Methodenartikel

Chemo-enzymatische synthese van N- glycanen voor Array ontwikkeling en HIV antilichaam profilering

DOI:

10.3791/55855

⸱

5 februari 2018

 ,  ,  , 
1Genomics Research Center, Academia Sinica

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een modulaire benadering van de synthese van N- glycanen voor bevestiging aan een aluminium oxide-gecoate glazen schuif (ACG dia) als een microarray glycan heeft ontwikkeld en het gebruik ervan voor de profilering van een HIV in grote lijnen neutraliserende antilichamen aangetoond.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een zeer efficiënte manier voor de snelle bereiding van een breed scala van N-gekoppelde oligosacchariden (geraamd op meer dan 20.000 structuren) die gewoonlijk worden aangetroffen op menselijke glycoproteïnen. Om de gewenste structurele diversiteit, begon de strategie met de chemo-enzymatische synthese van drie soorten oligosaccharyl fluoride modules, gevolgd door hun stapsgewijze α-selectieve glycosylations op de 3-O en 6-O posities van de Mannose residu van de gemeenschappelijke kern trisaccharide hebben een cruciale β-mannoside-koppeling. Wij hechten verder de N- glycanen aan het oppervlak van een aluminium oxide beklede (ACG) glasplaatje om een covalente gemengde array voor de analyse van hetero-ligand interactie met een HIV-antistoffen te maken. In het bijzonder type het bindingsgedrag van een nieuw geïsoleerd HIV-1 in grote lijnen neutraliserende antilichamen (bNAb), PG9, aan het mengsel van nauw verdeelde Man5GlcNAc2 (Man5) en 2,6-di-sialylated bi-antennary complex N- glycan (SCT ) op een array van ACG, opent een nieuwe laan te begeleiden van het ontwerp van de effectieve immunogeen voor HIV vaccinontwikkeling. Bovendien, belichaamt onze ACG matrix een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van andere HIV antilichamen voor hetero-ligand bindingsgedrag.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N- glycanen op glycoproteïnen zijn covalent gekoppeld aan de asparagine (Asn) residu van de consensus Asn-Xxx-Ser/Thr sequon, die gevolgen hebben voor verschillende biologische processen zoals eiwit bevleesdheid, antigenicity, oplosbaarheid en lectine herkenning 1 , 2. de chemische synthese van N-gekoppelde oligosacchariden vertegenwoordigt een significante synthetische uitdaging vanwege hun enorme structurele micro heterogeniteit en de zeer vertakte architectuur. Zorgvuldige selectie van de bescherming van groepen om af te stemmen reactiviteit van bouwstenen, bereiken van selectiviteit bij anomere centra, en het juiste gebruik van promotor / activator(s) zijn sleutelelementen voor de synthese van complexe oligosacchariden. Voor oplossen zulks werkstuk van complexiteit, een grote hoeveelheid werk te bevorderen van N- glycan synthese werd gemeld onlangs3,4. Ondanks deze robuuste benaderingen, het vinden van een effectieve methode voor de bereiding van een breed scala van N- glycanen (~ 20.000) blijft een grote uitdaging.

Een snelle mutatie koers van HIV-1 om de uitgebreide genetische diversiteit en haar vermogen om te ontsnappen aan de neutraliserende antilichaamrespons, is een van de grootste uitdagingen voor de ontwikkeling van een veilig en profylactische vaccin tegen HIV-15,6 , 7. een effectieve tactiek die HIV wordt gebruikt om te voorkomen dat de immuunrespons van de gastheer is de posttranslationele glycosylatie van envelop glycoproteïne gp120 met een divers N-gekoppeld glycanen afgeleid van de host glycosylatie machines8, 9. Een recent rapport betreffende de nauwkeurige analyse van recombinante monomeer HIV-1 gp120 glycosylatie van menselijke embryonale nier (HEK) 293T cellen suggereert het ontstaan van structurele microheterogeneity met een karakteristiek patroon van de cel-specifieke10 , 11 , 12. Daarom begrip glycan kenmerken van HIV-1 bNAbs vereist goed gekarakteriseerd gp120 gerelateerde N- glycan structuren in een hoeveelheid die voldoende is voor analyse.

De ontdekking van glycan microarray technologie verstrekt hoge doorvoer gebaseerde verkenning van de specifieke kenmerken van een breed scala van koolhydraten-bindende proteïnen adhesines van virussen/bacteriën, toxinen, antilichamen en lectines13,14 . De systematische glycanen regeling in een gekleed chip gebaseerde indeling kan bepalen problematisch lage affiniteit eiwit-glycan interacties via multivalent presentatie15,16,17,18. Deze glycan chip gebaseerde regeling lijkt gunstig effectief nabootsen cel interfaces. Verrijken van de technologie en de ongelijke probleem gekoppeld aan conventionele matrix formaten, ontwikkelde onze fractie recent een glycan array op een aluminium oxide-gecoat glas (ACG)-dia met behulp van phosphonic zuur-ended glycanen ter verbetering van de signaalsterkte, homogeniteit en gevoeligheid19,20.

