Visualisatie van het Axonal Projectiepatroon van Embryonische Motor Neuronen in Drosophila

Summary

Dit werk bevat een standaard immunohistochemie methode om motorische neuron projecties van late-16 Drosophila melanogaster embryo's te visualiseren . De gefiltreerde bereiding van vaste embryo's die gekleurd zijn met FasII antilichaam, biedt een krachtig instrument om de genen die nodig zijn voor motor axon pathfinding en target recognition tijdens neurale ontwikkeling te karakteriseren.

Abstract

De oprichting van functionele neuromusculaire circuits berust op nauwkeurige verbindingen tussen het ontwikkelen van motoraxonen en doelspieren. Motorneuronen verlenen groeikegels om langs specifieke wegen te navigeren door te reageren op een groot aantal axonbegeleidingstijlen die voortkomen uit de omliggende extracellulaire omgeving. Groeikegel target herkenning speelt ook een kritische rol in neuromusculaire specificiteit. Dit werk presenteert een standaard immunohistochemie protocol voor het visualiseren van motor neuron projecties van late stadium-16 Drosophila melanogaster embryo's. Dit protocol bevat een paar belangrijke stappen, waaronder een genotyping procedure, om de gewenste mutante embryo's te sorteren; Een immunostaining procedure, embryo's met fasciclin II (FasII) antilichaam op te nemen; En een dissectie procedure, om gefiltreerde preparaten van vaste embryo's te genereren. Motoraxonprojecties en spierpatronen in de periferie zijn veel beter zichtbaar in platte preparaten van gefiltreerde embryo's dan in whOle-mount embryo's. Daarom geeft de gefileerde bereiding van vaste embryo's, gekleurd met FasII-antilichaam, een krachtig instrument om de genen die nodig zijn voor motoraxon pathfinding en target recognition, te karakteriseren en kan ook toegepast worden op zowel de functionaliteit als de genetische schermen .

Introduction

Nauwkeurige en selectieve verbindingen tussen motoraxonen en doelspieren tijdens embryonale ontwikkeling zijn essentieel voor normale locomotie in Drosophila larven. Het embryonale patroon van 30 spiervezels in elk van de buikhemisegmenten A2-A7 wordt vastgesteld door stadium 16 ¹ . De 36 motorneuronen die worden gegenereerd in het ventrale zenuwkoord breiden hun axonen naar de periferie om specifieke doelspieren 2 te innervaten. Motor axon pathfinding en target herkenning kunnen worden visualiseerd door immunohistochemie met een antilichaam (muis monoklonaal antilichaam 1D4) ^{3 , 4} . Meerdere afbeeldingen van de motor axon projectie patronen in wildtype embryo's zijn beschikbaar op het web ⁵ . Het 1D4 antilichaam markeert alle motor axonen en drie longitudinale axon fascixen aan weerszijden van de middenlijn van het embryonale centrale zenuwstelsel (CNS) ^{4 , 6} ( Figuur 1C en Figuur 2A ). Daarom biedt immunohistochemie met FasII antilichaam een ​​krachtig hulpmiddel voor het identificeren van genen die nodig zijn voor neuromusculaire connectiviteit voor het aantonen van de moleculaire mechanismen die onderliggend zijn aan motorische axonbegeleiding en doelherkenning.

