Een modulaire benadering van de synthese van N- glycanen voor bevestiging aan een aluminium oxide-gecoate glazen schuif (ACG dia) als een microarray glycan heeft ontwikkeld en het gebruik ervan voor de profilering van een HIV in grote lijnen neutraliserende antilichamen aangetoond.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Chemo-enzymatische synthese van N- glycanen voor Array ontwikkeling en HIV antilichaam profilering
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
We presenteren een zeer efficiënte manier voor de snelle bereiding van een breed scala van N-gekoppelde oligosacchariden (geraamd op meer dan 20.000 structuren) die gewoonlijk worden aangetroffen op menselijke glycoproteïnen. Om de gewenste structurele diversiteit, begon de strategie met de chemo-enzymatische synthese van drie soorten oligosaccharyl fluoride modules, gevolgd door hun stapsgewijze α-selectieve glycosylations op de 3-O en 6-O posities van de Mannose residu van de gemeenschappelijke kern trisaccharide hebben een cruciale β-mannoside-koppeling. Wij hechten verder de N- glycanen aan het oppervlak van een aluminium oxide beklede (ACG) glasplaatje om een covalente gemengde array voor de analyse van hetero-ligand interactie met een HIV-antistoffen te maken. In het bijzonder type het bindingsgedrag van een nieuw geïsoleerd HIV-1 in grote lijnen neutraliserende antilichamen (bNAb), PG9, aan het mengsel van nauw verdeelde Man5GlcNAc2 (Man5) en 2,6-di-sialylated bi-antennary complex N- glycan (SCT ) op een array van ACG, opent een nieuwe laan te begeleiden van het ontwerp van de effectieve immunogeen voor HIV vaccinontwikkeling. Bovendien, belichaamt onze ACG matrix een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van andere HIV antilichamen voor hetero-ligand bindingsgedrag.
Inleiding
N- glycanen op glycoproteïnen zijn covalent gekoppeld aan de asparagine (Asn) residu van de consensus Asn-Xxx-Ser/Thr sequon, die gevolgen hebben voor verschillende biologische processen zoals eiwit bevleesdheid, antigenicity, oplosbaarheid en lectine herkenning 1 , 2. de chemische synthese van N-gekoppelde oligosacchariden vertegenwoordigt een significante synthetische uitdaging vanwege hun enorme structurele micro heterogeniteit en de zeer vertakte architectuur. Zorgvuldige selectie van de bescherming van groepen om af te stemmen reactiviteit van bouwstenen, bereiken van selectiviteit bij a....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. bereiding van D1/D2 Arm Modules22
- Voorbereiding van de tussentijdse 2
- Wegen beginnen materiële 1 (afgebeeld in Figuur 2, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100 mg, 0.204 mmol)) in een tube van 15 mL en los op in Tris buffer (25 mM, pH 7.5) bevattende mangaan dichloride (MnCl2, 10 mM) tot een concentratie van de uiteindelijke glycan van 5 mM.
- Voeg 2 equivalenten van uridine difosfaat galactose (UDP-Gal).
