Verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke Postmortem hersenen

Ian Diner; Tram Nguyen; Nicholas T. Seyfried

doi:10.3791/55835

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke Postmortem hersenen

12.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55835

⸱

24 oktober 2017

Ian Diner¹ , Tram Nguyen¹ , Nicholas T. Seyfried¹

¹Department of Biochemistry, Emory School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Een verkorte fractionering protocol voor de verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke postmortem hersenen wordt beschreven.

Samenvatting

In deze studie beschrijven we een afgekorte-voor-stapmodus fractionering protocol voor de verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke postmortem hersenen. De Ionische detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) lost effectief native gevouwen eiwitten in hersenweefsel waardoor de verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten uit een breed scala van neurodegeneratieve proteinopathies, zoals De ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson en Amyotrofische laterale sclerose en prionziekten. Menselijke controle en AD postmortem hersenen weefsels waren gehomogeniseerde en gesedimenteerd door ultracentrifugatie in aanwezigheid van sarkosyl te verrijken wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten met inbegrip van pathologische gefosforyleerd tau, de belangrijkste component van neurofibrillary klitten in AD. Westelijke bevlekken aangetoond de differentiële oplosbaarheid van geaggregeerde phosphorylated-tau en het wasmiddel-oplosbaar eiwit, vroege Endosome antigeen 1 (EEA1) in controle en AD hersenen. Proteoom analyse bleek ook verrijking van β-amyloid (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70 K), en apolipoproteïne E (beleidsverklaring) in de sarkosyl onoplosbare breuken van AD hersenen vergeleken met die van de controle, consistent met de vorige weefsel fractionering strategieën . Dit eenvoudige verrijking protocol is dus ideaal voor een breed scala aan experimentele toepassingen variërend van westelijke bevlekken en functionele eiwit co aggregatie testen tot massa spectrometrie gebaseerde proteomics.

Inleiding

Neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington (HD), Amyotrofische laterale sclerose (ALS) en de nauw verwante prionziekten worden gekenmerkt door de geleidelijke accumulatie van proteinopathies wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten in de hersenen met bijbehorende cognitieve achteruitgang. ¹ ^, ² deze gedeelde pathologische functie wordt beschouwd als een centrale rol in de etiologie en pathofysiologie van deze neurodegeneratieve ziekten. ² deze aggregaten bestaan meestal uit polymere amyloïde vezels, die zijn samengesteld uit herhalende eenheden van het misfolded eiwit tentoonstellen Kruis β-structuur. ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ biochemically, amyloïde aggregaten zijn zeer resistent tegen chemische of thermische denaturatie- en solubilisatie,³ , waarin een unieke uitdagingen voor hun zuivering, analyse en studie via traditionele biochemische technieken. ² ^, ⁵ ^, ⁶ ^, ⁷ ^, ⁸ ^, ⁹ ^, ¹⁰ ^, ¹¹ is niet verwonderlijk dat het wasmiddel onoplosbare eiwitoplossing is de focus van veel onderzoek naar de pathofysiologie van neurodegeneratieve ziekten waarbij de accumulatie van misfolded eiwitten. ⁶ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴

Biochemische fractionering technieken hebben vaak gebruikt om te verrijken het wasmiddel onoplosbare breuk van postmortem hersenen homogenates. ⁶ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ een van de meest voorkomende methoden omvat de sequentiële winning van weefsel homogenates met buffers en detergentia starheid, gevolgd door ultracentrifugatie te partitioneren van de oplosbare en onoplosbare breuken te verhogen. Een veelgebruikte sequentiële fractionering protocol⁶^,¹⁴ houdt de homogenisering van de bevroren weefselmonsters in een wasmiddel-vrije zoutarm (LS)-buffer en de resulterende onoplosbare pellets zijn dan sequentieel geëxtraheerd met buffers met hoog zout, niet-ionogene detergenten, hoge sacharose, zoals Ionische detergentia en tenslotte chaotropes ureum. ⁶ ^, ¹⁴ een voor de hand liggende nadeel van dergelijke een sequentiële fractionering protocollen is het flink wat tijd en arbeid inzet nodig om ze te voltooien. Waaronder de homogenisering en ultracentrifugatie, een typische vijf stappen fractionering protocol kan duren uren of zelfs dagen in beslag. ⁴ ^, ⁶ ^, ⁷ ^, ¹⁰ ^, ¹⁵ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ bovendien zoveel pathologische eiwit-aggregaten blijven onoplosbaar in alle, maar de zwaarste omstandigheden¹⁹^,²⁰ allermeest naar de gegenereerde breuken zijn van beperkte waarde. De minder strenge fractionering stappen met behulp van hoge concentraties van zout en niet-ionogene wasmiddelen zijn dus grotendeels overbodig.

