Methodenartikel

PIP-on-a-chip: een labelvrije studie van eiwit-fosfoinositide-interacties

8.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55869

⸱

27 juli 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Pennsylvania State University, 2Department of Chemistry, The Pennsylvania State University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een ondersteunde lipid bilayer in het kader van een microfluïdisch platform om eiwit-fosfoinositide interacties te bestuderen met behulp van een etiketvrije methode op basis van pH-modulatie.

Samenvatting

Talrijke cellulaire eiwitten interageren met membraanoppervlakken om essentiële cellulaire processen te beïnvloeden. Deze interacties kunnen gericht zijn op een specifieke lipidcomponent binnen een membraan, zoals bij fosfoinositiden (PIP's), om specifieke subcellulaire lokalisatie en / of activatie te waarborgen. PIP's en cellulaire PIP-bindende domeinen zijn uitgebreid bestudeerd om hun rol in cellulaire fysiologie beter te begrijpen. We hebben een pH-modulatie-analyse toegepast op ondersteunde lipid bilayers (SLB's) als middel om eiwit-PIP-interacties te bestuderen. In deze studies wordt pH-gevoelige ortho- sulforhodamine B geconjugeerde fosfatidylethanolamine gebruikt om eiwit-PIP-interacties te detecteren. Bij binding van een eiwit aan een PIP-bevattend membraanoppervlak wordt het grensvlakpotentiaal gemoduleerd ( dwz verandering in lokale pH), waarbij de protonatietoestand van de probe wordt verplaatst. Een casestudy van het succesvolle gebruik van de pH-modulatie-analyse wordt gepresenteerd door gebruik te maken van fosfolipase C delta1 Pleckstrin Homologie (PLC-δ1 PH) domein en fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat (PI (4,5) P2) interactie voorbeeld. De schijnbare dissociatieconstante ( Kd , app ) voor deze interactie was 0,39 ± 0,05 μM, vergelijkbaar met Kd , appwaarden verkregen door anderen. Zoals eerder opgemerkt, de PLC-δ1 PH domein PI (4,5) P2 bepaald, toont zwakkere binding aan fosfatidylinositol-4-fosfaat en geen binding aan zuiver fosfatidylcholine SLBs. De PIP-op-een-chip-analyse is voordelig boven de traditionele PIP-bindingsassays, waaronder maar niet beperkt tot een laag monstervolume en geen eisen voor ligand / receptor-etikettering, het vermogen om membraaninteracties met hoge en lage affiniteit te testen met zowel kleine als Grote moleculen, en verbeterde signaal-ruisverhouding. Bijgevolg zal het gebruik van de PIP-on-a-chip-aanpak het verhelderen van mechanismen van een breed scala van membraaninteracties vergemakkelijken. Bovendien kan deze methode u mogelijk zijnSed in identificerende therapieën die het vermogen van eiwit om met membranen te interageren moduleren.

Inleiding

Myriade interacties en biochemische processen vinden plaats op tweedimensionale vloeistof membraanoppervlakken. Membraan-omsloten organellen in eukaryote cellen zijn uniek, niet alleen in biochemische processen en hun bijbehorende proteome maar ook in hun lipidsamenstelling. Een uitzonderlijke klasse fosfolipiden is fosfoinositiden (PIP's). Hoewel ze slechts 1% van het cellulair lipidoom omvatten, spelen ze een cruciale rol in signaaltransductie, autofagie en membraanhandel, onder andere 1 , 2 , 3 , 4 . Dynamische fosforylering van de inositol-hoofdgroep door cellulaire PIP-kinasen leidt tot zeven PIP-hoofdgroepen die mono-, bis- of trisfosforyleerd zijn 5 . Bovendien definiëren PIP's de subcellulaire identiteit van membranen en dienen als gespecialiseerde membraan docking sites voor proteïnen / enzymen die één of meer fosfoïnen bevattenBindende domeinen, bijvoorbeeld Pleckstrin Homology (PH), Phox Homology (PX) en epsin N-terminale Homology (ENTH) 6 , 7 . Een van de best bestudeerde PIP-bindende domeinen is fosfolipase C (PLC) -δ1 PH domein dat specifiek interageert met fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat (PI (4,5) P2) bij een hoge nanomolaire laag micromolaire gebied affiniteit 8 , 9 , 10 , 11 .