- Voeg 150 eenheden van enzym β-1, 4 galactosyl enz....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een modulaire chemo-enzymatische strategie voor de synthese van een breed scala van N -glycanen wordt gepresenteerd in Figuur 1. De strategie is gebaseerd op het feit dat de diversiteit aan begin kan worden gemaakt door chemo-enzymatische synthese van de drie belangrijke modules, gevolgd door de α-specifieke mannosylation op de 3-O en/of 6-O positie van het mannose residu van het gemeenschappelijk Core trisaccharide van N- .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een klasse van HIV-1 bNAbs met inbegrip van PG9, PG16 en PGTs 128, 141-145 zeer krachtig in het neutraliseren van 70-80% van het circulerende HIV-1 isolaten werden gemeld. De epitopes van deze bNAbs zijn zeer bewaard onder de varianten van de hele HIV-1 groep M, dus zij kunnen begeleiden de effectieve immunogeen ontwerp voor een HIV-vaccin te ontlokken van neutraliserende antilichamen23,24,25 . Als een onderdeel van onze voortdu.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken de Thin Film Technology divisie, Instrument technologie Research Center (ITRC) en nationale toegepast Research Laboratories, wetenschapspark Hsinchu, Taiwan. Dit werk werd gesteund door de nationale Raad voor Wetenschappen (verlenen neen. MEESTE 105-0210-01-13-01) en de Academia Sinica.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Azijnzuur | Sigma Aldrich | 64197 | |
| Acetonitril | Sigma Aldrich | 75058 | |
| Azijnzuuranhydride | Sigma Aldrich | 108247 | |
| Watervrij magnesiumsulfaat | Sigma Aldrich | 7487889 | |
| Boortrifluoride ethyletheraat | Sigma Aldrich | 109637 | |
| Rundserumalbumine | Sigma Aldrich | 9048468 | |
| Bio-Gel P2 polyacrylamide | Bio-Rad | 1504118 | |
| Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride | Sigma Aldrich | 12116664 | |
| β-1, 4 Galactosyl transferases van rundse melk | Sigma Aldrich | 48279 | |
| BioDot Cartesion technologie met robotische pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) | Arrayit | ||
| Ceriu ammonium molybdaat | TCI | C1794 | |
| Ceriu ammonium nitraat | Sigma Aldrich | 16774213 | |
| Schone glazen plaat | Schott | ||
| Cytidine-5'-monofosfo-N-acetylneuraminzuur | Sigma Aldrich | 3063716 | |
| Gedeutereerd chloroform | Sigma Aldrich | 865496 | |
| Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 geconjugeerd | Jackson Immuno Research, USA | 709605098 | |
| Dichloormethaan | Sigma Aldrich | 75092 | |
| Diethylaminozwaveltrifluoride | Sigma Aldrich | 38078090 | |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 68122 | |
| Ethylacetaat | Sigma Aldrich | 141786 | |
| Ethyleenglycol | Acros Organic | 107211 | |
| FAST frame slide incubatiekamers | Sigma Aldrich | ||
| Guanosine 5'-difosfo-b-L-fucose dinatriumzout | Sigma Aldrich | 15839700 | |
| Lab tracer 2.0 software | Sectie 4 van het protocol | ||
| GenePix Pro 4300A lezer (microarray beeldanalyse) | moleculardevices | www.moleculardevices.com | |
| GraphPad Prism Software (Beeldverwerking ) | GraphPad Software, Inc | http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ | |
| Lithiumhydroxide | Sigma Aldrich | 1310652 | |
| Manganchloride | Sigma Aldrich | 7773015 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67561 | |
| N-butanol | Sigma Aldrich | 71363 | |
| Oxalzuur | Acros Organic | 144627 | |
| Palladiumhydroxide | Sigma Aldrich | 12135227 | |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 110861 | |
| P-Tolueen sulfonzuur monohydraat | Sigma Aldrich | 773476 | |
| Zilvertriflaat | Sigma Aldrich | 2923286 | |
| Natriumbicarbonaat | Sigma Aldrich | 144558 | |
| Natriumchloride | Sigma Aldrich | 7647145 | |
| Natriumwaterstofcarbonaat | Sigma Aldrich | 144558 | |
| Natriummethoxide | Sigma Aldrich | 124414 | |
| Natriumsulfaat | Sigma Aldrich | 7757826 | |
| Tolueen | Sigma Aldrich | 108883 | |
| Tris buffer | Amresco | N/A | Ultra-pure grade |
| Tween-20 | Amresco | 9005645 | |
| Uridine difosfaat galactose (UDP-galactose) | Sigma Aldrich | 137868521 |
Referenties
- Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells. PloS one. 4, e7317(2009).
- Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
