Methodenartikel

Neuro evaluaties in een muismodel van neonatale hypoxische ischemische hersenletsel

11.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55838

⸱

24 november 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department and Research Institute of Rehabilitation Medicine, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 PLUS Project for Medical Science, Yonsei University, 3Department of Rehabilitation Medicine, Yonsei University Wonju College of Medicine, 4Rehabilitation Institute of Neuromuscular Disease, Yonsei University College of Medicine, 5Graduate Program of NanoScience and Technology, Yonsei University

In dit artikel

Samenvatting

Wij unilaterale halsslagader occlusie uitgevoerd op postnatale dag 7-10 CD-1 pups om een neonatale hypoxische ischemische (HI) model te maken van de muis en onderzocht de effecten van HI hersenletsel. We studeerde neuro functies in deze muizen in vergelijking met normale muizen niet bediende.

Samenvatting

Wij unilaterale halsslagader occlusie uitgevoerd op CD-1 mice maken een neonatale hypoxische ischemische (HI) model en onderzocht de effecten van neonatale HI hersenletsel door het bestuderen van de neuro-functies in deze muizen in vergelijking met niet-bediende (dat wil zeggen, normale) muizen. Tijdens de studie, was Rice-Vannucci methode gebruikt voor het opwekken van neonatale HI hersenenschade postnatale dag 7-10 (P7-10) muizen. De HI-operatie werd uitgevoerd op de pups door eenzijdige halsslagader afbinding en blootstelling aan hypoxie (8% O2 en 92% N2 voor 90 min). Een week na de operatie het beschadigde brein werden geëvalueerd met het blote oog door de semi-transparante schedel en werden ingedeeld in subgroepen op basis van de afwezigheid ("geen corticale schade" groep) of aanwezigheid ("corticale schade" groep) van de corticale schade, zoals een laesie in de rechter hersenhelft. Op week 6, de volgende neuro-tests werden uitgevoerd om te evalueren van de cognitieve en motorische functies: passieve vermijden taak (PAT), ladder lopen, en greep kracht test. Deze gedrags tests zijn nuttig bij het bepalen van de effecten van neonatale HI hersenletsel en worden gebruikt in andere Muismodellen van neurodegeneratieve ziekten. In deze studie toonde neonatale HI hersenen letsel muizen motor tekorten die overeenkwam met de rechter hersenhelft schade. De gedrags testresultaten zijn relevant voor de tekortkomingen die waargenomen in menselijke neonatale HI patiënten, zoals cerebrale parese of neonatale beroerte-patiënten. In deze studie was een muismodel van neonatale HI hersenenverwonding opgericht en toonde verschillende graden van motorische tekorten en cognitieve stoornissen in vergelijking met niet-bediende muizen. Dit werk geeft basisinformatie op de HI muismodel. MRI beelden tonen de verschillende fenotypes, gescheiden naargelang van de ernst van de schade aan de hersenen door motorische en cognitieve testen.

Inleiding

Neonatale HI hersenletsel optreedt tijdens de vroege kinderjaren (ongeveer twee patiënten per 1000 kinderen)1,2,3,4,5. Studies over neonatale HI hersenletsel zijn belangrijk, en met behulp van een gevestigde neonatale HI hersenen letsel muismodel in vivo preklinisch onderzoek naar HI hersenletsel kan vergemakkelijken.

Traditionele HI modellen worden op volwassen ratten6gebruikt. Voor het model van de pasgeborene, is de rijst-Vannucci-methode gebruikte P7 ratten7,en8. Echter, aangezien ratten en muizen iets anders9,10, zijn ook al zijn ze beide knaagdieren, wij uitgevoerd een gemodificeerde rijst-Vannucci methode op CD-1 pups op P7-10, op basis van eerdere studies die hebben aangetoond dat P7-10 de periode is met onrijpe oligodendrocyten, overeenkomt met menselijke term P011,12. De neonatale muismodel van HI is opgericht door zowel de afbinding van de unilaterale halsslagader en de blootstelling van de muizen aan hypoxie met 8% zuurstof in P7-10 pups.

