Hier presenteren wij een protocol voor het opnemen van ritmische neuronale netwerk theta en gamma oscillaties vanuit een geïsoleerde hele hippocampale voorbereiding. We beschrijven de experimentele stappen van extractie van de hippocampus naar details van veld-, eenheids- en hele-cel patch-klemopnamen, evenals optogenetische stimulatie van het theta ritme.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dit protocol beschrijft de procedures voor het opstellen en opnemen van de geïsoleerde gehele hippocampus, van WT en transgene muizen, samen met recente verbeteringen in methodologieën en toepassingen voor de studie van theta-oscillaties. Een simpele karakterisering van het geïsoleerde hippocampale preparaat wordt gepresenteerd waarbij de relatie tussen interne hippocampale theta-oscillators samen met de activiteit van pyramidale cellen en GABAergische interneuronen van de cornu ammonis-1 (CA1) en subiculum (SUB) gebieden wordt onderzocht. In het algemeen tonen we aan dat de geïsoleerde hippocampus in vitro intrinsieke theta-oscillaties kan opwekken en dat ritmiciteit die in de hippocampus wordt gegenereerd, nauwkeurig gemanipuleerd kan worden door optogenetische stimulatie van parvalbumine-positieve (PV) interneuronen. De in vitro geïsoleerde hippocampale voorbereiding biedt een unieke kans om gelijktijdige veld- en intracellulaire patch-klemopnamen te gebruiken van visueel geïdentificeerd neuRons om de mechanismen van de theta ritme generatie beter te begrijpen.
Inleiding
Hippocampale theta-oscillaties (4-12 Hz) behoren tot de meest overheersende vormen van ritmische activiteit in de zoogdierbrein en worden geacht belangrijke sleutelrol te spelen in cognitieve functies zoals de verwerking van spatiotemporale informatie en de vorming van episodische herinneringen 1 , 2 , 3 . Terwijl verscheidene in vivo studies die de relatie van theta-gemoduleerde plaatscellen met ruimtelijke navigatie- en letselstudies beklemtonen, evenals klinisch bewijs, ondersteunen het standpunt dat hippocampale theta-oscillaties betrokken zijn bij geheugenvorming 4 , 5 , 6 , de mechanismen Bij de opwekking van hippocampale theta-oscillaties worden nog steeds niet volledig begrepen. Vroege in vivo onderzoeken suggereerden dat theta activiteit voornamelijk afhankelijk was van extrinsieke oscillators, in het bijzonder ritmische invoerVan afferente hersenstructuren zoals de septum en entorhinaire cortex 7 , 8 , 9 , 10 . Een rol voor intrinsieke factoren - interne connectiviteit van hippocampale neurale netwerken, samen met de eigenschappen van hippocampale neuronen - werd ook gepostuleerd op basis van in vitro waarnemingen 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Echter, afgezien van enkele landmarkstudies 19 , 20 , 21 , moeilijkheden bij het ontwikkelen van benaderingen die fysiologisch realistische populatieactiviteiten kunnen repliceren in eenvoudige in vitro- snijbereidingS hebben langdurig gedetailleerd experimenteel onderzoek van de intrinsieke capaciteiten van de hippocampus en aanverwante gebieden vertraagd om theta-oscillaties zelf te genereren.
Een belangrijk nadeel van de standaard in vitro thin-slice experimentele instelling is dat de 3D-cellulaire en synaptische organisatie van hersenstructuren gewoonlijk wordt gecompenseerd. Dit betekent dat veel vormen van gecoördineerde netwerkactiviteiten die zijn gebaseerd op ruimtelijk verdeelde celsamenstellingen, variërend van gelokaliseerde groepen (≤1 mm radius) naar populaties van neuronen die zich verspreiden over een of meer hersengebieden (> 1 mm) niet kunnen worden ondersteund. Gezien deze overwegingen was een ander soort aanpak nodig om te bestuderen hoe theta-oscillaties zich in de hippocampus voordoen en zich verspreiden naar verwante corticale en subcortische uitvoerstructuren.
In de afgelopen jaren is de initiële ontwikkeling van de "complete septo-hippocampale" voorbereiding om bi-directionele interaCtions van de twee structuren 22 en de daaropvolgende evolutie van de "geïsoleerde hippocampus" -bereiding hebben aangetoond dat intrinsieke theta-oscillaties spontaan optreden in de hippocampus die de externe ritmische ingang 23 mist. De waarde van deze benaderingen ligt op het initiële inzicht dat de gehele functionele structuur van deze regio's behouden moest worden om in vitro 22 als een theta-ritmegenerator te kunnen functioneren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures zijn uitgevoerd volgens de protocollen en richtlijnen die zijn goedgekeurd door de McGill University Animal Care Committee en de Canadese Raad voor Dierenverzorging.