Eerdere studies hebben aangetoond dat de Ionische detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) een uitstekende kandidaat is voor een vereenvoudigde-voor-stapmodus wasmiddel fractionering protocol is. ⁵ ^, ⁶ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ ^, ²¹ ^, ²² ^, ²³ als een denatureren wasmiddel, sarkosyl is streng genoeg zijn om de overgrote meerderheid van native gevouwen eiwitten in de hersenen solubilize zonder solubilizing misfolded eiwit-aggregaten samengesteld uit bèta-amyloid (Aβ),⁶^,¹¹gefosforyleerd tau (pTau),⁶ TAR DNA-bindende eiwit 43 (TDP-43),¹⁴ alpha-synuclein,¹²^,¹³ scrapie,²³ of U1 kleine nucleaire ribonucleoproteins (snRNP's U1) zoals U1 - 70 K. ⁵ ^, ²¹ ^, ²² Zoals sarkosyl is minder streng zijn dan de alomtegenwoordige anionogene detergentia natrium dodecyl sulfaat (SDS), behoudt het minder robuust oligomere vormen van misfolded eiwit-aggregaten die SDS behandeling niet kunnen weerstaan. ⁹

We beschreven eerder, een verkorte wasmiddel-fractionering protocol dat vergelijkbaar met de meer bewerkelijke sequentiële fractionering methodologieën resultaten. ⁵ door het weglaten van de minder strenge fractionering stappen, we konden een facile-voor-stapmodus fractionering protocol voor de verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van postmortem menselijke hersenen ontwikkelen. ⁵ dit gedetailleerde protocol hierin beschreven is geschikt voor een brede waaier van experimentele toepassingen variërend van het westelijke bevlekken en massa spectrometrie gebaseerde proteomics functioneel eiwit misfolding en aggregatie zaaien testen. ⁵ ^, ⁶ ^, ²¹

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

ethische verklaring: alle weefsels van de hersenen zijn verkregen van de Emory Alzheimer ' s Disease Research Center (ADRC) hersenen Bank. Postmortem menselijkeweefsels werden verworven onder juiste institutionele Review Board (IRB) protocollen.