Er zijn verschillende kwalitatieve en kwantitatieve in vitro methoden ontwikkeld en gebruikt om het mechanisme, de thermodynamica en de specificiteit van deze interacties te bestuderen. Onder de meest gebruikelijke PIP-bindende assays zijn oppervlakte plasmon resonantie (SPR), isothermale calorimetrie (ITC), NMR-spectroscopie, liposome flotatie / sedimentatie assay en lipide-blots (Fat-blots / PIP-strips)12 , 13 . Alhoewel deze uitgebreid worden gebruikt, hebben ze allemaal veel nadelen. Bijvoorbeeld, SPR, ITC en NMR vereisen grote hoeveelheden monster, dure instrumentatie en / of getraind personeel 12 , 13 . Enkele assayformaten zoals antilichamen gebaseerde lipide-blots gebruiken wateroplosbare vormen van PIP's en presenteren ze op een nonfysiologische wijze 12 , 14 , 15 , 16 . Bovendien kunnen lipide-blots niet betrouwbaar worden gekwantificeerd en hebben ze vaak geleid tot valse positieve / negatieve waarnemingen 12 , 17 , 18 . Om deze uitdagingen te overwinnen en te verbeteren op de huidige gereedschapsset werd een nieuwe labelvrije methode op basis van een ondersteunde lipid bilayer (SLB) opgesteld in het kader van am Microfluidisch platform, dat succesvol werd toegepast op de studie van eiwit-PIP-interacties ( Figuur 1 ) 19 .

De strategie die wordt gebruikt voor het detecteren van eiwit-PIP-interacties is gebaseerd op pH-modulatie detectie. Dit omvat een pH-gevoelige kleurstof die ortho- sulforhodamine B ( o SRB) direct geconjugeerd is met fosfatidylethanolamine lipide hoofdgroep 20 . O SRB-POPE probe (Figuur 2A) is sterk fluorescerende bij lage pH en geblust bij hoge pH met een pKa ongeveer 6,7 bij 7,5 mol% PI (4,5) P2 bevattende SLBs (Figuur 5B). PLC-δ1 PH domein is uitgebreid gebruikt voor het valideren eiwit-PIP-bindende methoden vanwege de hoge specificiteit voor PI (4,5) P2 (figuur 5A) 21, 22,"> 23, 24, 25 .Hence, redeneerden we dat de PLC-δ1 PH-domein kan worden gebruikt om te testen de binding aan PI (4,5) P2 via het PIP-on-a-chip assay. Het PH-gebied construct in deze studie gebruikte een netto positieve lading (pi 8,4), en daardoor aantrekt OH -. ionen (figuur 5C) bij binding aan PI (4,5) P2 bevattende SLBs, het PH domein brengt de OH - ionen aan de Membraanoppervlak, dat op zijn beurt het grensvlakpotentiaal moduleert en de protonatietoestand van o SRB-POPE ( Figuur 5C ) 26 verplaatst. Als een functie van de PH-domeinconcentratie wordt de fluorescentie uitgeblust ( Figuur 6A ). Ten slotte zijn de genormaliseerde gegevens passen bij een bindingsisotherm om de affiniteit van het PH-domein-PI (4,5) P2 interactie (Figuur 6B, 6C). bepalen

In deze studie wordt een gedetailleerd protocol verstrekt om eiwitbinding uit te voeren naar PIP-bevattende SLB's in een microfluïdisch platform. Dit protocol neemt de lezer van het samenstellen van het microfluïdische apparaat en de vesikelpreparatie op SLB-vorming en eiwitbinding. Bovendien aanwijzingen voor gegevensanalyse affiniteitinformatie voor PLC-δ1 PH domein-PI (4,5) P2 interactie verschaft extraheren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Reiniging van de glazen dekjes