In elk van de abdominale hemisegmenten A2-A7, motorisch axonenproject en selectief fascinerend in twee hoofdzenuwtakken, de segmentale zenuw (SN) en de intersegmentale zenuw (ISN) ^{2 , 4} en een kleine zenuwtak, de transversale zenuw (TN ) ⁷ . De SN selecteert selectief om twee zenuwtakken genaamd SNa en SNC te geven, terwijl de ISN splitst in drie zenuwtakken, de ISN, ISNb en ISNd ^{2 , 4 genoemd} . Onder hen ISN, ISNb en SNa motor axonProjectiepatronen worden het meest nauwkeurig zichtbaar wanneer late stadium 16 embryo's met FasII antilichaam zijn gekleurd en gefileerd zijn ( Figuur 1C en Figuur 2A ). De ISN-motorische neuronen breiden hun axonen naar de innerlijke dorsale spieren 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 en 20 ^{2 , 4} ( Figuur 2A ). De ISNb-motorneuronen innervieren de ventrolaterale spieren 6, 7, 12, 13, 14, 28 en 30 ^{2 , 4} ( Figuur 2A en 2B). De SNa-zenuwtak probeert de laterale spieren 5, 8, 21, 22, 23 en 24 ^{2 , 4} te innervaten ( Figuur 2A ). De TN, die bestaat uit twee motoraxonen, projecteert ipsilateraal langs de segmentale grens naar de innerlijke spier 25 en maakt synaptes met de laterale bipolaire dendritische neuron (LBD) in deOmtrek ⁷ ( figuur 2A ). Deze doelspierinervaties vereisen niet alleen selectieve defasciculatie van motoraxonen op specifieke keuzepunten, maar ook gericht op spierherkenning. Daarnaast zijn sommige vermoedelijke mesodermale geleidingspostcellen die als tussenliggende doelen fungeren, gevonden in zowel de ISN- als SNa-trajecten, maar niet langs de ISNb-weg ⁴ . Dit kan suggereren dat ISNb motor axon pathfinding op een duidelijke manier kan worden gereguleerd in vergelijking met ISN en SNa motor axon begeleiding. Het geeft ook aan dat perifere motor axon begeleiding een aantrekkelijk experimenteel model biedt om de differentiële of geconserveerde rollen van een enkele begeleiding cue te bestuderen Molecuul ⁸ .

Dit werk presenteert een standaard methode om de axonale projectiepatronen van embryonale motorische neuronen in Drosophila te visualiseren . De beschreven protocollen bevatten hoe u vaste embryo's kleurt met 1D4 aNtibody en verwerkt in 3,3'-diaminobenzidine (DAB) voor gefileerde preparaten. Een kritisch voordeel van de platte preparaten van vaste embryo's is de betere visualisatie van de axonale uitsteeksels en spierpatronen in de periferie. Verder laat dit werk ook zien hoe genotype vaste embryo's worden genotypeerd om de gewenste mutante embryo's te sorteren met behulp van de LacZ staining methode.

Protocol

1. Bereiding

1. Bereid 500 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op met t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (PBT) oplossing door 0,5 g boviene serumalbumine (BSA) en 0,5 ml t-octylfenoxypolyethoxyethanol (zie de Tabel van Materialen) toe te voegen aan 500 ml 1X PBS En gedurende tenminste 30 minuten roeren. Bewaren bij 4 ° C. Gebruik wanneer relatief fris en sla de oplossing op in een schone fles.
2. Maak 10 ml 4% paraformaldehyde door 2,5 ml 16% voorraad paraformaldehyde oplossing en 1 ml 10x PBS toe te voegen aan 6,5 ml gedeïoniseerd water. Bewaar bij 4 ° C en gebruik binnen een week.
   VOORZICHTIG: Vermijd contact met de paraformaldehydeoplossing omdat het zeer giftig is.
3. Maak X-Gal substraat (10% w / v X-Gal in dimethylsulfoxide (DMSO)) door 0,1 g X-Gal substraat per 1 ml DMSO op te lossen. Bewaren bij -20 ° C in 100 μl porties.
4. Maak een X-Gal-kleuroplossing met 10 mM fosfaatbuffer (pH 7,2), 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 3 mMK4 [FeII (CN) ₆ ], 3 mM K3 [FeIII (CN) ₆ ] en 0,3% t-Octylfenoxypolyethoxyethanol. Bewaar bij 4 ° C in het donker.
5. Maak 3% waterstofperoxideoplossing door 30% waterstofperoxide 1:10 te verdunnen met gedeïoniseerd water.
6. Maak 3,3'-diaminobenzidine (DAB) oplossing door 1 tablet (10 mg) DAB volledig te oplossen in 35 ml verse PBT-oplossing. Filter door een 0,2 μm spuitfilter en opslaan bij -20 ° C in 910 μL aliquots.
   LET OP: Verwijder alle DAB-afval in bleekmiddel om de DAB te vernietigen.
7. Maak eierplaten met appelsap. Voeg 35 g agar en 1 liter gedeïoniseerd water toe aan een 2 liter fles. Voeg 33 g saccharose, 2 g tegosept en 375 ml appelsap toe aan een 1- L-fles. Smelt ze door 30 minuten autoclaven. Laat beide oplossingen afkoelen tot ongeveer 60 ° C. Combineer en meng deze oplossingen goed door roeren. Giet ~ 11 ml gecombineerde oplossing per 60 mm kweekschotel.
8. Maak gistpasta door bakker ja te mengenSt in gedeïoniseerd water (1: 0,8 verhouding) en sla bij 4 ° C.