Ter verbetering van de huidige kennis over glycan epitopen voor nieuw geïsoleerd HIV-1 in grote lijnen neutraliserende antilichamen (bNAbs), hebben we een zeer efficiënte modulaire strategie voor de voorbereiding van een breed scala van N-gekoppelde glycanen21 ,22 worden afgedrukt op een ACG schuif (Zie Figuur 1). Specificiteit profiling studies van HIV-1 bNAbs op een matrix van ACG aangeboden de ongebruikelijke detectie van hetero-glycan bindingsgedrag van zeer potente bNAb PG9 dat werd geïsoleerd uit HIV geïnfecteerde individuen23,24,25.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. bereiding van D1/D2 Arm Modules22

  1. Voorbereiding van de tussentijdse 2
    1. Wegen beginnen materiële 1 (afgebeeld in Figuur 2, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100 mg, 0.204 mmol)) in een tube van 15 mL en los op in Tris buffer (25 mM, pH 7.5) bevattende mangaan dichloride (MnCl2, 10 mM) tot een concentratie van de uiteindelijke glycan van 5 mM.
    2. Voeg 2 equivalenten van uridine difosfaat galactose (UDP-Gal).
    3. Voeg 150 eenheden van enzym β-1, 4 galactosyl enzym uit koemelk, en Incubeer het mengsel bij 37 oC voor 15u.
    4. Na 15 h, presteren dunne-laag chromatografie (TLC) om aan te geven van de totale consumptie van grondstof door het reactiemengsel spotten op een TLC-plaat, ontwikkelen met n-butanol/azijnzuur/water (H2O) in een 1:1:1 verhouding en vlekken door een oplossing van 0,25 M cerium ammoniummolybdaat gevolgd door verwarming. Vervolgens doven de reactie door verwarming op 90 oC gedurende 5 minuten.
    5. Centrifugeer het reactiemengsel met een snelheid van 2,737 x g gedurende 3 minuten, en laden van het supernatans dat aan de bovenkant van het polyacrylamidegel kolom (Zie Tabel van materialen). Elueer de kolom met behulp van gedistilleerd-geïoniseerd water, en het verzamelen van het product met breuken voor 1-2 mL.
    6. Controleren van de verzamelde breuken door TLC26, ontwikkelen met n-butanol: H2O: azijnzuur in een 1:1:1 verhouding en kleuring met een oplossing van cerium ammoniummolybdaat gevolgd door verwarming. Lyophilize27 het product met breuken om te verkrijgen tussentijdse 2 (115 mg, 86%) als wit poeder. Kenmerken van het product door NMR28 en massaspectrometrie29 (Zie aanvullende gegevensbestand).
  2. Voorbereiding van de tussentijdse 3
    1. Wegen beginnen materiële 2 (afgebeeld in Figuur 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (80 mg, 0.122 mmol)) in een tube van 15 mL en los het op in Tris buffer (25 mM, pH 7.5) met MnCl2 (10 mM) te bereiden een uiteindelijke glycan-concentratie van 5 mM.
    2. Voeg 2 equivalenten van calciumguanosine Dinatrium 5'-diphospho-β-L-fucose zout (BBP-Fuc).
    3. Voeg 150 eenheden van enzym α-1, 3 fucosyl enzym van Helicobacter pylori (ML1-3FTΔ26695), en Incubeer het mengsel bij 37 oC voor 15u.
    4. Volg stap 1.1.4.
    5. Volg stap 1.1.5.
    6. Volg stap 1.1.6 verkrijgen tussentijdse 3 (82 mg, 84%) als wit poeder. Kenmerken van het product door NMR en massaspectrometrie (Zie aanvullende gegevensbestand).
  3. Voorbereiding van Modules 4 en 5
    1. Weeg samengestelde 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0.230 g, 0,360 mmol) of samengestelde 3, p- methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0.100 g, 0,125 mmol) in een 25 mL single-nek Rondbodemkolf en droog onder drukvermindering voor 30 min.
    2. Verwijder de maatkolf uit vacuüm, vullen met stikstofgas toevoegen een magnetische roer bar, het kapje met een rubber tussenschot en hechten een stikstof-ballon.
    3. Injecteren 7 mL droge pyridine en 3 mL azijnzuur-anhydride (Ac2van O) in de kolf in een ijsbad bij 0 oC. Roer de resulterende reactie voor 12u bij kamertemperatuur met een magneetroerder op 600-700 rpm gebracht. Verdampen de oplosmiddelen met behulp van een roterende verdamper bij een vacuüm druk van 0 - 10 mbar bij 50 oC.
    4. Verdun het ruwe mengsel met behulp van 30 mL dichloormethaan (DCM) en uittreksel met verzadigde waterige natriumwaterstofcarbonaat (NaHCO3) (2 x 20 mL) in een 50 mL separatory trechter.