  1. Verdun 7x Schoonmaakoplossing (zie Materialetafel ) 7-voudig met gedeïoniseerd water in een 100 mm diep borosilicaatglasschotel met een platte bodem en verhit het tot 95 ° C op een kookplaat voor 20 minuten of tot de bewolkte oplossing duidelijk wordt .
    OPMERKING: De oplossing wordt heet, gebruik voorzichtigheid om lichamelijk letsel te vermijden. De 7x Reinigingsoplossing is een eigengemaakt mengsel van hexasodium [oxido- [oxido (fosfonatooxy) fosforyl] oxyfosforyl] fosfaat, 2- (2-butoxyethoxy) ethanol, natrium 1,4-bis (2-ethylhexoxy) -1,4-dioxobutaan -2-sulfonaat en niet-gevaarlijke toevoegingen.
  2. Met behulp van tweezers regelt u de dekglazen (40 mm lengte x 22 mm breedte x 0,16-0,19 mm hoogte) op een aluminium vlekrek in afwisselende richtingen. Houd een lege plek tussen elke deklaag om te voorkomen dat ze elkaar aanraken.
  3. Vul het vlekrek volledig met de deklagen in de schoonmaakoplossing. Houd de deklagen inDe oplossing gedurende 1 uur.
    OPMERKING: Als het water verdampt, houd het toevoegen van vers gedeïoniseerd water om de oplossingconcentratie ongewijzigd te houden.
  4. Verwijder de vlekrekjes uit de schoonmaakoplossing en was de dekglazen met overvloedig hoeveelheden gedeïoniseerd water om het wasmiddel te verwijderen.
  5. Droog de dekglazen met stikstofgas (ongeveer 5 minuten per vlekrek) en plaats de dekglazen in een oven voor 6 uur bij 550 ° C voor het gloeien.
    OPMERKING: Dit is een cruciale stap die ruwe eigenschappen op het glasoppervlak vergemakkelijkt.
  6. Plaats de dekglazen in een plastic houder en houd ze weg van stof.

2. Fabricage van Micropatterned PDMS Blocks

  1. Meng polydimethylsiloxaan (PDMS) prepolymeer en het verhardingsmiddel bij een verhouding van 10: 1 (w / w) in een grote plastic weegboot en ontlucht het in vacuüm gedurende 1 uur met vacuümsterkte bij 500 Torr of minder.
    OPMERKING: PDMS is een transparant en inert siliconenpolymeer. Om het gewenste PDMS blok t te krijgenHikheid (0,5 cm), meng 55 g van het prepolymeer met 5,5 g van het verhardingsmiddel.
  2. Plaats de siliciummeester die meerdere replicaten van dezelfde SU-8 micropattern bevat in een grote (10 cm basis diameter) plastic weegboot en giet de afgegasde PDMS in. Zet het vervolgens in een droge oven bij 60 ° C overnacht.
    OPMERKING: Micropatterns zijn groot genoeg om te zien met het blote oog. Elk patroon bevat 8 microkanalen (100 μm breedte x 40 μm hoogte x 1 cm lengte) met een tussenafstand van 40 μm ( Figuur 1A , 1B ). Silicon wafer vorm bestaande uit hard gebakken SU-8 fotoresist was vervaardigd in een nanofabricatie faciliteit 27 . Andere benaderingen voor masterbereiding zijn het etsen van hydrofluorzuur (HF), hoge temperatuur water etsen, xurografie en 3D-afdrukken 28 , 29 , 30 , 31 . commercIal bronnen voor silicium master voorbereiding kunnen ook worden gebruikt. De patronen voor het microfluïdische apparaat werden ontworpen met een opmaaksoftware (zie tabel van materialen). Het originele bestand met het patroonontwerp wordt geleverd als aanvullend bestand "Pattern Design.dwg", die rechtstreeks aan de fabrikant kan worden verstrekt.
  3. Zet de PDMS voorzichtig af van de siliconenmeester met de handen. Merk de grenzen van elke micropattern in rechthoeken met behulp van een chirurgische scalpel en een liniaal. Snijd dan de PDMS in blokken.
  4. Punch 16 gaten (8 inlaten en 8 uitlaten per blok) aan beide uiteinden van elke microkanaal met een biopsiestempel (1,0 mm gat diameter) zoals aangegeven in figuur 3B .
  5. Breng tape over elk PDMS-blok aan om de micropatterns te beschermen tegen beschadiging en stof. Bewaar ze in een plastic container.