De muizen onderworpen aan de procedure verschillende graden van hersenletsels toonde op het gebied van de posterolateral van de rechter hersenhelft. Ter identificatie van de cognitieve en motorische tekorten, neuro-beoordeling op basis van de PAT, werden ladder lopen, en greep kracht test uitgevoerd. De verschillen tussen niet-bediende (dat wil zeggen, normale) en HI muizen werden geanalyseerd. Dit werk bevat basisinformatie over de muismodel van HI. De MRI-beelden tonen de verschillende fenotypes, gescheiden naargelang van de ernst van hersenbeschadigingen met behulp van motorische en cognitieve testen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dieren gehuisvest waren in een standaard kooi (27 × 22,5 × 14 cm3) in een faciliteit geaccrediteerd door de vereniging voor de beoordeling en de accreditatie van Laboratory Animal Care (AAALAC) en eten gegeven en water ad libitum onder afwisselend 12-h licht/donker cycli. De auteurs dierenbeschermingsvoorschriften gevolgd, en de experimentele procedures werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Yonsei University College of Medicine (IACUC No. 2010-0252; 2013-0220).

1. muismodel van neonatale HI hersenletsel

  1. Anesthetize de pups met Isofluraan.
    1. De pups (minder dan 5) in een anesthetizing doos plaatsen en sluit het deksel.
    2. Inschakelen van het anesthetizing stelsel van ongeveer 15 min; de gas en Isofluraan met behulp van een machine van de bovenste verdoving tabel aanpassen. Aanpassen van de zuurstof debietmeter aan 1,5 L/min. aanpassen de Isofluraan vaporizer tot 3-5% voor de inductie van de anesthesie.
    3. Na 15 min, pas de Isofluraan vaporizer tot 1-2% voor het onderhoud van anesthesie.
  2. Leg een volledig narcose pup onder een Microscoop dissectie (buik geconfronteerd met de onderzoeker) en veilig met tape.
  3. Maak een incisie ~0.7-mm in de nek met behulp van gesteriliseerde schaar.
  4. Zorgvuldig verwijderen van het vetweefsel gesteriliseerde pincet gebruiken en het eenzijdige recht halsslagader blootstellen.
  5. De eenzijdige recht halsslagader met een 5-0 absorbeerbare hechtdraad afbinden.
  6. Sutuur (geologie) de incisie in de nek met 5-0 hechtdraad.
  7. Plaats elke pup in een warme hypoxische kamer 37 ° C gedurende 1 uur voor herstel. Sluit het deksel van de kamer niet.
  8. 1 h na de operatie, wanneer de pups zijn volledig wakker, sluit het deksel van de kamer hypoxie en verlagen de niveaus van het gas om hypoxische scheppen (8% O2 en 92% N-2).
  9. Na 90 min van hypoxie, terugkeren u de pups naar hun kooien.
  10. Een week na de HI hersenletsel, herhaalt u stap 1.
    1. Na de narcose, maak een incisie in de hoofdhuid met een gesteriliseerde schaar en pincet te identificeren van de laesie van de hersenen op het gebied van de posterolateral van de rechter hersenhelft.
      Opmerking: Deze behandeling induceert hypoxie in pups. De aanwezigheid en omvang van hersenletsel in alle muizen wordt visueel beoordeeld met het blote oog door de semi-transparante schedel. Zoals bepaald door de grootte of het volume van de verkleuring (dat wil zeggen, de laesie van de hersenen), worden pups ingedeeld in groepen. Als er geen zichtbare corticale schade, wordt de muis ingedeeld in de groep "geen corticale schade". Als er een zichtbare corticale schade (dat wil zeggen, een laesie in de rechter hersenhelft), wordt de muis ingedeeld in de groep "corticale schade". Omdat de indeling van de muizen in groepen gebeurt één week na de operatie, kunnen de groeperingen worden gewijzigd wanneer de morphologies van de hersenen monsters duidelijk zijn ten tijde van offer1,2,3omschreven moeten, 4.