1. Acute Hippocampus In Vitro Bereiding
OPMERKING: Het isoleren van het intacte hippocampale preparaat omvat drie belangrijke stappen: (1) Bereiding van oplossingen en uitrusting, (2) Dissectie van de hippocampus en (3) Het opstellen van het snelle perfusiesnelheidssysteem dat nodig is voor het genereren van intrinsieke theta-oscillaties. In dit protocol is de tijdige uitvoering van procedures - van dissectie tot opname - bijzonder belangrijk omdat de geïsoleerde hippocampus zo'n dichte maar delicate voorbereiding vormt dat het behoud van functionele connectiviteit van de structuur in vitro zorgvuldig vereist. Voorbereiding van alles op voorhand zorgt ervoor dat een voldoende mate van perfusie zo vroeg mogelijk beschikbaar is om cel d te minimaliserenVersterken en onderhouden van de fysiologische functie.
- Succrose-gebaseerde kunstmatige cerebrale spinale vloeistof (aCSF) oplossing
- Bereid 1X stock sucroseoplossing voor om te gebruiken voor dissectie en post-dissectie incubatie. Combineer alle componenten in Tabel 1, behalve CaCl2 in 1 liter gedeïoniseerd water en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken.
- Standaard aCSF oplossing
- Bereid standaard aCSF voor hoge perfusie van de geïsoleerde hippocampus tijdens elektrofysiologische opnamen. Om de geconcentreerde (5X) voorraad aCSF te maken, loste alle componenten in tabel 2 op , behalve CaCl 2 , in 2 liter gedeïoniseerd water en opslaan bij 4 ° C.
- Bereid de uitrusting voor
- Voordat u de dissectie start, zet u de bankruimte op met een ijzige plastic lade (30 x 20 x 5 cm)Ee glazen petrischalen (10 x 2 cm) (zie afbeelding 1 ).
- Voeg 300 ml sucroseoplossing (1X voorraad) in een 500 ml bekerglas bel met carbogeen (95% O2, 5% CO2) en voeg Ca2 + [1,2 mM].
- Breng 60 ml van deze sucroseoplossing over op een glas Petri-schotel en laat het bij kamertemperatuur. Plaats de rest in een 4 ° C vriezer gedurende 10 - 15 minuten.
- Bubble de ijskoude sucroseoplossing met carbogeen gedurende de dissectie.
- Vul een tweede Petri schotel (koude houderkamer) met sucroseoplossing (4 ° C) en blijf ijs.
- Voeg 30 ml ijskoude sucroseoplossing toe aan een beker van 50 ml.
2. Hele Hippocampus Dissectie
OPMERKING: De methode voor het dissecteren van de geïsoleerde hippocampus is in wezen identiek aan die ontwikkeld en beschreven oorspronkelijk 22 , maar met aanvullende details en veranderingen met betrekking tot de peRfusie snelheid en opname technieken.
- Hersensectie
- Verdoof de muis (P20 - 35) onder een afzuigkap met een kleine papieren handdoek geweekt met 1 ml isofluraan (100%) die in de kooi wordt toegevoegd.
- Decapiteer de verdoofde muis en snel onderdompelen het hoofd in ijskoude sucroseoplossing (50 ml beker, ~ 5 s). Overbrengen op een papieren handdoek.
- Gebruik een scalpel om een mediale huidinsnijding (caudale tot rostral) te maken en de huid aan de zijkanten te drukken om het kraan bloot te leggen.
- Knip de schedel open met een kleine schaar en gebruik een spatel om de hersenen snel uit te trekken en te laten vallen in de Petri-schotel met ijskoude sucroseoplossing. Laat 1-2 minuten voor de hersenen afkoelen.
- Terwijl de hersenen zich herstellen, voeg 2 - 3 ml sacharoseoplossing toe op een lenspapier bedekte Petri (dissectie) schotel op ijs.
- Isolatie van de hippocampus
- Plaats de hersenen op de dissectieschotel in een rechtop positien.
- Verwijder de cerebellum en de frontale cortex met een scheermesje. Snijd de hersenen halverwege het midsagittale vlak en keer de twee geïsoleerde hemisfeer terug naar de kamer. Laat nog 1 tot 2 minuten voor herstellen.