3. Het voorbereiden van kleine Unilamellaire Vesicles (SUV's)

OPMERKING: Negatieve controle tweelaagse samenstellingIs 99,5 mol% 1-palmitoyl-2-oleoyl- sn -glycero-3-fosfocholine (POPC) en 0,5 mol% ortho- sulforhodamine B-1-palmitoyl-2-oleoyl- sn -glycero-3-fosfoethanolamine ( o SRB- PAUS). Test-bilayer samenstelling is 92,0 mol% POPC, 0,5 mol% o SRB-POPE en 7,5 mol% van hetzij L-a-fosfatidylinositol-4-fosfaat (PI4P) of L-a-fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaat (PI 4,5) P2). Hieronder is de procedure voor het bereiden 92,0 mol% POPC, 0,5 mol% o SRB-POPE en 7,5 mol% PI (4,5) P2 bevattende SUV. De synthese van o SRB-POPE die in deze studie werd gebruikt werd 20 eerder beschreven.

  1. Bereken het volume van POPC, PI (4,5) P2 en o SRB-POPE dat moet gemengd, die goed is voor de volgende totale hoeveelheden: 2,22 mg POPC, 0,26 mg PI (4,5) P2, En 2,1 x 10 -5 mg o SRB-POPE.
  2. Pipet het berekende volume POPC, PI (4,5) P 2 , o SRB-POPE in een enkele 20 ml glazen scintillatie flesje.
    OPMERKING: POPC en o SRB-POPE voorraadoplossingen komen in een chloroformoplossing, terwijl de PI (4,5) P 2 (en andere fosfoinositiden) voorraad in een oplosmiddelmengsel van chloroform: methanol: water (20: 9: 1) komt. Voor nauwkeurigheid, nat de pipetpunt met chloroform voordat u het gebruikt. Voor de veiligheid moet deze stap in een chemische afzuigkap plaatsvinden.
  3. Droog het mengsel gedurende 10 minuten in een stroom stikstofgas in een chemische dampkap of tot het oplosmiddel verdampt en een dunne lipide film onderaan de fles vormt.
  4. Droog het mengsel onder vacuüm gedurende ≥ 3 uur bij een vacuümsterkte van 10 mTorr om eventuele resterende organische oplosmiddelen te verwijderen.
    OPMERKING: De 3 uur uitdrogingstijd is voldoende voor de schaal van SUV-voorbereiding die in dit protocol wordt beschreven, dat voldoende is voor 50 experimenten. Als een grotere schaal van SUV-voorbereiding nodig is, kan de nacht uitdroging worden uitgevoerd.
  5. Rehydrateer de drElke lipidfilm met 5 ml loopbuffer (20 mM HEPES, 100 mM NaCl, bij pH 7,0) en plaats 30 minuten bij een RT in een ultrasoonbad bij een werkfrequentie van 35 kHz.
    OPMERKING: Het mengen van de hoeveelheden lipiden die zijn gespecificeerd in stap 3.1 en het toevoegen van 5 ml loopbuffer in stap 3.5 levert een vesicelsuspensie op 0,5 mg / ml. Op dit stadium is de vesicelsuspensie een mix van unilamellaire en multilamellaire vesicles ( Figuur 2B ). De oplossing verschijnt roze / paars in kleur en relatief onbeleefd.
  6. Bevroren de vesicelsuspensie met vloeibaar stikstof en waterbad bij 40 ° C om unilamellaire vesicles te krijgen. Herhaal de vries-ontdooi 10 keer.
    OPMERKING: (Optioneel) Om de afwezigheid van niet-unilamellaire blaasjes in de suspensie te verzekeren, kan de centrifugeringsstap 32 , 33 worden toegepast.
  7. Extrudeer de vesicle suspensie door een 0,10 μm track-etched polycarbonaat membraan met behulp van een lipide extruder (zieTabel van materialen) om te verrijken voor SUV's. Herhaal de extrusie 10 keer.
    OPMERKING: een 15 ml conische buis kan worden gebruikt om de geëxtrudeerde blaasjes te verzamelen. De oplossing moet in dit stadium onduidelijk zijn. SUV-diameter kan bevestigd worden via dynamische lichtverspreiding (DLS) ( Figuur 2C ). SUV's zijn het beste geschikt voor het vormen van SLB's 34 .
  8. Bedek de kegelbuis met aluminiumfolie en berg deze bij 4 ° C tot het klaar is voor gebruik.