    5. Opnieuw uitpakken de waterige laag met DCM (3 x 15 mL) en droog de gecombineerde organische lagen over natriumsulfaat. Verwijder de natriumsulfaat door filtratie en wassen met DCM (5 mL). Damp het oplosmiddel met behulp van een rotatieverdamper bij 400 mbar vacuüm druk bij 40 oC.
    6. De oplossing van ruwe mengsel in 2 mL zuiver DCM bovenop het kiezelzuur bed laden.
    7. De kolom Elueer met een mengsel dat bevat tolueen en aceton van 0 - 20% aceton in tolueen en verzamelen van breuken van 5-10 mL.
    8. Controleren van de verzamelde breuken door TLC (stappen 1.1.4 en 1.1.6), ontwikkelen met tolueen/aceton (7/3), en kleuring met een oplossing van cerium ammoniummolybdaat gevolgd door verwarming op een hete plaat.
    9. Het verdampen van het product met breuken met behulp van een rotatieverdamper om gewenste producten als witte schuim in 72% en 85% rendement, respectievelijk.
    10. Los van de producten in 7 mL acetonitril: tolueen: H2O in een 4:2:1-verhouding in een 25 mL-rondbodemkolf.
    11. Cerium ammoniumnitraat (2 equivalenten) toevoegen onder afkoeling tot 0 oC met behulp van een ijsbad. Roer de reactie bij kamertemperatuur gedurende 3 uur bij ~ 500-800 rpm.
    12. Achter TLC totale verbruik geeft van de grondstof (TLC ontwikkelen met tolueen/aceton (7/3) en visualiseren door UV-absorptie bij 254 nm of door kleuring met een oplossing van cerium ammoniummolybdaat gevolgd door verwarming), Verdun het reactiemengsel met ethylacetaat (30 mL) en extract met H2O (15 x 2 mL).
    13. Pak de gecombineerde organische lagen met 5 mL verzadigde natriumchloride (NaCl) oplossing.
    14. Damp het oplosmiddel met behulp van een rotatieverdamper bij 240 mbar vacuüm druk bij 40 oC.
    15. De oplossing van ruwe product in 2 mL zuiver DCM bovenop het kiezelzuur bed laden. De kolom Elueer met een mengsel dat bevat tolueen en aceton (0 - 20% aceton in tolueen) en verzamelen van breuken van 5-10 mL. Controleren van de verzamelde breuken door TLC, ontwikkelen met tolueen/aceton (7/3).
    16. De product-bevattende fracties met behulp van een rotatieverdamper bij 77 mbar vacuüm en 40 oC om de gewenste producten als witte schuim verdampen.
    17. Los van de respectieve alcoholen in 10 mL van DCM in een 25 mL single-nek Rondbodemkolf en afkoelen tot-30 oC.
    18. Diethylaminosulfur trifluoride (DAST, 2 equivalenten) toevoegen. Roer het reactiemengsel bij-30 oC gedurende 2 uur.
    19. Achter TLC geeft aan consumptie van grondstof (TLC ontwikkelen met tolueen/aceton (4/1) en visualiseren door UV-absorptie bij 254 nm of door kleuring met een oplossing van cerium ammoniummolybdaat gevolgd door verwarming), Verdun het reactiemengsel met DCM (30 mL) , en wassen met verzadigde NaHCO3 (15 x 2 mL).
    20. Pak de gecombineerde organische laag met 5 mL verzadigde NaCl-oplossing, droog het door toevoeging van watervrij magnesium-sulfaat, filteren het mengsel na een wasbeurt met DCM (5 mL) en verzamelen in een rondbodemkolf 100 mL-single-nek.
    21. Damp het oplosmiddel met behulp van een rotatieverdamper bij 400 mbar vacuüm druk bij 40 oC.
    22. Laden van de oplossing van ruwe product in 2 mL zuiver DCM bovenop het kiezelzuur bed. Elueer de kolom met een mengsel van tolueen en aceton (0-20% aceton in tolueen) en verzamelen breuken van 5-10 mL.
    23. Controleren van de verzamelde breuken door TLC, ontwikkelen met tolueen/aceton (7/3).
    24. Verdampen van het product met breuken met behulp van een rotatieverdamper om gewenste producten 4, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6- O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl-fluoride (54% over 2 stappen) en 5, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L-fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl fluoride (67% over 2 stappen) als witte vaste stoffen.
    25. Kenmerken van het product door NMR en massaspectrometrie (Zie aanvullende gegevensbestand).