- Plaats de afzonderlijke hemisecteerde hersenen rechtop op de dissectieschotel.
- Draai de schotel rond tot de midsagitale structuren de waarnemer tegenkomen en de ingebouwde omtrek van het septalcomplex is zichtbaar als een dunne, peervormige weefsel die aan de thalamus ligt.
- Houd de gestemde hersenen stabiel met de microspatel en plaats het kleine uiteinde van de polytetrafluorethyleen (PTFE) -coated spatel direct achter (caudale naar) het septalgebied.
- Plaats de gecoate spatel onder het septum en beweeg de tip naar beneden totdat de dissectieschotel is bereikt. Verdeel de vezels die het septalgebied caudaal verbinden. Herhaal dezelfde operatie langs de voorkant van de septum en snijd de vezels die aan het voorste gedeelte van de hersenen verbinden.
- Met de spatel liggend in het midden van de cortex net boven de hippocampus in de rechtopstand houden, gebruik de microspatel om de thalamische, hypothalamische en resterende hersenstamkernen zorgvuldig te trekken. Gebruik de spatel om het afgetrokken weefsel af te snijden en te verwijderen.
- Draai het geïsoleerde halfrond aan de zijkant en identificeer de omtrek van de hippocampus.
- Plaats de gecoate spatel in de laterale ventrikel, onder het rostrale uiteinde van de dorsale hippocampus.
- Houd de spatel horizontaal in lijn met het midsagittale vlak van de hemi-gescoorde hersenen en schuif het door de gladde contour van de ventriculaire muren tot het punt caudaal optreedt.
- Houd de spatel onder de hippocampus vast en druk het licht op de verbindingsvezels, langs de binnenlaag waar de hippocampus aansluit bij de overliggende cortex. Breng de microspatel aan de buitenkant van deze laag aan en schuif tegen de gecoate spatel om door de verbindingsfiets te snijdenBers.
- Om de extractie te voltooien, draai de dissectieschotel en plaats de gecoate spatel onder de ventrale hippocampus. Houd de binnenkant van de corticale vouw lichtjes vast met de spatel en snijd de entorhinaire verbindingen door middel van een snijbeweging tegen de microspatel.
OPMERKING: Het gehele septohippocampale complex kan verwijderd worden door de gecoate spatel onder de gehele hippocampus te plaatsen en het resterende hersenweefsel van onder te trekken. - Zodra de isolatie voltooid is, houd de hippocampus op het gerecht rustig en voeg een druppel ijskoude sucroseoplossing toe om het koel te houden. Trek de resterende cortex en vezels zorgvuldig af en verwijder de hippocampus uit het septum door een scheermesje door de fornix zachtjes aan te brengen.
OPMERKING: Als patchclamp opnames uit piramidale cellen moeten worden uitgevoerd (zie paragraaf 4.6 Optogenetische controle), kan de geïsoleerde hippocampus transversaal gesneden worden op een hoek van 45 ° om de pyramidale laag van CA1 ("anglE-cut "voorbereiding), zonder het lokale netwerk circuit in het overige gedeelte van de hippocampus in gevaar te brengen. - Zet het preparaat over op kamertemperatuursaccharoseoplossing en laat het 15 tot 30 minuten herstellen voordat u naar de opnamekamer gaat.
3. Stel de snelle perfusie op voor het opnemen van de geïsoleerde Hippocampus
- Stel het zwaartekrachtvoedingssysteem in om de continuïteit van hoge zuurstofgezette aCSF bij 20-25 ml / min in te zetten.
- Maak vooraf een fles van ACSF (1X) en dompel ze minstens 30 minuten in een warmbad (~ 30 ° C) voor het begin van het experiment. Zet het in-line-verwarmingssysteem aan (30 ° C).
- Gebruik aquarium bubblers en buisleidingen verbonden met een carbogen tank zuurstof aCSF gedurende het experiment en voeg CaCl2 [2 mM] voor de start van de perfusie.
- Stop aCSF-stroom en verplaats de hippocampus naar de opnamekamer met behulp van de bredeEinde van een glazen pipet. Laat het sucrose verzadigde preparaat zinken en vestig aan de onderkant.
- Plaats de voorbereiding in het midden van de opnamekamer (in lijn met de inlaatas) met het gladde oppervlak van CA1 en SUB bovenop. Stabiliseer de hippocampus met kleine gewichten bij de septal en de tijdelijke extremiteiten en start de aCSF-stroom opnieuw.