4. Montage van het microfluïdische apparaat

  1. Test de inlaten en uitlaten van het PDMS-blok voor verstopping door het gedeioniseerde water door de gaten te spuiten met een waterwasfles. Droog vervolgens het PDMS-blok met stikstofgas.
    OPMERKING: In deze stap worden ook stofdeeltjes verwijderd die binnen en / of tussen kanalen zijn opgesloten. Indien nodig, verwijder voorgevormde deklagen met stikstofgas om stofdeeltjes te verwijderen.
  2. Plaats het PDMS-blok en de voorreinigingDeklaag (zie rubriek 1) in het zuurstofplasma-systeem (zie tabel van de materialen) monsterkamer om gedurende 45 s met zuurstofplasma bloot te stellen aan 45 watt met stroominstelling bij 75 watt, zuurstofstroom bij 10 cm 3 / min en vacuümsterkte bij 200 mTorr .
  3. Plaats het patroonoppervlak van het PDMS-blok onmiddellijk na de zuurstofplasma-behandeling in contact met de deklaag. Druk voorzichtig op om luchtbellen op contactplaatsen te verwijderen.
  4. Plaats het apparaat gedurende 3 minuten op een kookplaat bij 100 ° C om de binding te verbeteren.
  5. Gebruik een natte pluisvrije doek ( bijv. Kimwipe) met 100% ethanol om stofdeeltjes van de bovenkant (PDMS) en de bodem (glas) van het apparaat te verwijderen. Plak dan het apparaat op een glasmicroscoopschuif.
    OPMERKING: Gebruik geen te grote hoeveelheid ethanol en voorkom dat ethanol in de inlaat- en uitlaatkanalen komt. Het uitvoeren van deze stap, terwijl het toestel nog steeds warm is, wordt aanbevolen om ervoor te zorgen dat de ethanol onmiddellijk verdampt. Glas micrOscopy glijbanen kunnen in 100% ethanoloplossing worden opgeslagen om stof en andere verontreinigingen te verwijderen.

