppeld met mierikswortelperoxidase (HRP) verdund op 1:10,000 in de passende blokkeerbuffer.
  12. Wassen van het membraan driemaal onder agitatie (overtollige PBS-T, 15 min, RT).
  13. Incubeer het membraan voor 1 min met 0,1 mL/cm 2 van het peroxidase substraat Verbeterde Chemiluminescentie (ECL). Plaats de gedraineerde membraan tussen twee transparante plastic vellen en plaatst u deze in het Chemoluminescentie-detectiesysteem waarin een Charged-Coupled apparaat camera (CCD).
    1. Gebruiken de CCD-camera voor het detecteren van het signaal en de bijbehorende software om record beelden met de cumulatieve programma (afbeeldingen weergegeven geaccumuleerde signaal op elke 30 s blootstelling gedurende een periode van totaal 15 min).
  14. Kwantificeren van de intensiteit van de band door densitometrie met behulp van de software van de ImageJ volgens het protocol beschreven in de gids gebruiker 15.
    1. Open van het monster in de ImageJ-software en selecteer de band van belang met rechthoekige selectiegereedschap.
    2. Selecteren als het eerste lane en pers plot rijstroken om te verkrijgen van de profiel-percelen.
    3. Het gebied van de pieken met de lineaire selectie scheiden.
    4. De grootte van elke band meten door te klikken op de binnenkant van elke piek.
    5. Vertegenwoordigen de resultaten met betrekking tot het laden van eiwit controle (β-actine, tubuline, enz.).

6. Evalueren Endothelial Factor vrijgelaten uit leukocyten activering door hechting Assays

  1. verkrijgen van het endotheel geconditioneerde media.
    1. De MLEC-04-cellen te behandelen, zoals aangegeven in sectie 2 en het verzamelen van de cultuur supernatant na 24u stimulatie met LPS (100 ng/mL).
    2. Verzamelen de geconditioneerde media van de behandelde MLEC-04-cellen en centrifuge (600 x g). Houd het supernatant in 0,5 mL aliquots bij-80 ° C tot gebruik.
  2. Leukocyten hechting assay
    1. jas van de 96-wells-platen met 50 µL per putje van geselecteerde extracellulaire matrix eiwitten (met uitzondering van collageen, die is verdund in 0,1 M azijnzuur) in PBS is verdund: fibronectine (1-10 µg Mo/mL ), laminin (1-10 µg/mL) en collageen type I (10-40 µg/mL). Verlof op bij 4 ° C.
    2. De gecoate media negeren en blokkeren van aspecifieke bandplaatsen op putjes met 150 µL PBS, 1% BSA warmte-geïnactiveerd (1 min, 100 ° C) gedurende 90 minuten op RT.
    3. Was de putjes goed tweemaal met PBS en voeg 100 µL van eerder verzamelde endothelial geconditioneerd media (punt 6.1) toe aan de putjes.
      Opmerking: Platen zijn klaar voor het uitvoeren van de bepaling van de wrijvingscoëfficiënt.
    4. Cultuur de muis monocyt-macrofaag cellijn J774 in een biologische incubator (37 ° C, luchtvochtigheid van 95%, 5% CO 2) met Roswell Park Memorial Instituut Medium (RPMI), 10% FBS, 1% P/S.
      Opmerking: De J774 cellen groeien in suspensie.
    5. De J774 cellen in een tube van 15 mL en centrifuge (300 x g, 5 min) verzamelen. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellulaire pellet met 10 mL serum-vrije media. De cellen in een kamer Neubauer tellen. Centrifugeer de cellen (300 x g, 5 min), verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in serumvrij media op 15 x 10 4 J774 cellen per 50 µL media.
    6. Toevoegen 15 x 10 4 J774 cellen aan elk goed in 50 µL serumvrij media en incubeer gedurende 15 min bij 4 ° C, gevolgd door 1 uur bij 37 ° C in de CO 2 cel incubator.
    7. Was de putjes goed tweemaal, zachtjes door het toevoegen van warme PBS; centrifugeren (300 x g, 5 min) en weggeworpen door een 180° breuk van de pols van boven naar de beneden en snel herstel naar de oorspronkelijke positie. De gekoppelde cel reparerens door toevoeging van 100 µL per putje van 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS en incubeer (10 min, RT).
    8. Negeren de media zachtjes en permeabilize van de cellen met 2% methanol in PBS voor 2 min op RT. Discard de media zachtjes vlek de cellen door toevoeging van 50 µL per putje van 0,5% kristalviolet in 20% methanol voor 90 s op RT.
    9. De plaat met overvloedig stromend water wassen, verwijderen van de overtollige vloeistof en laat drogen. Verslag van de gekoppelde cellen door digitale camera gekoppeld aan een lichte Microscoop.
    10. Verdun de cel kleuring door 100 µL per putje van 0,1 M Natriumcitraat, 50% ethanol toe te voegen. Maatregel de absorptie bij 545 nm en vertegenwoordigen de resultaten als willekeurige eenheden van absorptie of percentage van de wrijvingscoëfficiënt door te overwegen van 100% als cel adhesie aan putjes bereikt bekleed met hogere ligand concentratie