4. Elektrofysiologie in de Geïsoleerde Hippocampus
- Extracellulaire opname van in vitro hippocampale theta-oscillaties
- Voor extracellulaire monitoring van Local Field Potential (LFP) of single-unit activiteit van de in vitro geïsoleerde hippocampus, gebruik glazen micropipetten (1 - 3 MΩ) gevuld met aCSF. Record geluidsgerichte AC-gekoppelde veldpotentiële signalen met een patch-klemversterker van winst x1000, online bandpasfiltrering 0,1 - 500 Hz en een sampling snelheid van 5-20 kHz.
OPMERKING: De op maat gemaakte microscoop die in dit protocol wordt gebruiktIs uitgerust met lage (2.5X) en hoge vergroting (40X) doelstellingen voor een kleine vergroting van de hippocampus, evenals infrarood video microscopie en epifluorescentie voor single cell recognition. De componenten van dit systeem zijn onder andere de opstaande fluorescentiemicroscoop, fluorescentiefilterblokjes, een analoge videocamera en digitale framegrabber met beeldsoftware, een op maat gemaakte perfusiekamer ( Figuur 2A , inzet i) en microgroeven met hoge precisie voor neuronale opnames en Optische vezel plaatsing. - Gebruik de camera gemonteerd op de microscoop en aangesloten op een computer display om de hippocampale voorbereiding onder lage vergroting (2.5X) te inspecteren en snel te controleren of er geen onderbrekingen of schade aan het externe oppervlak zijn. De diagonaal georiënteerde opstelling van alveusvezels langs het gladde oppervlak van CA1 zou zichtbaar moeten zijn ( Figuur 2A , inzet ii) wanneer het licht door de hippocam doorgaatpus.
- Gebruik de kleine vergrotingsbreedte-doelstelling om de geïsoleerde hippocampus en de plaatsing van LFP-elektroden op specifieke opnamelocaties te bekijken.
OPMERKING: Een afbeelding van het geïsoleerde hippocampale preparaat met meerdere elektroden geplaatst in verschillende opnamelocaties is geïllustreerd in figuur 2A . - Leg een LFP-elektrode in het bad tot het het oppervlak (alveus) van het CA1-gebied raakt.
OPMERKING: dit levert meestal een snelle transient op in de AC-gekoppelde opname, vergelijkbaar met wat er gebeurt als de elektrode in contact komt met het opnamemedium. Een audiomonitor kan handig zijn om naar dit LFP-kanaalsignaal na deze stap te luisteren.
OPMERKING: Vaak zullen de vroege tekenen van activiteit pas na 10 tot 15 minuten verschijnen, daarom is het belangrijk om niet snel in de voorbereiding te komen. Als na deze periode de oppervlak LFP-elektrode nog steeds geen activiteit opneemt, ga je een beetje verder door de stratum-oriëntenEn pauzeer periodiek om te zien of er een vorm van activiteit optreedt terwijl u de hoofdcellaag nadert. Als er na 5 tot 10 minuten niets wordt gedetecteerd, trek de elektrode de voorzichtig terug en plaats deze elders in dezelfde regio. - Bevorder de LFP-elektrode door de pyramidale laag. Let op dat die extracellulaire spikingactiviteit aanvankelijk stijgt, aangezien afzonderlijke ontlading van individuele neuronen (meestal piramidale en remmende basketcellen) wordt gedetecteerd. Verlaag de elektrode verder en let op dat de spiking weer verdwijnt als het punt in de radiatum komt. Let op dat een duidelijk zichtbare netwerkoscillatie in het theta-frequentiebereik (4-12 Hz) duidelijk wordt en bereikt de maximale amplitude (~ 100 - 300 μV), aangezien de opname locatie door de radiatum wordt verlaagd.
- Voor extracellulaire monitoring van Local Field Potential (LFP) of single-unit activiteit van de in vitro geïsoleerde hippocampus, gebruik glazen micropipetten (1 - 3 MΩ) gevuld met aCSF. Record geluidsgerichte AC-gekoppelde veldpotentiële signalen met een patch-klemversterker van winst x1000, online bandpasfiltrering 0,1 - 500 Hz en een sampling snelheid van 5-20 kHz.