figure-protocol-1
Figuur 1: Modelleren van neonatale HI hersenletsel in muizen.
(A) een zeven-dagen oude muis pup geopereerd, en het eenzijdige recht halsslagader werd afgebonden. (B) pups werden geplaatst in een hypoxische kamer voor 90 min met 8% O2 en 92% N2. (C, D en E) De hersenen met neonatale HI blessure toonde verschillende ernst van de schade en werden gecategoriseerd op basis van de mate van schade. Week 14, de hersenen werden verkregen en de letsels werden gevisualiseerd. (C) Image van een hersenen geclassificeerd als een "geen corticale schade". Beide (D) en (E) waren ingedeeld in de groep "corticale schade". (F, G en H) Representatieve MRI van (C), (D) en (E) muizen, respectievelijk. (F) de schade in de hippocampus wordt aangeduid met een gele pijl en letsels in de rechter hersenhelft worden ook aangegeven met gele pijlen (G en H). Schaal bars = 1 mm Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

2. de neonatale gedrags Tests

Opmerking: Hier, de gedrags tests werden uitgevoerd op 6 weken leeftijd.

  1. De taak van de passieve vermijden.
    Opmerking: Om te beoordelen op basis van leren en het vermijden van een aversieve stimulus geheugenfunctie, moet een twee-compartiment stap-door PAT transiënte13,14,15,16.
    1. Plaats een muis in de heldere compartiment van het Plexiglas shuttle vak (41.5 × 21 × 35 cm3) van PAT apparatuur.
    2. Na 30 s, de guillotine deur open en neem de latentie tijd voor de muis te bewegen in het donker compartiment (maximaal 300 s).
    3. Sluit de deur van de guillotine als alle vier de ledematen van de muis volledig in de donkere compartiment bent.
    4. Elektrische voet schok (0,5 mA) voor 2 s en terugkeren de muis naar zijn kooi.
    5. Vervang de muis in de heldere compartiment 24u na de schok van de elektrische voet.
    6. Open de guillotine deur 10 s nadat de muis is volledig in het heldere compartiment geplaatst, en neem de latentie tijd voor de muis te bewegen in het donker compartiment (maximaal 300 s).
  2. Ladder lopen test.
    Opmerking: De ladder rung wandelen taak maakt het mogelijk voor de discriminatie tussen subtiele verstoringen van motor functie door combineren kwalitatieve en kwantitatieve analyses van geschoolde lopen17,18.
    1. Zet een video camera.
    2. Plaats de muis op het paneel van de start van de ladder en onmiddellijk beginnen met opnemen.
    3. Vastleggen van de video, zich te concentreren op de ledematen van de muis.
    4. Opname stoppen wanneer de muis het laatste deelvenster van de ladder raakt. Herhaal de reis heen-en-weer vier keer.
    5. Analyseren van de video-opname en handmatig tellen het aantal stukjes elke voorpoot, als volgt:
      1. Spelen met het opnemen van de video op een computer met een trage snelheid (0.1 x) en de stappen handmatig tellen.
  3. Grip sterkte test.
    Opmerking: De grip sterkte-test wordt uitgevoerd met behulp van een greep kracht meter, waaronder een push-pull rekstrookje.
    1. De greep kracht apparatuur op een acryl panel vast te stellen.
    2. Plaatst u een muis op het acryl paneel en houdt van zijn staart.
      1. Beweeg de hand met de staart, zodat de muis kan bereiken en greep de metalen draad van het apparaat.
    3. Toestaan dat meerdere proeven totdat de muis greep een driehoekig stuk metalen draad (2 mm diameter); de piekkracht is het automatisch geregistreerd in gram van de apparatuur.
      Opmerking: Gebruik de gemiddelde piekkracht van drie proeven voor analyse19,20,21.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Alle gegevens zijn uitgedrukt in de gemiddelde ± standaardafwijking van het gemiddelde (SEM). De vergelijking van variabelen tussen de twee groepen werd uitgevoerd met behulp van een onafhankelijke of gepaarde t-test op PASW statistics-software. Een p-waarde < 0.05 werd beschouwd als een statistisch significant.