2. Embryo-collectie (Dag 1)

1. Verzamel jonge vrouwelijke en mannelijke vliegen (jonger dan 5 dagen) en houd ze gedurende 1-2 dagen in een plastic bekerkooi met een ei plaat (60 mm x 15 mm) die een kleine hoeveelheid gistpasta in het midden bevat.
2. Voor de optimale verzameling van late-16 embryo's, stel een fleskooi met vliegen (> 50) omstreeks 17 uur op en leg ze eieren bij 25 ° C gedurende 3 uur.
3. Breng de vliegen over naar een verse voedselfles.
4. Sluit de eierplaat met het deksel en incubeer het ondersteboven bij 25 ° C in een bevochtigde incubator (~ 70% vochtigheid) 's nachts.

3. Voorbereiding van embryo's voor immunovervulling (Dag 2)

1. Voeg 1,8 ml PBT oplossing op de eierplaat om 10:20 uur en gebruik een katoenen pootje om de embryo's van de plaat los te maken terwijl u deze kantelt.
   Opmerking: Door de gistpastei voorzichtig te mashen met een katjeOp zwabber, los het op als er een groot aantal embryo's erin zit. Begin het verzamelen van de embryo's ~ 40 minuten voor fixatie (om 11:00 uur).
2. Breng de embryo's van de eierplaat naar een 1,5 ml microtube door gebruik te maken van een 1-pipetip.
3. Laat de embryo's zoveel mogelijk afzetten en de PBT-oplossing aspireren. Spoel de embryo's tweemaal met 1 ml PBT-oplossing af. Aspireer de PBT-oplossing zoveel mogelijk.
4. Vul de buis met 1 ml 50% bleekmiddel ( dwz verdund in gedeïoniseerd water) en verplaats de embryo's door ze gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur (RT) op een nutator te incuberen.
   Opmerking: Deze stap vermoordt niet de gedecoreerde embryo's.
5. Laat de gedecoreerde embryo's zitten, doei de 50% bleekmiddel zo veel mogelijk, en spoel de embryo's 3 keer met 1 ml PBT-oplossing.
6. Voeg 0,5 ml heptaan toe en voeg ongeveer 0,5 ml 4% paraformaldehydeoplossing bij de buis bij RT bij ongeveer 11:00 uur toe.
7. Incubeer deEmbryo's op een nutator gedurende 15 minuten bij RT.
8. Verwijder de 4% paraformaldehyde oplossing (de onderste laag).
9. Voeg 0,5 ml 100% methanol toe en devitellineer de embryo's door de buis krachtig te schudden gedurende 30 s.
10. Verwijder de heptaan ( dwz de bovenste laag).
11. Voeg 0,5 ml 100% methanol toe en schud de buis krachtig gedurende 10 s.
12. Laat de embryo's afzetten door de buis te tikken en de methanol zo veel mogelijk te aspireren. Spoel de embryo's met 1 ml 100% methanol, schudden gedurende minder dan 10 s.
    Opmerking: Uitgebreide blootstelling aan methanol vernietigt β-Gal-activiteit.
13. Verwijder de methanol en spoel de devitellinized embryo's 3 keer met 1 ml PBT-oplossing af.