1. homogenisering en fractionering

weefsel selectie
Opmerking: bevroren postmortem frontale cortex weefsel van gezonde controle (Ctl) en pathologisch bevestigde AD gevallen werden geselecteerd uit de Emory ADRC hersenen bank (n = 2). Post mortem neuropathologische evaluatie van amyloïde plaque verdeling werd uitgevoerd volgens het Consortium om een register voor Alzheimer ' s ziekte semi-kwantitatieve criteria ²⁴, scoren, hoewel neurofibrillary wirwar pathologie was beoordeeld overeenkomstig de Braak tijdelijke systeem. ¹⁶
1. verkrijgen bevroren postmortem hersenweefsel van gezonde controle (Ctl) en pathologisch bevestigde gevallen van het AD. Gebruik makend van containers van droogijs, pincet en een scheermesje, accijnzen ~ 250 mg gedeelten van grijze stof uit elk weefsel monster op getarreerde wegwerp wegen boten, verzorgen om te voorkomen dat het weefsel ontdooien. Het gewicht van elk stuk te worden gehomogeniseerd.
2. Accijnzen ~ 250 mg van grijze stof via pincet en messcherp visueel inspecteren om te zoeken van de intermediair tussen de buitenste grijze stof en innerlijke witte stof. Vermijd witte stof en nog belangrijker, een grote bloedvaten of bloedige regio's, hersenvliezen of arachnoideavilli mater. Houden van het weefsel door te snel werken en regelmatig wegen boot met hersenweefsel in polystyreen containers met droge ice. tijdens het snijproces bevroren
3. Record het exacte gewicht van grijze stof weggesneden uit elke bevroren stuk met behulp van een analytische balans. Berekenen van het volume voor zoutarm (LS) buffer (zie tabel 1) nodig voor de homogenisering van de dounce (5 mL/g of 20% w/v).
4. Bereiden 10 mL LS-buffer met 1 x protease en phosphatase remmer cocktail en chill op ice.
5. Verwijder gewogen weefsel en wegende boot van droogijs en dobbelstenen in ongeveer 2 x 2 mm stukken als het ontdooit. Overbrenging naar een vooraf gekoeld dounce homogenizer tube van 2 mL op ice.
6. Voeg toe 5 mL/g (20% w/v) van de ijskoude zoutarm (LS) buffer met 1 X protease en phosphatase remmer cocktail.
7. Homogenize het hersenweefsel op ijs met behulp van ongeveer 10 slagen van hoge klaring stamper A en 15 lijnen van lage klaring stamper B.
8. Alle homogenaat overbrengen in een polypropyleen tube van 2 mL, met behulp van een glazen pipet van Pasteur. Label van de buis met “ TH ” (totale homogenaat), het weefsel kast nummer, en homogenaat volume. Aliquot 0.8 mL in een gelabelde 1,5 mL-buis. Eventuele overtollige homogenaat kunnen ook aliquoted en opgeslagen bij -80 ° C.
9. Aan elke 0.8 mL aliquoot, toevoegen 100 µL van 5 M NaCl en 10% (m/v) sarkosyl aan concentraties van 0,5 M en 1% w/v, respectievelijk. Meng buizen goed door inversie en incubeer op ijs voor 15 min. Label buizen met " TH-S " (totale homogenaat-Sarkosyl) om aan te geven dat de homogenates in sarkosyl-buffer (tabel 1).
10. Bewerk ultrasone trillingen ten elke buis voor drie 5 s pulsen bij 30% amplitude op ijs (maximale intensiteit = 40%) met behulp van een microtip-sonde.
11. bepalen de eiwit-concentratie van de homogenates met behulp van het bicinchoninic zuur (BCA) assay ²⁵ methode.
  Opmerking: De gemiddelde eiwitconcentratie van TH-S homogenates voorbereid op een 5 mL LS per gram weefsel is 15-20 mg/mL. De homogenates kan worden gefractioneerde onmiddellijk of opgeslagen bij-80 ° C tot gebruik.
12. Verdund TH-S homogenates tot 10 mg/mL ijskoud sark buffer (tabel 1) met 1 x protease en phosphatase inhibitors.
13. Transfer 5 mg proteïne (0,5 mL) van elke TH-S homogenaat in 500 µL polycarbonaat ultracentrifuge buizen en paar-evenwicht met sark-buffer. Buizen in een vooraf gekoeld rotor en de ultracentrifuge bij 180.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C. overdracht de sarkosyl oplosbare supernatant (S1) 1,5 mL buizen laden en opslaan bij -80 ° C.
  Opmerking: (Optionele wash) toevoegen 200 µL van sark-buffer naar de ultracentrifuge buizen waarin het wasmiddel onoplosbare breuken (P1) en het verjagen van de pellets (P1) vanaf de onderkant van de ultracentrifuge buizen met behulp van een pipet tip van 200 µL.
14. Kort pulse-spin de omgekeerde buizen voor 2-3-s (≤ 2500 x g) op een microcentrifuge de pellets (P1) en de buffer overbrengen naar de 1,5 mL tubes hieronder. Resuspendeer de onoplosbare pellets (P1) in de sark-buffer door pipetteren omhoog en omlaag om ervoor te zorgen de pellet is verstoord.
15. Paar-evenwicht en centrifuge op 180.000 x g voor een extra 30 min bij 4 ° C.
16. Verwijder de optionele wassen supernatant (S2) en Incubeer de sarkosyl onoplosbare pellets (P2) in 50-75 µL van ureum buffer (tabel 1) met 1 x plaatje (protease en phosphatase remmer cocktail) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur laten solubilize de pellet.
  Opmerking: Warme ureum buffer tot kamertemperatuur alvorens gebruik te vermijden van SDS neerslag. Voor wasmiddel-gevoelige toepassingen, SDS uit ureum buffer weglaten en overwegen de onoplosbare pellet (P2) wassen in laag zout buffer vóór de resuspending in ureum buffer.
17. Overboeken van de geresuspendeerde pellets (P2) 0,5 mL buizen en met korte (1 s) microtip ultrasoonapparaat bij 20% amplitude (maximale intensiteit = 40%) tot volledig solubilize van de pellets.
18. Bepalen de concentraties van de eiwitten van de sarkosyl oplosbare (S1) en onoplosbare (P2) fracties met behulp van de BCA assay methode. Deze fracties onmiddellijk gebruik of Bewaar bij-80 ° C tot gebruik of.