2. bereiding van Glycan 10

  1. Voorbereiding van intermidiate 7
    1. Weeg zilveren triflaat (AgOTf) (0.039 g, 0.155 mmol) bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride (Cp2HfCl2) (0.041 g, 0.108 mmol) in een maatkolf van 25 mL single-nek ronde onderkant, droog het schlenk lijn vacuüm voor 30 min, verwijderen uit de vacuüm, en vul deze met stikstofgas.
    2. De vers gedroogde 4 Å moleculaire zeven (0.2 g) Pipetteer in de kolf met het AgOTf en Cp2HfCl2, toevoegen van een magnetische roer bar kap met het septum onmiddellijk en toevoegen van een stikstof ballon.
    3. Pipetteer 3 mL droge tolueen in de kolf met een droog glas spuit. Roer het reactiemengsel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en vervolgens afkoelen tot 0 oC.
    4. Injecteren van een oplossing van donor 4 (Figuur 2, 0.043 g, 0.046 mmol) en acceptor 6, 5-Azidopentyl-O-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranoside (Figuur 3, 0.045 g, 0.031 mmol) in 3 mL tolueen in de kolf door middel van het septum met behulp van een 10 mL spuit op 0 o C. Roer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 3 uur.
    5. Achter TLC verbruik geeft van grondstoffen (TLC, ontwikkelen met DCM/aceton (8,5/1.5) en visualiseren door UV-absorptie bij 254 nm of door kleuring met een oplossing van cerium ammoniummolybdaat gevolgd door verwarming), de reactie door injecterend 10 quench equivalenten van triethyl amine.
    6. De moleculaire zeven door middel van een celite bed filtreer in een maatkolf van 50 mL Rondbodemkolf, en verder was met 10 mL ethylacetaat. Pak de gecombineerde organische lagen met een verzadigde oplossing voor waterige NaHCO3 (2 x 20 mL) in een 50 mL separatory trechter. Pak de waterige laag met ethylacetaat (3 x 15 mL).
    7. Extract van de gecombineerde organische lagen met verzadigde NaCl-oplossing (5 mL), droog het met behulp van watervrij magnesium-sulfaat, filteren het mengsel te verwijderen van de magnesium-sulfaat, wassen met ethylacetaat (3 x 15 mL), en vang het filtraat op in een kolf met ronde bodem in 100 mL.
    8. Damp het oplosmiddel met behulp van een rotatieverdamper bij 240 mbar vacuüm druk bij 40 oC.
    9. De oplossing van ruwe product in DCM bovenop de silica bed kolom worden geladen. De kolom Elueer met een mengsel met DCM en aceton (0-10% aceton in DCM) en verzamelen van breuken van 5-10 mL.
    10. Controleren van de verzamelde breuken door TLC, ontwikkelen met DCM/aceton (8,5/1.5). Verdampen van het product met behulp van een roterende verdamper te verkrijgen intermidiate 7, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[met breuken 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-( 2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranoside (0.052 g, 70%), als witte schuim.
    11. Kenmerken van het product door NMR en massaspectrometrie (Zie aanvullende gegevensbestand).
  2. Voorbereiding van intermidiate 8
    1. Weeg hexasaccharide 7 (Figuur 3, 0.040 g, 0,016 mmol) in een maatkolf van 25 mL single-nek ronde onderkant, droog het onder drukvermindering voor 1 h verwijderen uit vacuüm, vullen met stikstofgas, toevoegen van een magnetische roer bar en kapje met een rubber tussenschot.
    2. 3 mL acetonitrile:methanol (MeOH) (2:1 ratio) Pipetteer in de kolf.
    3. Toevoegen van p-tolueen sulfonzuur monohydraat (0,001 g, 0.008 mmol) in de reactiekolf toe en roer de reactie bij 800 rpm voor 5 h.
    4. Achter TLC geeft aan comsumption van de grondstof (TLC, ontwikkelen met DCM/aceton (8,5/1.5) en visualiseren door UV-absorptie bij 254 nm of door kleuring met een oplossing van cerium ammoniummolybdaat gevolgd door verwarming), de reactie door injecterend 10 quench equivalenten van triethyl amine.
    5. Damp het oplosmiddel met behulp van een rotatieverdamper bij 337 mbar vacuüm druk bij 40 oC.
    6. Los van het ruwe mengsel met ongeveer 2 mL DCM en laden op de top van het kiezelzuur bed.
    7. Elueer de kolom met een mengsel van DCM en aceton (0 - 10% aceton in DCM) en verzamelen breuken van 5-10 mL. Controleren van de verzamelde breuken door TLC, ontwikkelen met DCM/aceton (8,5/1.5). Damp het oplosmiddel met behulp van een rotatieverdamper bij 400 mbar vacuüm en 40 oC.