4. Genotypering van de embryo's met LacZ-kleuring (Dag 2)

1. Voeg 1 ml PBT-oplossing aan de buis toe en incubeer de buis in een warmteblok van 37 ° C of waterbad gedurende 15 minuten.
2. Plaats tijdens de incubatie X-Gal-kleuroplossing (1 ml per tuWees) bij 65 ° C in een waterbad totdat het bewolkt wordt. Incubeer het in een waterbad van 37 ° C.
3. Aspirateer de PBT-oplossing en voeg 1 ml X-Gal-kleuroplossing en 20 μL X-Gal-substraat toe aan de buis.
4. Incubeer de buis bij 37 ° C met voeding totdat een blauw neerslag duidelijk is.
   Opmerking: De incubatietijd voor de ^2e en ^3e blauwe balancers in het algemeen varieert van 2-4 uur.
5. Verwijder de X-Gal-kleuroplossing en spoel de embryo's 3 keer met 1 ml RT PBT-oplossing.
6. Met behulp van een naald sonde of pincet, handvat de embryo's van het gewenste genotype ( dwz niet-gekleurde witte embryo's) met een lichtdissectiemicroscoop (1.6X-2.5X doelstellingen).
   Opmerking: Aangezien sommige blauwe balancers, zoals CyO, actin-LacZ en TM3, actine-LacZ , een transgene constructie uitdrukken die bacterieel ß-Gal (LacZ) onder controle van de actinpromotor dragen, bevatten embryo's op blauw gekleurd blauw op een alomtegenwoordige manierEen of twee exemplaren van blauwe balancerchromosomen. Daarom zijn niet-gekleurde witte embryo's homozygote voor de gewenste dodelijke allele.

5. Immunostaining van embryo's met anti-fasciclin II-antilichamen (dag 2-3)

1. Verzamel en overbreng de embryo's van het gewenste genotype ( dwz niet-gebleekte witte embryo's) naar een 0,5 ml microtube met behulp van een 1 ml pipettip.
   Opmerking: In deze stap kunnen de embryo's ruwweg worden ingezet volgens morfologische criteria, waaronder de segmentatiepatronen van de cuticle en de structuren van het hoofd en de staart ⁹ . Tijdens de hoofdinvoltie, tussen 10 en 16 uur nadat de eieren zijn gelegd, ondergaat het embryo een uitgesproken reductie van het meest voorste segment ⁹ .
2. Was de embryo's eenmaal met 0,4 ml PBT oplossing en voeg 0,3 ml blokkerende oplossing (5% normaal geiten serum en 5% DMSO in PBT oplossing) toe.
3. Blok de embryo's gedurende 15 minuten met voeding bij RT.
4. Voeg 75 μl anti-Fasciclin II antilichaam toe en incubeer de buis gedurende de nacht gedurende de nacht met RT.
5. Was de embryo's 4 keer met 0,4 ml PBT-oplossing gedurende tenminste 20 minuten per was.
6. Voeg 0,3 ml blokkerende oplossing (5% normaal geiten serum in PBT-oplossing) met geit anti-muizen-HRP antilichaam (2 μg / ml) toe en incubeer de buis gedurende de nacht gedurende de nacht met koken.
7. Was de embryo's 6 keer met 0,4 ml PBT-oplossing gedurende tenminste 20 minuten per was.
8. Voeg 0,3 ml DAB oplossing toe aan de buis.
   VOORZICHTIG: Draag handschoenen en plaats alle DAB-afval / buizen / tips in bleekmiddel.
9. Voeg 2 μL 3% waterstofperoxide toe en incubateer de buis in het donker met aanraking bij RT totdat de gewenste hoeveelheid neerslag wordt geproduceerd.
   Opmerking: De incubatietijd voor 1D4 immunohistochemie in het algemeen varieert van 0,5-1 uur.
10. Was de embryo's 4 keer met 0,4 ml PBT-oplossing.
    VOORZICHTIG: Verwijder de DAB-oplossing en de eerste twee spoelt met een pipet en diVerstrooi ze in bleekmiddel.
11. Voeg 0,2 ml montage 70% glycerol / PBS oplossing aan de buis toe en berg bij RT of 4 ° C.
    Opmerking: Houd de buis weg van het licht. Duidelijke preparaten kunnen worden verkregen door de embryo's in een 90% glycerol / PBS-oplossing ^{10 te plaatsen} . Het is echter moeilijker om embryo's op te lossen in 90% glycerol / PBS-oplossing dan die welke zijn verwijderd in 70% glycerol / PBS-oplossing ¹⁰ .