2. Immunoblotting

westelijke bevlekken
Opmerking: westelijke bevlekken werd uitgevoerd volgens de procedures van de eerder gemelde met lichte wijzigingen. ⁵ ^, ¹⁰
1. bereiden 40 µg monsters van totale homogenates (TH-S), sark-oplosbare (S1) en sark onoplosbare (P2) breuken in 1 X Laemmli SDS-pagina monster buffer met pH 7 van de TCEP van de 5 mM. Incubeer monsters bij 95 ° C gedurende 5 min.
2. Load monsters op een geprefabriceerd 10-well 4-12% Bis-Tris SDS-pagina gel. Electrophorese op 80 V voor de eerste centimeter (10 min) en 120 V voor de rest (60 min) of tot de tracking-kleurstof de onderkant van de gel bereikt.
3. Kunt een verse scheermesje en gel mes split-open de voorgegoten gel-cassette. Zachtjes weg knippen de kammen en de onderkant van de gel met een frisse scheermesje.
4. Resuspendeer de onoplosbare pellets (P1) in 200 µl sark-buffer met 1 x PIC door pipetteren op en neer.
5. Overdracht naar een membraan van 0,2 µm nitrocellulose een Bevlekkende machine met behulp van een van de droge overdrachtmethode (Zie de tabel van de materialen).
6. Blokkeren het membraan in de blokkeerbuffer (BB) zonder Tween 20 voor 30 min, volgde met BB met 0,05% Tween-20 (BB/T) voor 30 min. Spoel na het blokkeren, het membraan in TBS/T (0,1% Tween 20) voor 5 min voor het verwijderen van overtollige blokkeerbuffer.
7. Voorbereiden 1:1,000 verdunningen van het pT231 van de primaire antilichamen, Tau-2 (pan tau), AT8 en EEA1 in BB/T (0,05% Tween 20).
8. Broeden de membranen in primair antilichaam oplossing 's nachts bij 4 ° C met circulaire agitatie. Spoel het membraan in TBS/T voor 3 x 15 min.
9. Sonde het membraan met een verdunning van de 1:20,000 van de fluorescently-label in de buurt van-IR secundair antilichaam in BB/T gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur in duisternis op shaker. Spoel het membraan voor 3 x 10 min in TBS/T en 2 x 5 min in eetlepels
10. Scannen het membraan met behulp van een infrarood imaging systeem bij de juiste excitatie golflengte (b.v. 700 nm (rode kanaal) voor infrarood kleurstof 680 geit anti-muis IgG (H + L) secundaire en 800 nm (groene kanaal) voor infrarood kleurstof 790 ezel anti-konijn IgG (H + L ) secundaire).
11. De imaging software gebruiken om te kwantificeren signaal intensiteit en het uitvoeren van densitometrie metingen volgens de fabrikant ' s instructies, zorgen voor auto-achtergrond instellen is ingesteld op het gemiddelde van de gehele achtergrond.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De verkorte-voor-stapmodus sarkosyl-fractionering-protocol is gebruikt voor het verrijken van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van controle en AD postmortem hersenen (Figuur 1). Eiwitten uit TH-S, S1, S2 en P2 breuken werden opgelost door SDS-PAGE, vaste gedurende 15 min. in Coomassie blue kleefpoeders buffer gevolgd door zachte vlekken met Coomassie briljant blauw G-250 kleuring buffer. De resuspensie stap is optioneel, omdat er niet detecteerbaar nive...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hierin we introduceren en bespreken van een verkorte-voor-stapmodus wasmiddel-fractionering protocol dat is van toepassing op een breed scala aan experimentele toepassingen variërend van proteomics massa spectrometrie gebaseerde analyse tot functionele eiwit misfolding testen en westelijke bevlekken. ⁵ ^, ⁶ ^, ⁷ ^, ¹⁰ deze methodologie is misschien wel de meeste effectieve wanneer gebruikt bij het...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs danken Drs. Jim Lah en Allan Levey, Emory afdeling Neurologie, voor nuttige opmerkingen en suggesties. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de versnelde geneeskunde partnerschap grant (U01AG046161-02), the Emory Alzheimer's Disease Research Center (P50AG025688) en een National Institute on Aging toekennen (R01AG053960-01) N.T.S. Dit onderzoek werd ook gedeeltelijk gesteund door de Neuropathologie kern van de Emory Neuroscience NINDS Core faciliteiten subsidie, P30NS055077.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X)	Thermo Fisher	78441	protease & phosphatase inhibitor cocktail
Sonic Dismembrator System (ultrasonicator)	Fisher Scientific	FB505110	microtip ultrasonicator
Optimax TLX Ultracentrifuge	Beckman Coulter	361545	gekoelde ultracentrifuge
TLA120.1 rotor	Beckman Coulter	362224	ultracentrifuge rotor
500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwall	Beckman Coulter	343776	ultracentrifuge buizen voor TLA120.1 rotor
4X SDS sample buffer	Zelfgemaakt	N/A	SDS-PAGE
TCEP solution, neutral pH	Thermo Fisher	77720	reducerend middel
(TBS) blocking buffer	Thermo Fisher	37542	blocking buffer
(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20	Thermo Fisher	37543	blocking buffer en antilichaamverdunningsmiddel
4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well	Thermo Fisher	NW04120BOX	gegoten SDS-PAGE gels
MES SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fisher	B0002	SDS-PAGE running buffer
N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)	Sigma Aldrich	L5777-50G	detergens
Anti-Tau-2 (pan tau) antibody	Chemicon	MAB375	antilichamen
Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody	Millipore	MAB5450	antilichamen
Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8)	Thermo Fisher	MN1020	antilichamen
Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody	abcam	ab2900	antilichamen
Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	Thermo Fisher	A21058	antilichamen
Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody	Thermo Fisher	A11374	antilichamen
iBlot2 Dry Blotting System	Thermo Fisher	IB21001	Gel transfer
iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini	Thermo Fisher	IB23002	Gel transfer