- Theta-oscillaties over een enkele regio
- Om de ruimtelijke eigenschappen van spontane theta-oscillaties in het CA1-gebied te testen, plaats de tip oFa referentie LFP elektrode in een mediale CA1 plaats (mediaal gelegen langs de longitudinale septotemporale as) en verlaag het in de radiatum zoals eerder beschreven.
- Plaats een tweede LFP-elektrode in een CA1-plaats (200 - 800 μm septal of temporaal van de eerste LFP) en let op dat CA1 theta-oscillaties over relatief grote afstanden kunnen synchroniseren.
- Theta oscillaties over lagen
- Om de eigenschappen van theta oscillaties over hippocampale lagen te testen, laat een referentie LFP elektrode in een CA1 radiatum site. Begin vanaf net boven de stratum-oosters, laat een tweede elektrode in de pyramidale cellaag, en door de radiatum. Let op een geleidelijke inversie van het LFP-signaal (relatieve fase-omkering) over de pyramidale laag.
OPMERKING: Zie figuur 2B voor representatieve voorbeelden van deze soorten activiteiten. Voorbeelden van laminaire / diepteprofielen en huidige brondichtheid (CSD) analyseIllustreert de plaats van fase omkering in geïsoleerde hippocampi zijn eerder 23 , 24 , 25 gepubliceerd .
- Om de eigenschappen van theta oscillaties over hippocampale lagen te testen, laat een referentie LFP elektrode in een CA1 radiatum site. Begin vanaf net boven de stratum-oosters, laat een tweede elektrode in de pyramidale cellaag, en door de radiatum. Let op een geleidelijke inversie van het LFP-signaal (relatieve fase-omkering) over de pyramidale laag.
- Gamma-oscillaties en theta-gamma koppeling in de intakte hippocampus
- Plaats een veldelektrode aan de CA1 / SUB-rand en laat deze zakken tot hij op de interface zit tussen de pyramidale en moleculaire lagen. Op dit niveau kan een veldpotentiaal die duidelijke gamma-oscillaties met amplitudeveranderingen weergeeft, die fase-lock naar het lokale theta-ritme vertoont 24 opgenomen kunnen worden. Schaal aanpassen om de langzame tijdschaal van de theta-gamma-koppeling in acht te nemen. Merk op dat gamma-uitbarstingen zich voordoen in twee verschillende frequentiebanden, die kan worden aangetoond door het doorlopende LFP-signaal in het langzame (25 - 50 Hz) en het snelle gamma (150 - 250 Hz) bereik te filteren (zie figuur 2C voor representatief gefilterd sporen).
- Hele-cel patch klem opname tijdens in vitro hippocampale theta oscillaties
OPMERKING: In dit deel van het protocol is het doel visueel begeleide gehele cel-patch klemopnamen te verkrijgen van geïdentificeerde interneuronen in geïsoleerde hippocampi van transgene PV-TOM muizen die het fluorescerende eiwit, tdTomato, onder controle van de PV-promotor uitdrukken (voor Meer details zie materialen en Ref 26 ).- Gebruik fluorescentie video-microscopie met lage (2,5x) en high power (40X) vergroting om TDTomato-positieve interneuronen te lokaliseren die zich dichtbij het oppervlak van een hippocampale voorbereiding van een PV-TOM muis bevinden ( Figuur 3 ). Merk op dat, terwijl PV-TOM neuronen succesvol kunnen worden visualiseerd en gericht zijn op patch via de alveus (tot 100 μm), kunnen niet-fluorescerende pyramidale cellen ook relatief gemakkelijk worden bereikt wanneer de hippocampus wordt bereid met de hoekgesneden techniek (zie Sectie 2.2.14 noot).
- Plaats onder een lage vergroting van de hippocampus een LFP-elektrode in CA1 / SUB om theta-oscillaties te controleren tijdens het voorbereiden op patchclamp-experimenten.
- Overschakelen naar 40X vergroting en dompel het doel over het doelgebied; Zet het tot de bovenste lagen zichtbaar zijn. Manipuleer de positie van de microscoop om voldoende open toegang te bieden voor patchpipetaanpak van de tegenovergestelde kant.
- Selecteer onder fluorescentiemicroscopie een fluorescerende PV-TOM-cel en benader deze met een patchpipet (2 - 3 MΩ) gevuld met standaard intracellulaire oplossing.