6. Staging, Dissecting, Mounting en Imaging van de Embryo's (Dag 4)

1. Voor het plaatsen, verplaats de embryo's die met 70% glycerol / PBS worden geëquilibreerd op een glazen glijbaan.
2. Verzamel late-16 embryo's die abdominale segment 7 (A7), A8 en A9 ISN zenuwen hebben die samenkomen om elkaar aan te raken of / en midgut hebben die onderverdeeld is in drie banden.
   Opmerking: Embryo's gekleurd met 1D4 antilichaam kunnen worden opgesteld op basis van de projectiepatronen van ISN en ISNb motor axons. Na het verlaten van het CNS, A7, A8 en A9 ISN neRves van late stadium-16 embryo's convergeren om elkaar aan te raken en vervolgens af te wijken om ver naar de dorsale spieren te strengen (pijlkop in figuur 1A ). In mid-stadium-16 embryo's strekken de A7 ISN-zenuwen echter evenwijdig uit met A8 / A9 zenuwen (vierkante beugel in Figuur 1B ). Bovendien zijn de projectieassen van A6 ISNb-nen (loodrecht op de ventrolaterale spieren) in beide hemisegmenten ruwweg in lijn met het achterste uiteinde van de CNS longitudinale axonfasculaties (pijlen en een lijn in Figuur 1C ). Deze morfologische criteria variëren enigszins tussen verschillende genotypen. Alternatief kunnen embryo's worden georganiseerd op basis van darm morfologie ^{9 , 11} . Voorafgaand aan stadium 17 heeft de midgut een hartvormige vorm, terwijl de midgut in fase 17 ¹² is onderverdeeld in drie banden.
3. Dissect de embryo's.
   1. Met een 1 mL-spuit, verplaats elk embryo uit de glyceroldruppel en plaats het embryo ventraal-gezicht omhoog. Snijd het voorste gedeelte af op 1/4 van de lengte van het lichaam en het meest achterste gebied dat vrij is van motoraxons.
   2. Gebruik een naald sonde, verplaats het eindgesneden embryo uit de glyceroldruppel, rol om het dorsaal omhoog te oriënteren en plaats het horizontaal in het veld.
      Opmerking: als het embryo uit de glyceroldruppel wordt verplaatst, maakt een klein beetje glycerol geassocieerd met het embryo het kleverig.
   3. Knip het embryo langs de dorsale middenlijn met een enkele zeer fijne wolfraam naald ¹³ . Maak een kleine snede aan het achterste uiteinde van het embryo en ga dan verder met de dorsale middellijn naar de voorkant; Snijden in de tegenovergestelde richting is ook prima.
   4. Met behulp van een naald sonde beweegt u het middelste gesneden embryo in de glyceroldruppel, plaats het dorsaal omhoog en los de darm van de lichaamswand door elke lichaamswand in een ventrolaterale (diagonale) richting te ontvouwen (2.5X objectief).
      Opmerking: Zorg ervoor dat de dorsale middenlijn volledig is afgesneden, waardoor de volledige scheiding tussen de linker en rechter lichaamswanden optreedt.
   5. Zet het middelste snij embryo voorzichtig uit de glyceroldruppel en leg dan twee flaps van de lichaamswand op de glazen glijbaan met een fijne naald sonde (2,5x objectief).
   6. Verwijder de inwendige organen van het ontleed embryo door ze zacht te drukken (5X objectief) met behulp van een zeer fijne wolfraamnaald.
      Opmerking: een gedetailleerde beschrijving van een andere soortgelijke dissectieprocedure is te vinden op de website ⁵ .
4. Voor het monteren, voeg 2-3 μL 70% glycerol / PBS oplossing toe aan schoonmaken, ontleed embryo's en, met behulp van een fijne naald probe, overbrengen naar een nieuwe glazen glijbaan waarop 8 μL 70% glycerol / PBS oplossing is verspreid in Het centrum (2,5x objectief).
5. Zet een deksel (18 mm x 18 mm) aan. Verzegel de randen van de deklaag met regelmatige nagellak (ofwelDuidelijk of gekleurd is goed).
6. Vastleggen van beelden met een hoge resolutie (20X, 40X en 63X olie-immersiedoelstellingen) onder een DIC-lichtmicroscoop, volgens de instructies van de fabrikant.
   Opmerking: Beter visualisatie en fenotypische karakterisering, met name voor ISNb-motor axons, kan worden geproduceerd door gebruik te maken van een 63X olie-immersie doelstelling.