De hersenen met neonatale HI blessure toonde verschillende ernst van de schade en dienovereenkomstig...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In deze studie, we geïnduceerde HI hersenletsel in een neonatale P7-10 CD-1 muis en geïdentificeerd de laesie van de hersenen met relevante cognitieve en motorische tekorten. Tijdens deze procedure was occlusie van de eenzijdige recht halsslagader kritisch. In deze stap kan de slagader worden beschadigd en gescheurd. De meeste pups die een slagader traan ervaren stierf. Omgekeerd, als onderzoekers een ander bloed ader in plaats van de eenzijdige recht halsslagader afgebonden, de hersenen van de pup was slechts licht besc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door subsidies van de National Research Foundation (NRF-2014R1A2A1A11052042; 2015M3A9B4067068), het ministerie van wetenschap en technologie, Republiek Korea, het Koreaanse Health Technology R & D Project (HI16C1012), ministerie van volksgezondheid & Welzijn, Republiek Korea, en de "Dongwha" faculteit onderzoek Assistance Program van Yonsei University College of Medicine (6-2016-0126).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Hypoxic chamberJeung Do Bio & Plant CoExperimentele Bouwer
PAT apparaatJeung Do Bio & Plant CoExperimentele Bouwer
De ladder sprongenJeung Do Bio & Plant CoExperimentele Bouwer
SDI Grip Strength SystemSan Diego Instruments Inc.
Grip-Strength MeterUgo Basile47200
Harvard Apparatus Fluovac verdovingssysteemHarvard Apparatus
Verdovingsboxacryl box
I-Fran Liquid (Isofluoraan)Hana Pharm. Co., Ltd.Algemene Verdoving ( isofluraan 100ml)
CD-1 muizenOrient Co., Ltd.
Blauwe Nylon Mono Niet-Absorbeerbare hechting 5-0 50cmAilee Co., Ltd.NB 521
IBM SPSS StatisticsIBMVer. 23