    8. Droog het residu onder verlaagde druk te geven van de tussenliggende 8, 5-Azidopentyl-O-(2-O-acetyl-3,4,6-tri-O-benzyl-ced pressure to give →3)-2-O-acetyl-4, 6-O-benzylidine-β - D - mannopyranosyl-(1→4) - O-(3,6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6 - di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-nzyl-2-deoxy-2-phth. (Figuur 3, 0.022 g, 57%) als een witte vaste stof. Kenmerken van het product door NMR en massaspectrometrie (Zie aanvullende gegevensbestand).
  3. Voorbereiding van intermidiate 9
    1. Voorbereiding van intermidiate 9 (Figuur 3) kwam tot stand met behulp van donor 5 (0,015 g, 13.2 µmol) en acceptor 8 (Figuur 3, 0.020 g, 8.80 µmol).
    2. AgOTf (0.011 g, 44,1 µmol) en Cp2HfCl2 (0.012 g, 30,8 µmol) werden gebruikt als een promotoren.
    3. Voer de stappen uit 2.1.1 naar 2.1.10 om tussenliggende 9, 5-Azidopentyl - O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-3-d-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-3-d-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-3-d-mannopyranosyl]} -(1→3)-{2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2- O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-D-glucopyra (0.010 g, 34%), as witte schuim.
  4. Wereldwijde deprotection van intermidiate
    1. Weeg samengestelde 9 (0,010 g, 2.9 µmol) in een rondbodemkolf 25 mL-single-nek, toevoegen van een magnetische roer bar, cap met een rubber tussenschot, en koppelen van een stikstof-ballon.
    2. Pipetteer 2 mL van 1, 4 dioxaan: H2O (4:1) in de destillatiekolf. Voeg lithium hydroxide (LiOH) (0,005 g, 50% door PM) in de kolf. Roer het reactiemengsel bij 90-100 oC gedurende 12 uur en laat ze afkoelen op RT.
    3. Verdampen de oplosmiddelen met behulp van een rotatieverdamper drooggedampt en drogen van de erlenmeyer onder drukvermindering voor 1 h, vullen met stikstof verwijderen uit het vacuüm variëteit en kapje met een rubber tussenschot.
    4. Injecteren van 4 mL droge pyridine en 2 mL azijnzuur-anhydride in de kolf door middel van het septum met behulp van een 10 mL spuit bij 0 oC. Roer het reactiemengsel voor 12u op RT.
    5. Verdampen de oplosmiddelen met behulp van een rotatieverdamper bij 0-10 mbar vacuüm druk bij 50 oC.
    6. Los van het ruwe mengsel met behulp van 30 mL van DCM en uitpakken van de oplossing met verzadigde waterige NaHCO3 (2 x 20 mL) in een 50 mL separatory trechter.
    7. Opnieuw uitpakken de waterige laag met DCM (3 x 15 mL). Damp het oplosmiddel met een rotatieverdamper.
    8. Het laden van een oplossing van het product in ongeveer 2 mL DCM bovenop het C18 silica bed. Elueer de kolom met een mengsel van water en het methanol (0 - 100% methanol in water) en het verzamelen van breuken van 5-10 mL.
    9. Verzamelen van de product-fracties en verdampen onder verlaagde druk om gewenste product als de witte schuim te krijgen.
    10. Los van het product in 5 mL droge methanol in een 25 mL ronde onderkant kolf en het kapje met een rubber tussenschot.
    11. Breng 0,1 mL van natrium methoxide (NaOMe) in methanol en cool 0 oC met behulp van een ijsbad en roer het mengsel voor 12u.
    12. Verwijder het oplosmiddel met behulp van een rotatieverdamper drooggedampt en het product onder hoge vacuüm drogen.
    13. Los van de ruwe producten in 5 mL methanol: H2O: azijnzuur (6:3:1).
    14. Toevoegen van palladium hydroxide (Pd(OH)2) (50% door wt) en roer de reactie onder waterstof sfeer met behulp van een waterstof-ballon voor 15u.
    15. Filteren van de reactie via een celite-bed en wassen met 2 mL methanol, gevolgd door 2 mL dd water.
    16. Verdampen de oplosmiddelen met een rotatieverdamper.
    17. Los van het ruwe mengsel met ongeveer 1 mL water en het laden op de top van het polyacrylamidegel bed (Zie Tabel van materialen). Elueer van het product met water en het verzamelen van breuken voor 1-2 mL.
    18. Controleren van de verzamelde breuken door TLC, ontwikkelen met n-butanol: H2O: azijnzuur (1:1:1).
    19. Verzamelen van de product-fracties en lyophilize om de gewenste product 10, 5-Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-( α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (0.002 g, 36%), as a wit poeder.
    20. Kenmerken van het product door NMR en massaspectrometrie (Zie aanvullende gegevensbestand).