- Gebruik een mondstuk om de positieve druk op de pipet toe te passen en controleer de weerstand als de elektrode op de cel wordt verlaagd. Wanneer de tip de target cel tegenkomt, neemt de pipetweerstand toe en er verschijnt een duidelijke dimple als de positieve druk op het membraan duwt. Laat de druk los en controleer of de huidige puls fladert als een zegel begint te vormen. Onmiddellijk clVersterker tot een hyperpolariseerd potentieel (-70 mV), en zodra een GΩ zegel is bereikt, breek het celmembraan met een kleine hoeveelheid negatieve druk die door de pipethouder wordt aangebracht.
- Eens in de volledige celconfiguratie, onderzoeken de fysiologische eigenschappen van geïdentificeerde PV-cel tijdens spontane hippocampale oscillaties ( Figuur 3B ).
- Houd er rekening mee dat intracellulaire membraanpotentiële opname van PV-cellen wordt gekenmerkt door snelle spikgedrag en uitbarstingen van actiepotenties gesynchroniseerd met het lopende CA1 / SUB-theta-ritme.
- Schakel over naar spanningsclamp en houd de cel bij verschillende membraanpotentialen om de verhouding van excitatorische tegeninhibitorische synaptische stromingen te karakteriseren die wordt gegenereerd door de intrinsieke ritmische activiteit. Een voorbeeld van patchclamp opname uit een pyramidale cel wordt getoond in figuur 3A ter vergelijking.
- Optogenetische controle in de geïsoleerde hippocampus
OPMERKING: Voor optogenetische controle van hippocampale netwerkactiviteit wordt hier een celtypespecifieke strategie met betrekking tot ritmische activering van PV-bevattende GABAergic cellen gebruikt, aangezien deze cellen bleken een belangrijke rol te spelen bij het synchroniseren van hoofdcelpopulaties in de geïsoleerde hippocampus 25 . Selectieve expressie van de excitatoire channelrhodopsin-2 (ChR2) in PV-cellen wordt bereikt door de PV-Cre-muislijn te kruisen met muizen die constitutief ChR2 Cre-afhankelijk maken (Ai32), waardoor PV-ChY-muizen worden genereerd. Alternatief kunnen virale vectorconstructies ( bijv . AAVdj-ChETA-eYFP) geïnjecteerd worden in de hippocampus van PV-Cre of PV-TOM muizen (P15-16) om de expressie van de excitatorische opsin in CA1 / SUB-interneuronen te stimuleren ( Figuur 4A ).
OPMERKING: Deze strategie is eerder beschreven 25 .- Plaats een LFP-elektrode in het CA1 / SUB-gebied en plak een nabije pyramidale cel in de geïsoleerde hippocAmpus van een muis die de blauwlichtgevoelige excitatorische opsin ChR2 uitdrukt in PV-interneuronen.
- Plaats een optische vezellichtgeleider (0,2 - 1 mm diameter) boven de hippocampale voorbereiding en plaats het op het opgenomen gebied. Gebruik blauw licht (473 nm) van een LED-bron voor optogenetische stimulatie, bestaande uit lichtimpulsen (10 - 20 ms, geactiveerd door een transistor-transistorlogische signaal) of sinusgolfspanningskommando's die bij de frequenties van de frequenties (4 - 12 Hz) worden afgeleverd.
OPMERKING: Het aangepaste LED-gebaseerde lichtstimulatiesamenstel is elders 25 beschreven. - Schakel over naar de huidige klem en karakteriseer de activiteit van de pyramidale tijdens spontane theta-oscillaties.