Referenties

  1. Yager, J. Y. Animal models of hypoxic-ischemic brain damage in the newborn. Semin Pediatr Neurol. 11 (1), 31-46 (2004).
  2. Vannucci, R. C., et al. Rat model of perinatal hypoxic-ischemic brain damage. J Neurosci Res. 55 (2), 158-163 (1999).
  3. Im, S. H., et al. Induction of striatal neurogenesis enhances functional recovery in an adult animal model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Neuroscience. 169 (1), 259-268 (2010).
  4. Clowry, G. J., Basuodan, R., Chan, F. What are the Best Animal Models for Testing Early Intervention in Cerebral Palsy? Front Neurol. 5 (258), 1-17 (2014).
  5. Colver, A., Fairhurst, C., Pharoah, P. O. Cerebral palsy. Lancet. 383 (9924), 1240-1249 (2014).
  6. Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am J Pathol. 36, 1-17 (1960).
  7. Rice 3rd, J. E., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Ann Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).
  8. Lafemina, M. J., Sheldon, R. A., Ferriero, D. M. Acute hypoxia-ischemia results in hydrogen peroxide accumulation in neonatal but not adult mouse brain. Pediatr Res. 59 (5), 680-683 (2006).
  9. Brazel, C. Y., Rosti 3rd, R. T., Boyce, S., Rothstein, R. P., Levison, S. W. Perinatal hypoxia/ischemia damages and depletes progenitors from the mouse subventricular zone. Dev Neurosci. 26 (2-4), 266-274 (2004).
  10. Buono, K. D., et al. Mechanisms of mouse neural precursor expansion after neonatal hypoxia-ischemia. J Neurosci. 35 (23), 8855-8865 (2015).
  11. Rumajogee, P., Bregman, T., Miller, S. P., Yager, J. Y., Fehlings, M. G. Rodent Hypoxia-Ischemia Models for Cerebral Palsy Research: A Systematic Review. Front Neurol. 7 (57), 1-20 (2016).
  12. Hagberg, H., Peebles, D., Mallard, C. Models of white matter injury: comparison of infectious, hypoxic-ischemic, and excitotoxic insults. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 8 (1), 30-38 (2002).
  13. Wi, S., Yu, J. H., Kim, M., Cho, S. R. In Vivo Expression of Reprogramming Factors Increases Hippocampal Neurogenesis and Synaptic Plasticity in Chronic Hypoxic-Ischemic Brain Injury. Neural Plast. 2016 (2580837), 1-11 (2016).
  14. Lu, Y., Christian, K., Lu, B. BDNF: a key regulator for protein synthesis-dependent LTP and long-term memory? Neurobiol Learn Mem. 89 (3), 312-323 (2008).
  15. Manabe, T., et al. Facilitation of long-term potentiation and memory in mice lacking nociceptin receptors. Nature. 394 (6693), 577-581 (1998).
  16. Alonso, M., et al. BDNF-triggered events in the rat hippocampus are required for both short- and long-term memory formation. Hippocampus. 12 (4), 551-560 (2002).
  17. Seo, J. H., et al. In Situ Pluripotency Factor Expression Promotes Functional Recovery From Cerebral Ischemia. Mol Ther. 24 (9), 1538-1549 (2016).
  18. Kim, M. S., et al. Environmental enrichment enhances synaptic plasticity by internalization of striatal dopamine transporters. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (12), 2122-2133 (2015).
  19. Lee, M. Y., et al. Alteration of synaptic activity-regulating genes underlying functional improvement by long-term exposure to an enriched environment in the adult brain. Neurorehabil Neural Repair. 27 (6), 561-574 (2013).
  20. Rha, D. W., et al. Effects of constraint-induced movement therapy on neurogenesis and functional recovery after early hypoxic-ischemic injury in mice. Dev Med Child Neurol. 53 (4), 327-333 (2011).
  21. Chong, H. J., Cho, S. R., Jeong, E., Kim, S. J. Finger exercise with keyboard playing in adults with cerebral palsy: A preliminary study. J Exerc Rehabil. 9 (4), 420-425 (2013).
  22. Chong, H. J., Cho, S. R., Kim, S. J. Hand rehabilitation using MIDI keyboard playing in adolescents with brain damage: a preliminary study. NeuroRehabilitation. 34 (1), 147-155 (2014).
  23. Seo, J. H., Yu, J. H., Suh, H., Kim, M. S., Cho, S. R. Fibroblast growth factor-2 induced by enriched environment enhances angiogenesis and motor function in chronic hypoxic-ischemic brain injury. PLoS One. 8 (9), e74405(2013).
  24. Washington, P. M., et al. The effect of injury severity on behavior: a phenotypic study of cognitive and emotional deficits after mild, moderate, and severe controlled cortical impact injury in mice. J Neurotrauma. 29 (13), 2283-2296 (2012).
  25. Cho, S. R., et al. Astroglial Activation by an Enriched Environment after Transplantation of Mesenchymal Stem Cells Enhances Angiogenesis after Hypoxic-Ischemic Brain Injury. Int J Mol Sci. 17 (9), 1-15 (2016).
  26. Tsuji, M., et al. A novel reproducible model of neonatal stroke in mice: comparison with a hypoxia-ischemia model. Exp Neurol. 247, 218-225 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Unilaterale ligatie van de halsslagaderpassieve vermijdingsopdrachtladderlooptestgrijpkrachttestMRI beeldvormingbeoordeling van corticale letselshippocampaal letselmotorische tekorten

Gerelateerde artikelen