3. bereiding van glycanen met Phosphonic zuur staart19,22

  1. Weeg de respectieve glycan (2-5 µmol) in een 5 mL-Rondbodemkolf, toevoegen van een magnetische roer bar en kapje met een rubber tussenschot.
  2. Breng 400 µL van vers gedroogde dimethylformamide.
  3. Toevoegen [2 (2 (2 (bis (benzyloxy) gebondenkleurstof) ethoxyethoxy) ethyl (2, 5-dioxopyrrolidin1-yl) carbonaat] (10-25 µmol, bereid in huis) aan de oplossing van glycan. Roer het mengsel bij 800 rpm voor 5 h.
  4. Verdampen de oplosmiddelen met behulp van een rotatieverdamper bij 5-10 mbar vacuüm druk bij 40 oC.
  5. Los van het reactiemengsel in 0,5 mL water en laden aan de bovenkant van het polyacrylamidegel bed (Zie Tabel van materialen). Elueer van het product met behulp van water en het verzamelen van breuken voor 1-2 mL.
  6. De verzamelde breuken door TLC26volgen. Ter plaatse van het reactiemengsel op een TLC-plaat, en toevoegen van vlek oplossing van 0,25 M cerium ammoniummolybdaat; Volg door te verwarmen met behulp van een warmhoudplaat. Verzamelen van het product met breuken en lyophilize om het gewenste product als een wit poeder.
  7. Los van het product in 2 mL water en voeg Pd (OH)2 (50% van het gewicht). Roer de reactie bij 800 rpm onder waterstof sfeer met behulp van een waterstof-ballon voor 15u.
  8. De reactie via een bed flux-gegloeid filteren en wassen met 2 mL methanol, gevolgd door 2 mL gedestilleerd-geïoniseerd water. Verdampen de oplosmiddelen met behulp van een rotatieverdamper bij 300 mbar vacuüm druk bij 40 oC.
  9. Los van het ruwe mengsel met ongeveer 1 mL water en het laden op de top van het polyacrylamidegel bed (Zie Tabel van materialen).
  10. Elueer van het product met water en het verzamelen van breuken voor 1-2 mL. De verzamelde breuken door TLC26volgen. Lyophilize van de breuken (bevriezen van het product met behulp van vloeibare stikstof dan plaats op lyophilizer onder een vacuüm) om het gewenste product als een wit poeder. Karakteriseren de producten door NMR en massaspectrometrie (Zie aanvullende gegevensbestand) D2O gebruikt als oplosmiddel.