7. Test Endothelial activering door leukocyten-endotheel co hechting Assay

  1. de MLEC-04-cellen op 96-wells-platen behandelen zoals beschreven in sectie 2 en met LPS (6 h, 37 ° C) incuberen.
  2. Fluorescently label J774 cellen met Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CSFE).
    1. Was de J774 cellen in PBS overeenkomstig de procedure van 6.2.5. Graaf de cellen door de Neubauer kamer methode en resuspendeer bij 1 x 10 6 cellen/mL in PBS, 0,1% BSA.
    2. Incubeer de cellen met CFSE (5 µM, eindconcentratie) gedurende 20 minuten bij 37 ° C. Voeg 5 mL onvolledig media en incubeer (5 min, 4 ° C).
    3. Een keer wassen met onvolledige media zoals uitgelegd in 6.2.5. resuspendeer op 15 x 10 4 cellen/100 µL en gaat u verder met de mede hechting assay.
  3. Na de behandeling van het endotheel, was de putjes drie keer met onvolledige media. CFSE-J774 cellen (15 x 10 4 cellen/100 µL) toevoegen aan elk endothelial beklede goed. Incubeer de plaat gedurende 10 minuten bij 4 ° C, gevolgd door 60 minuten bij 37 ° C.
  4. Was de putjes goed zacht, zoals beschreven in 6.2.7., met behulp van verwarmde PBS en verslag uitbrengen van de hechting van de J774 aan de endothelial laag door de volgende twee methoden:
    1. Lyse cellen in 0,1 M Tris-HCl pH 8,8, 1% SDS (100 µL per putje) en meet de CFSE-J774 signaal door fluorometry (excitatie/emissie = 492 nm/517 nm). Vertegenwoordigen van de resultaten als willekeurige eenheden van de intensiteit van de fluorescentie of percentage van de hechting ten opzichte van de positieve controle (signaal van totaal aantal cellen toegevoegd aan elk putje).
    2. Oplossen van de cellen in 4% PFA en verslag de bevestiging van de CFSE-J774-cellen aan het endotheel door visualiseren onder een fluorescentie Microscoop (excitatie/emissie = 492 nm/517 nm).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Evaluatie van LPS-veroorzaakte endothelial cel activatie door RT-qPCR