- Start het stimulatieprotocol en teken de lichtreacties op. Oplossen die veldoscillaties en synaptische activiteit in de opgenomen neuron worden steeds meer gesynchroniseerd tijdens optogenetische stimulatie en dat ritmische pacing van PV-cellen resulteert in een robuuste controle van beide frequentiesEncy en kracht van theta oscillaties ( Figuur 4 ).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit gedeelte illustreert voorbeelden van resultaten die kunnen worden verkregen door het bestuderen van theta-oscillaties in de muis geïsoleerde hippocampale preparaat in vitro . De dissectieprocedure voor het extraheren van de geïsoleerde hippocampus is geïllustreerd in figuur 1 . Met behulp van dit preparaat kunnen intrinsieke theta-oscillaties worden onderzocht tijdens het plaatsen van meerdere veldelektroden, waarbij de algemene activiteit...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Terwijl elektrofysiologische opnamen van acute hippocampale plakjes een standaard in vitro techniek vormen, verschillen de methoden die hier worden gepresenteerd aanzienlijk van de klassieke aanpak. In tegenstelling tot de dunne plakpreparaten waar specifieke cellagen zichtbaar zijn op het oppervlak en direct kunnen worden onderzocht, zijn de intacte hippocampale preparaten meer vergelijkbaar met in vivo configuraties, waarbij elektroden worden verlaagd naar gerichte hersenregio's terwijl ze door a...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende commerciële of financiële belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek en natuurwetenschappen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 - sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-25 | hersenextractie |
| Scalpel Handle #4, 14 cm | WPI | 500237 | hersenextractie |
| Filter forceps, flat jaws, straight (11 cm) | WPI | 500456 | hersenextractie |
| Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 | Ultident | 02-90010-20 | hersenextractie |
| Fine Point Curved Dissecting Scissors | Thermo Fisher Scientific | 711999 | hersenextractie |
| Teflon (PTFE) -coated thin spatula | VWR | 82027-534 | hippocampus voorbereiding |
| Hayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | hippocampus voorbereiding |
| Lab spoon | Fisher Scientific | 14-375-20 | hippocampus voorbereiding |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | hippocampus voorbereiding |
| Droper | Fisher Scientific | hippocampus voorbereiding | |
| Razor blades Single edged | VWR | 55411-055 | hippocampus voorbereiding |
| Lens paper (4 x 6") | VWR | 52846-001 | hippocampus voorbereiding |
| Glass petri dishes (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | hippocampus voorbereiding |
| Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm | n.a. | n.a. | hippocampus voorbereiding |
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | perfusiesysteem |
| Aquarium air stones for bubbling | n.a. | n.a. | perfusiesysteem |
| Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | perfusiesysteem |
| Electric Skillet | Black & Decker | n.a. | perfusiesysteem |
| 95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen) | Vitalaire | SG466204A | perfusiesysteem |
| Glass bottles/flasks (4 x 1 L) | n.a. | n.a. | perfusiesysteem |
| Submerged recording Chamber | custom design (FM) | n.a. | Commercieel alternatief mag worden gebruikt |
| Glass pipettes (1.5/0.84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | elektrofysiologie |
| Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific | Q-Humbug | elektrofysiologie |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular devices | MULTICLAMP | elektrofysiologie |
| Multiclamp 700B Commander Program | Molecular devices | MULTICLAMP | elektrofysiologie |
| Digital/Analogue converter | Molecular devices | DDI440 | elektrofysiologie |
| PCLAMP10 | Molecular devices | PCLAMP10 | elektrofysiologie |
| Vibration isolation table | Newport | n.a. | elektrofysiologie |
| Micromanipulators (manually operated ) | Siskiyou | MX130 | elektrofysiologie (LFP) |
| Micromanipulators (automated) | Siskiyou | MC1000e | elektrofysiologie (patch) |
| Audio monitor | A-M Systems | Model 3300 | elektrofysiologie |
| Micropipette/Patch pipette puller | Sutter | P-97 | elektrofysiologie |
| Custom-built upright fluorescence microscope | Siskiyou | n.a. | Beeldvorming |
| Analogue video camera | COHU | 4912-2000/0000 | Beeldvorming |
| Digital frame grabber with imaging software | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Beeldvorming |
| Olympus 2.5X objective | Olympus | MPLFLN | Beeldvorming |
| Olympus 40X water immersion objective | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Beeldvorming |
| Custom-made Light-Emitting Diode (LED) system | custom | n.a. | optogenetische stimulatie (Amhilon et al., 2015) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| PV::Cre (KI) mice | Jackson Laboratory | stock number 008069 | Sta Cre-gerichte genexpressie toe in PV interneuronen |
| Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | Jackson Laboratory | stock number 007905 | Express TdTomato volgend op Cre-gemedieerde recombinatie |
| Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock number 012569 | Express de verbeterde channelrhodopsin-2/EYFP fusie-eiwit volgend op blootstelling aan Cre recombinase |
| PVChY mice | In house breeding | n.a. | Nakomelingen verkregen uit kruising van de PV-Cre lijn met Ai32 muizen (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
Referenties
- Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
- Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J. Grid Cells and Place Cells: An Integrated View of their Navigational and Memory Function. Trends Neurosci. 38 (12), 763-775 (2015).
- O'Keefe, J., Recce, M. L. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).
- Winson, J. Loss of hippocampal theta rhythm results in spatial memory deficit in the rat. Science. 201 (4351), 160-163 (1978).
- M'Harzi, M., Jarrard, L. E. Strategy selection in a task with spatial and nonspatial components: effects of fimbria-fornix lesions in rats. Behav Neural Biol. 58 (3), 171-179 (1992).