4. Glycan matrix

  1. Voorbereiding van aluminium gecoat glas dia's (ACG dia) 19 , 20 , 22
    Opmerking: Fabricage van de dia's van aluminium-gecoat glas werd uitgevoerd bij Thin Film Technology divisie, Instrument Technology Research Center en nationale toegepast Research Laboratories, wetenschapspark Hsinchu, Taiwan.
    1. Pak gecoate dia's, vacuüm-seal hen te voorkomen van de vorming van NAO, en houden verzegeld tot de elektrochemische reactie voor oppervlakte anodisatie.
  2. Oppervlakte anodisatie voor aluminium gecoat glas dia 's 19 , 20 , 22
    1. Stel de temperatuurregeling incubator bij 4 ° C. Bereiden van 0,3 M oxaalzuur waterige oplossing en bewaar deze in een ijsbad. Neem het bekerglas van 500 mL, voeg een magneetroerder bar.
    2. De 0,3 M oxaalzuur overbrengen in het bekerglas van 500 mL, en plaats dan een 10 cm lange platina staaf als een kathode in de oplossing. Blijf roeren (op 300 rpm) het oxaalzuur gedurende het gehele proces anodisatie.
    3. Inschakelen van lab tracer software, klikken op de "set up" knop en vervolgens "functioneren keuze sweep spanning." Instellen van het begin en stoppen met spanning naar 25,8 V, aantal punten tot 100, naleving van 1, en vegen vertraging aan 1200 ms en klik "ok".
    4. Klem de kant van de aluminium-gecoat glas naar de richting van de kathode. Klik op de knop "run test". Observeer de huidige meting (~ 8-10 mA).
    5. Na oppervlakte anodisatie, de dia grondig met dubbel gedestilleerd water wassen, zuiveren droog met stikstofgas en vervolgens opslaan in een kamer van 30% relatieve luchtvochtigheid tot verder gebruik.
  3. Fabricage van ACG glycan microarray 22
    1. Bereiden 100 µL van alle monovalent glycanen (I-XI) afzonderlijk in ethyleen glycol op concentratie van 10 mM.
    2. Verdun de bovenstaande glycan met afdrukken buffer (80% ethyleenglycol en 20%-geïoniseerd water) zodat 100 µM concentratie.
    3. Hetero-ligand studie, 5 µL van individuele ik-XI glycanen bereiden en toevoegen aan elk 5 µL van de Man5GlcNAc2 (1:1 verhouding).
    4. Print microarrays door robotic pin (Zie Tabel van materialen) door de afzetting van 0,6 nL van de eerder bereid glycanen op ACG dia's31.
    5. De afgedrukte dia's opslaan in een droge doos van de vochtigheid gecontroleerd voordat de bindende bepaling.
  4. Mapping glycan epitopen van HIV-1 in grote lijnen neutraliserende antilichamen PG9 22
    1. Bereiden 1 mL BSA bevatte PBST buffer, 3% w/v.
    2. Bereiden van 70 µL van PG9 (50 µg/mL) in PBST buffer (BSA vervat PBST buffer, 3% m/v).
    3. Bereiden van 120 µL van secundaire fluorescerende label antilichaam Donkey anti-menselijke IgG (Alexa Fluor 647 geconjugeerd) 50 µg Fe/mL in PBST buffer (BSA vervat PBST buffer, 3% m/v) in het donker.
    4. Meng primair antilichaam (PG9) en secundaire fluorescerende label antilichaam in 1:1 verhouding (elke 60 µL). Incubeer voorgemengde antilichamen voor 30 min bij 4 ° C.
    5. Laad de ACG dia in de dia incubatie kamer die is onderverdeeld in 16 wells. Breng 100 µL van voorgemengde antilichamen aan de glycan array en Incubeer bij 4 ° C voor 16 h.
    6. Pipetteer uit voorgemengde antilichamen. Verwijder de dia incubatie kamer.
    7. De dia eerst wassen in PBST buffer (PBS en 0,05% Tween-20), gevolgd door de geïoniseerd water en droog bij 2.000 x g spin.
    8. Open de software van de analyse van het beeld van microarray (Zie Tabel van materialen). Een dia invoegen met de gekleed functies naar beneden.
    9. Klik op het menu "instellingen", stel de beeldresolutie op 5 µm per pixel en de golflengte op 635 nm met PMT450 en Power op 100%.
    10. Klik op de "scan" knop om te beginnen met de dia imaging.
    11. Klik op het pictogram van het "bestand" de scan als afbeelding wilt opslaan in de tif-indeling.
    12. Beeld analyses uit te voeren door het volgen van de softwaregebruiker gids32.
    13. Berekenen van de totale intensiteit van de fluorescentie en illustreren met behulp van beeld processing software33 (Zie Tabel van materialen).
      Opmerking: Hier is de fout van het gemiddelde percentage voor alle gegevenspunten gepresenteerd door foutbalken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een modulaire chemo-enzymatische strategie voor de synthese van een breed scala van N -glycanen wordt gepresenteerd in Figuur 1. De strategie is gebaseerd op het feit dat de diversiteit aan begin kan worden gemaakt door chemo-enzymatische synthese van de drie belangrijke modules, gevolgd door de α-specifieke mannosylation op de 3-O en/of 6-O positie van het mannose residu van het gemeenschappelijk Core trisaccharide van N- ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een klasse van HIV-1 bNAbs met inbegrip van PG9, PG16 en PGTs 128, 141-145 zeer krachtig in het neutraliseren van 70-80% van het circulerende HIV-1 isolaten werden gemeld. De epitopes van deze bNAbs zijn zeer bewaard onder de varianten van de hele HIV-1 groep M, dus zij kunnen begeleiden de effectieve immunogeen ontwerp voor een HIV-vaccin te ontlokken van neutraliserende antilichamen23,24,25 . Als een onderdeel van onze voortdu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken de Thin Film Technology divisie, Instrument technologie Research Center (ITRC) en nationale toegepast Research Laboratories, wetenschapspark Hsinchu, Taiwan. Dit werk werd gesteund door de nationale Raad voor Wetenschappen (verlenen neen. MEESTE 105-0210-01-13-01) en de Academia Sinica.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AzijnzuurSigma Aldrich64197
AcetonitrilSigma Aldrich75058
AzijnzuuranhydrideSigma Aldrich108247
Watervrij magnesiumsulfaatSigma Aldrich7487889
Boortrifluoride ethyletheraatSigma Aldrich109637
RundserumalbumineSigma Aldrich9048468
Bio-Gel P2 polyacrylamideBio-Rad1504118
Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichlorideSigma Aldrich12116664
β-1, 4 Galactosyl transferases van rundse melkSigma Aldrich48279
BioDot Cartesion technologie met robotische pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins)Arrayit
Ceriu ammonium molybdaatTCIC1794
Ceriu ammonium nitraatSigma Aldrich16774213
Schone glazen plaat Schott 
Cytidine-5'-monofosfo-N-acetylneuraminzuurSigma Aldrich3063716
Gedeutereerd chloroformSigma Aldrich865496
Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 geconjugeerdJackson Immuno Research, USA709605098
DichloormethaanSigma Aldrich75092
DiethylaminozwaveltrifluorideSigma Aldrich38078090
DimethylformamideSigma Aldrich68122
EthylacetaatSigma Aldrich141786
EthyleenglycolAcros Organic107211
FAST frame slide incubatiekamersSigma Aldrich
Guanosine 5'-difosfo-b-L-fucose dinatriumzout Sigma Aldrich15839700
Lab tracer 2.0 software Sectie 4 van het protocol
GenePix Pro 4300A lezer (microarray beeldanalyse)moleculardeviceswww.moleculardevices.com
GraphPad Prism Software (Beeldverwerking )GraphPad Software, Inchttp://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
LithiumhydroxideSigma Aldrich1310652
ManganchlorideSigma Aldrich7773015
MethanolSigma Aldrich67561
N-butanolSigma Aldrich71363
OxalzuurAcros Organic144627
PalladiumhydroxideSigma Aldrich12135227
Fosfaat gebufferde zoutoplossingThermo Fisher Scientific 10010023
PyridineSigma Aldrich110861
P-Tolueen sulfonzuur monohydraatSigma Aldrich773476
ZilvertriflaatSigma Aldrich2923286
NatriumbicarbonaatSigma Aldrich144558
NatriumchlorideSigma Aldrich7647145
NatriumwaterstofcarbonaatSigma Aldrich144558
Natriummethoxide Sigma Aldrich124414
NatriumsulfaatSigma Aldrich7757826
Tolueen Sigma Aldrich108883
Tris buffer AmrescoN/AUltra-pure grade
Tween-20Amresco9005645
Uridine difosfaat galactose (UDP-galactose)Sigma Aldrich137868521