De cellen van de MLEC-04 serum uitgehongerd werden gestimuleerd door 100 ng/mL LPS voor 6 h en de endothelial genexpressie werd beoordeeld met behulp van RT-qPCR door het vergelijken van de expressie van activering markers tot de rust toestand. Zoals blijkt uit figuur 1A, veroorzaakte de LPS-bebroede MLEC-04-cellen de uitdrukking van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit endotheel protocol beschrijft een stapsgewijze technologie die de basis leggen voor verkennen nieuwe mechanismen die betrokken zijn bij de regulering van de ontstekingsreactie vaststelt. Deze benaderingen zijn gebaseerd op de studie van het endotheel activiteit gestimuleerd door LPS en evalueren van de kritische stappen betrokken bij de aanwervingsprocedures van de leukocyten tijdens de ontstekingsreactie, specifiek: endothelial cytokines release, endotheel hechting moleculen expressie en leukocyten hechting aan de v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) en het Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (subsidie getal IERPY 1149/16 A.L.; MPY 1410/09 naar S. Hortelano); door de MINECO via het Fondo de Investigación en Salud (FIS) (S. Hortelano verleent nummers PI11.0036 en PI14.0055). S. Herranz werd gesteund door IERPY 1149/16 van ISCIII.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
GelatinSigmaG9391
DMEM-F12LonzaBE12-719F
Fetal Bovine SerumSigmaA4503
Penicillin streptomycinLonzaDE17-602E
TrypsineLonzaBE17-160E
EDTASigmaED2SS
LPSSigmaL2880
TrizolSigmaT9424RNA-extractiebuffer
IsopropanolSigma33539
Ethanol absolutoPanreac1,310,861,612
Pure H2OQiagen1017979RNAse free
AgarosePronadisa8020
Stain for agarose gelsInvitrogens33102
SuperScript III First-Strand SynthInvitrogen18080051Reagents voor RT-PCR
Fast SYBR Green Master MixApplied Biosystems4385610Fluorescente kleurstof voor qPCR
MicroAmp Fast Optical 96-WellApplied Biosystems4346906Platen voor qPCR
U-bottom 96 well platesFalcon353072
Cytometry tubesFalcon352054
TX100Panreac212314Niet-ionogene oppervlakteactieve stof
Tris-HClPanreac1,319,401,211
Sodium chlorideMerck1,064,041,000
Sodium pyrofosfaatSigma221368
NatriumfluorideSigmaS7920
Natriumorthovanadatesigma13721-39-6
Protease inhibitor cocktailsigmaP8340
Pierce BCA Protein Assay KitPierce23225Reagents voor bicinchoninezuur-assay
β-mercaptoethanolmerck805,740
PVDF Transfer Membrane, 0.45 µmThermo Scientific88518
Tween-20Panreac1,623,121,611Polysorbaat 20
PBSLonzaBE17-515Q
ECLMilliporeWBKLS0500
FibronectinSigmaF1141
LamininSigmaL2020
Collagen type ISigmac8919
AzijnzuurPanreac1,310,081,611
TrypanblauwSigmaT8154
ParaformaldehydeSigmaP6148
MethanolPanreac1,310,911,612
KristalvioletSigmaHT90132
NatriumcitraatSigmaC7254
Ethanol 96%Panreac1,410,851,212
CFSESigma21888
RPMILonzaBE12-115F
SDSBio-Rad161-0418
Infinite M200TecanM200Multi-modus microplaatlezer
Gel Doc 2000Bio-Rad2000Geldocumentatiesysteem
StepOnePlusApplied BiosystemsStepOnePlusqPCR-systeem
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi BiotecAnalyzer 10Cytometrie-apparatuur
ChemiDoc MPBio-RadMPChemiluminescentie detectiesysteem
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Antilichamen
PECAM-1BD Biosciences553370Gebruik bij 10 µg/mL
ICAM-2Biolegend1054602Gebruik bij 10 µg/mL
E-selectineBD Biosciences553749Gebruik bij 10 µg/mL
VCAM-1BD Biosciences553330Gebruik bij 10 µg/mL
ICAM-1Becton Dickinson553250Gebruik bij 10 µg/mL
anti-rat IgG-FITCJackson Immuno Research112-095-006Gebruik bij 10 µg/mL
anti armenian hamster-FITCJackson Immuno Research127-095-160Gebruik bij 10 µg/mL
Rat IgG isotyope controlInvitrogen10700Gebruik bij 10 µg/mL
Armenian hamster IgG isotype controlInvitrogenPA5-33220Gebruik bij 10 µg/mL
P-IκΒ-αCell Signaling2859Gebruik bij 10 µg/mL
β-ActineSigmaA5441Gebruik bij 10 µg/mL
P-ERKCell Signaling9101Gebruik bij 10 µg/mL
anti-muis HRPGE HealthcareLNXA931/AEGebruik bij 1:10.000
anti-konijn HRPGE HealthcareLNA934V/AGGebruik bij 1:10.000
anti-rat HRPSanta CruzSc-3823Gebruik bij 1:10.000

Referenties

  1. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
  2. Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation? Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
  3. Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
  4. Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
  5. McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
  6. Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
  7. Chamorro, Á, Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
  8. Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
  9. Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
  10. Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
  11. SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , Life Technologies. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013).
  12. Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  13. Pierce BCA Protein Assay Kit. , Thermo Scientific. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017).
  14. He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
  15. ImageJ User Guide. , ImageJ. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017).
  16. Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930(2015).
  17. Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
  18. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
  19. Tedgui, A., Mallat, Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall. Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).
  20. Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
  21. Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149(2014).
  22. Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
  23. Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

RT qPCRWestern blotflowcytometrieadhesie assaysleukocytenrekruteringcytokine expressieadhesiemoleculenLPS stimulatie

Gerelateerde artikelen