Referenties

Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991(1991).
Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).
Hamley, I. W. The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization. Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).
Diner, I., et al. Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease. J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).
Gozal, Y. M., et al. Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease. J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).
Hales, C. M., et al. Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression. PROTEOMICS. , (2016).
Julien, C., Bretteville, A., Planel, E. Amyloid Proteins: Methods and Protocols. Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. , Humana Press. 473-491 (2012).
Nizhnikov, A. A., et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE. 9 (12), e116003(2014).
Seyfried, N. T., et al. Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards. J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).
Woltjer, R. L., et al. Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease. FASEB J. , (2005).
Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments. J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).
Hasegawa, M., et al. Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions. J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).
Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130(2006).
Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association. FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).
Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
Noguchi, A., et al. Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains. J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).
Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).
Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid. J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).
Yang, L. -S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis. J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).
Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
Hales, C. M., et al. U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21. Mol Neurodegener. 9 (1), 15(2014).
Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
Guo, J. L., et al. Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice. J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).
Matveev, S. V., et al. A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain. J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Sarkosyl fractionering ultracentrifugeringsprotocol Western blot analyse proteomische analyse verrijking van gefosforyleerd tau neurodegeneratieve prote nopathie n BCA assaymethode infrarood beeldvormingssysteem

Verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke Postmortem hersenen