- Osipova, D., et al. Theta and gamma oscillations predict encoding and retrieval of declarative memory. J Neurosci. 26 (28), 7523-7531 (2006).
- Stumpf, C., Petsche, H., Gogolak, G. The significance of the rabbit's septum as a relay station between the midbrain and the hippocampus. II. The differential influence of drugs upon both the septal cell firing pattern and the hippocampus theta activity. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 212-219 (1962).
- Mitchell, S. J., Ranck, J. B. Generation of theta rhythm in medial entorhinal cortex of freely moving rats. Brain Res. 189 (1), 49-66 (1980).
- Alonso, A., Garcia-Austt, E. Neuronal sources of theta rhythm in the entorhinal cortex of the rat. I. Laminar distribution of theta field potentials. Exp Brain Res. 67 (3), 493-501 (1987).
- Vertes, R. P., Kocsis, B. Brainstem-diencephalo-septohippocampal systems controlling the theta rhythm of the hippocampus. Neuroscience. 81 (4), 893-926 (1997).
- Bland, B. H., Colom, L. V., Konopacki, J., Roth, S. H. Intracellular records of carbachol-induced theta rhythm in hippocampal slices. Brain Res. 447 (2), 364-368 (1988).
- Cobb, S. R., Buhl, E. H., Halasy, K., Paulsen, O., Somogyi, P. Synchronization of neuronal activity in hippocampus by individual GABAergic interneurons. Nature. 378 (6552), 75-78 (1995).
- Williams, J. H., Kauer, J. A. Properties of carbachol-induced oscillatory activity in rat hippocampus. J Neurophysiol. 78 (5), 2631-2640 (1997).
- Chapman, C. A., Lacaille, J. C. Cholinergic induction of theta-frequency oscillations in hippocampal inhibitory interneurons and pacing of pyramidal cell firing. J Neurosci. 19 (19), 8637-8645 (1999).
- Strata, F. Intrinsic oscillations in CA3 hippocampal pyramids: physiological relevance to theta rhythm generation. Hippocampus. 8 (6), 666-679 (1998).
- Kocsis, B., Bragin, A., Buzsaki, G. Interdependence of multiple theta generators in the hippocampus: a partial coherence analysis. J Neurosci. 19 (14), 6200-6212 (1999).
- Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Cholinergic induction of oscillations in the hippocampal slice in the slow (0.5-2 Hz), theta (5-12 Hz), and gamma (35-70 Hz) bands. Hippocampus. 10 (2), 187-197 (2000).
- Gillies, M. J., et al. A model of atropine-resistant theta oscillations in rat hippocampal area CA1. J Physiol. 543 (Pt 3), 779-793 (2002).
- Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13295-13300 (2005).
- Konopacki, J., Eckersdorf, B., Kowalczyk, T., Golebiewski, H. Firing cell repertoire during carbachol-induced theta rhythm in rat hippocampal formation slices. Eur J Neurosci. 23 (7), 1811-1818 (2006).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro. J Neurosci. 28 (15), 4096-4107 (2008).
- Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. Self-generated theta oscillations in the hippocampus. Nat Neurosci. 12 (12), 1491-1493 (2009).
- Jackson, J., Goutagny, R., Williams, S. Fast and slow gamma rhythms are intrinsically and independently generated in the subiculum. J Neurosci. 31 (34), 12104-12117 (2011).
- Amilhon, B., et al. Parvalbumin Interneurons of Hippocampus Tune Population Activity at Theta Frequency. Neuron. 86 (5), 1277-1289 (2015).
- Huh, C. Y., et al. Excitatory Inputs Determine Phase-Locking Strength and Spike-Timing of CA1 Stratum Oriens/Alveus Parvalbumin and Somatostatin Interneurons during Intrinsically Generated Hippocampal Theta Rhythm. J Neurosci. 36 (25), 6605-6622 (2016).
- Gu, N., et al. NMDA-dependent phase synchronization between septal and temporal CA3 hippocampal networks. J Neurosci. 33 (19), 8276-8287 (2013).
- Jackson, J., et al. Reversal of theta rhythm flow through intact hippocampal circuits. Nat Neurosci. 17 (10), 1362-1370 (2014).
- Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. GABA neurons and the mechanisms of network oscillations: implications for understanding cortical dysfunction in schizophrenia. Schizophr Bull. 34 (5), 944-961 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