Results

Precieze verbindingen tussen motoraxonen en doelspieren tijdens neurale ontwikkeling zijn afhankelijk van selectieve axon-axonafstoting en doelherkenning bij specifieke keuzepunten ⁴ . In Drosophila wordt selectieve afstoting tussen motoraxons geregeld door de gecombineerde werking van de klassen 1 en 2 semaforen (Semas), waaronder Sema-1a, Sema-2a en Sema-2b ^{8 , 14 , ...}

Discussion

De details van motorische axon geleidingsdefecten worden sneller en met betere nauwkeurigheid gescoord door de gefiltreerde bereiding van DAB-gekleurde embryo's dan door laserscanning van confocale microscopie van fluorescent gelabeld. Daarom is de gefiltreerde bereiding van vaste en 1D4-gekleurde embryo's het beste geschikt voor de functionele karakterisering van geleidingscue moleculen. Vier belangrijke klassen van begeleidende signalen, waaronder netrins, Slits, semaforen (Semas) en ephrins, en hun verwante r...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	t-Octylfenoxypolyethoxyethanol
16% Paraformaldehyde Solution	Ted Pella	18505
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	30435
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	71500
X-Gal Substrate	US Biological	X1000	X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranosid galactopyranosid)
Dimethyl Sulfxide	Sigma-Aldrich	D4540
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	P9387
Potassium hexacyanoferrate(III)	Sigma-Aldrich	244023
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich	216763
3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride	Sigma-Aldrich	D5905
Agar	US Biological	A0930
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3
Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)	Sigma-Aldrich	H5501
Culture Dish (60 mm)	Corning	430166
Tricon Beaker	Simport	B700-100	Dit wordt gebruikt om een plastic bekerkooi voor embryo-collectie te maken.
Yeast	Societe Industrielle Lesaffre	Saf Instant Yeast Red
Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)	VWR	14220-263
Eppendorf Tube (1.5 ml)	Sarstedt	#72.690
Bleach	The Clorox Company	Clorox
Heptane	Sigma-Aldrich	246654
Methanol	J.T. Baker	UN1230
Normal Goat Serum	Life Technologies	16210-064
Anti-FasciculinII Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	1D4 anti-Fasciclin II
Goat Anti-mouse-HRP Antibody	Jackson Immunoresearch	115-006-068	AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Slide Glass	Duran Group	235501403
Coverslip	Duran Group	235503104	18 x 18 mm
1 ml Syringe	Becton Dickinson Medical(s)	301321
Tungsten Needle	Ted Pella	#27-11	Wolfraamdraad, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.)
Nutator (Mini twister)	Korean Science	KO.VS-96TWS	Alternatief, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)