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells. PloS one. 4, e7317(2009).
  2. Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L. Conserved Role of an N-Linked Glycan on the Surface Antigen of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Modulating Virus Sensitivity to Broadly Neutralizing Antibodies Against the Receptor and Coreceptor Binding Sites. J.virol. 90, 829-841 (2015).
  3. Wang, Z., et al. A General Strategy for the Chemoenzymatic Synthesis of Asymmetrically Branched N-Glycans. Science. 341, 379-383 (2013).
  4. Li, L., et al. Efficient Chemoenzymatic Synthesis of an N-glycan Isomer Library. Chem Sci. 6, 5652-5661 (2015).
  5. Pritchard, L. K., Harvey, D. J., Bonomelli, C., Crispin, M., Doores, K. J. Cell- and Protein-Directed Glycosylation of Native Cleaved HIV-1 Envelope. J.Virol. 89, 8932-8944 (2015).
  6. Behrens, A. J., et al. Composition and Antigenic Effects of Individual Glycan Sites of a Trimeric HIV-1 Envelope Glycoprotein. Cell Rep. 14, 2695-2706 (2016).
  7. Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455, 613-619 (2008).
  8. Horiya, S., MacPherson, I. S., Krauss, I. J. Recent Strategies Targeting HIV Glycans in Vaccine Design. Nat Chem Bio. 10, 990-999 (2014).
  9. Wang, L. X. Synthetic carbohydrate Antigens for HIV Vaccine Design. Curr Opin Chem Biol. 17, 997-1005 (2013).
  10. Tian, J., et al. Effect of Glycosylation on an Immunodominant Region in the V1V2 Variable Domain of the HIV-1 Envelope gp120 Protein. PLoS Comput Biol. 12, e1005094(2016).
  11. Geyer, H., Holschbach, C., Hunsmann, G., Schneider, J. Carbohydrates of human Immunodeficiency Virus. Structures of Oligosaccharides Linked to the Envelope Glycoprotein 120. The J Bio Chem. 263, 11760-11767 (1988).
  12. Lee, J. H., Ozorowski, G., Ward, A. B. Cryo-EM Structure of A Native, Fully Glycosylated, Cleaved HIV-1 Envelope Trimer. Science. 351, 1043-1048 (2016).
  13. Lonardi, E., Balog, C. I., Deelder, A. M., Wuhrer, M. Natural GlycanMicroarrays. Expert Rev Proteomics. 7, 761-774 (2010).
  14. Paulson, J. C., Blixt, O., Collins, B. E. Sweet Spots in Functional Glycomics. Nat. Chem. Bio. 2, 238-248 (2006).
  15. Dotsey, E. Y., et al. A High Throughput Protein Microarray Approach to Classify HIV Monoclonal Antibodies and Variant Antigens. PLoS One. 10, e0125581(2015).
  16. Wu, C. Y., Liang, P. H., Wong, C. H. New Development of Glycan Arrays. Org Biomol Chem. 7, 2247-2254 (2009).
  17. Scurr, D. J., et al. Surface Characterization of Carbohydrate Microarrays. Langmuir. 26, 17143-17155 (2010).
  18. Blixt, O., et al. Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  19. Chang, S. H., et al. Glycan Array on Aluminum Oxide-Coated Glass Slides Through Phosphonate Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 132, 13371-13380 (2010).
  20. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1, 773-783 (2016).
  21. Shivatare, S. S., et al. Efficient Convergent Synthesis of Bi-, Tri-, and Tetra-Antennary Complex Type N-Glycans and Their HIV-1 Antigenicity. J. Am. Chem. Soc. 135, 15382-15391 (2013).
  22. Shivatare, S. S., et al. Modular synthesis of N-Glycans and Arrays for the Hetero-Ligand Binding Analysis of HIV Antibodies. Nat Chem. 8, 338-346 (2016).
  23. McLellan, J. S., et al. Structure of Hiv-1 gp120 V1/V2 Domain with Broadly Neutralizing Antibody PG9. Nature. 480, 336-343 (2011).
  24. Julien, J. P., et al. Asymmetric Recognition of the HIV-1 Trimer by Broadly Neutralizing Antibody PG9. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4351-4356 (2013).
  25. Willis, J. R., et al. Long Antibody HCDR3s from HIV-Native Donors Presented on a PG9 Neutralizing Antibody Background Mediate HIV Neutralization. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4446-4451 (2016).
  26. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Performing 1D Thin Layer Chromatography. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  27. de Castro, M. D., et al. A useful approach to the automation of analytical processes? J Automat Chem. 12, 267-279 (1990).
  28. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  29. JoVE Science Education Database. Essentials of Analytical Chemistry. Introduction to Mass Spectrometry. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  30. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1 (5), 773-783 (2016).
  31. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  32. GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial. , Axon Instruments/ Molecular Devices Corp. Sunnyvale, CA. (2017).
  33. GraphPad Prism version 6.01 for Windows. GraphPad Software. , La Jolla California USA. Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

N glycaan arrayglycaan microarrayaluminiumoxideglasheteroligandbindingPG9 antilichaammassaspectrometrieoppervlakteanodisatieglycaansynthese

Gerelateerde artikelen