5. Het vormen van ondersteunde lipide bilayers (SLB's)

  1. Breng 100 pi van PI (4,5) P2 bevattende SUV uit stap 3.8 in een 0,65 ml microcentrifugebuis. Pas de pH van de oplossing op op ~ 3,2 door 6.4 μL 0,2 N zoutzuur toe te voegen.
    OPMERKING: Bevestig de pH van de oplossing met een pH-meter uitgerust met een micro-pH-sonde (zie tabel van materialen).
  2. Pipetteer 10 μL van de pH-aangepaste SUV-oplossing in elk kanaal door de inlaat en druk de druk door de pipet tot de oplossing de uitlaat bereikt. Maak de tip van de pipet los en laat het op het apparaat vastzetten.
  3. Herhaal de bovenstaande stap voor elk kanaal en incubeer het apparaat gedurende 10 minuten bij RT.
    OPMERKING: Injectie van blaasjes in microkanalen moet onmiddellijk na de montage van het apparaat worden uitgevoerd.
  4. Snij sets van inlaat- en uitlaatbuizen, enzCh 60 cm (inlaatbuizen) en 8 cm (uitlaatbuizen) lang, respectievelijk.
    OPMERKING: Het snijden van de buis diagonaal en het creëren van een scherpe rand maakt het makkelijker om de buis in de ingangen en uitlaten te plaatsen. De uitlaatbuis moet een boogvorm hebben. De lengte van de inlaatbuizen kan variëren op basis van de microscoopopstelling. De inwendige diameter van de buis is 0,05 cm.
  5. Met behulp van een pincet sluit u de uitlaatpijp op het apparaat aan en tap het apparaat vervolgens op een microscoopfase.
  6. Submerge het ene uiteinde van de inlaatbuizen in 25 ml loopbuffer die in een conische buis zit, en plak het vast om ervoor te zorgen dat de buis is bevestigd.
  7. Plaats de conische buis op een hogere grond (~ 20 cm) dan het apparaat om de oplossing door de microkanalen door de zwaartekrachtstroom te duwen; Hiervoor kan een lab jack worden gebruikt.
  8. Voor elke inlaatbuis gebruik een spuit om 1 ml loopbuffer van het vrije uiteinde van de buis te trekken. Verwijder de pipetpunt uit de inlaat en plaats deVrij einde van de inlaatbuizen in het apparaat.
    OPMERKING: Introduceer een druppel loopbuffer op de inlaat om de kans te verminderen dat een luchtbubbel tijdens deze stap in het kanaal wordt geïntroduceerd. Nadat de inlaatbuis aan het apparaat is bevestigd, gebruik dan een lintvrije wipe om de overtollige buffer te verwijderen.
  9. Herhaal de bovenstaande stap om alle inlaatbuisstukken op het apparaat te verbinden.
    OPMERKING: Het stromen van de buffer door de kanalen helpt om overtollige blaasjes te verwijderen en de bilayer te compenseren naar de experimentele omstandigheden.
  10. Open de microscoopbesturingssoftware (zie tabel van materialen). Klik in het linker paneel op het tabblad 'Microscoop' en kies de '10X' doelstelling.
  11. Klik op 'Live' en dan 'Alexa 568' afbeelding iconen op de werkbalk. Met de fijne en cursus aanpassingsknoppen, focus op de microkanalen.
  12. Scan door het apparaat om de kwaliteit van de SLB's en de kanalen te controleren ( Figuur 8 ). Dan,Klik op het pictogram "FL Shutter Closed" op de werkbalk.
  13. Klik op het tabblad 'Acquisitie' en selecteer 'Belichtingstijd' onder 'Basisinstellingen'. Stel de belichtingstijd in op "200 ms".
  14. Klik in het linker paneel op "Multidimensionele overname" en selecteer onder het filtermenu het rode kanaal (gemarkeerd als "Alexa 568"). Klik dan op het menu 'time lapse', stel het tijdsinterval in op 5 minuten, duur tot 30 minuten en klik op 'Start'.
    OPMERKING: Op basis van de duur (30 min) en de stromingssnelheid (~ 1,0 μL / min) wordt 30 μL loopbuffer gebruikt om de SLB in een kanaal te compenseren, dwz 240 μL loopbuffer wordt gebruikt voor alle 8 kanalen.
  15. Selecteer het gereedschap 'Circle' onder het tabblad 'Maatregel' en teken een cirkel in elk kanaal. Klik met de rechtermuisknop terwijl de cirkel is geselecteerd en kies 'Eigenschappen'. Onder het tabblad 'Profiel', selecteer 'alle T' om de pagina te bekijkenFluorescentie-intensiteit als een functie van de tijd.
    1. Zorg ervoor dat deze curve een plateau bereikt, dat evenwicht aangeeft voordat u verder gaat naar de volgende stap.
  16. Verlaag de bufferoplossing op een gelijke grond als het apparaat om de stroom te stoppen.
  17. Sla het tijdverloopbestand op.

6. Testen PLC-δ1 PH domein interactie met PI (4,5) P2 bevattende SLBs

  1. Bereid verdunningen van het PH-domein op met behulp van de loopbuffer als verdunningsmiddel.
    OPMERKING: Aangezien er acht kanalen zijn in het apparaat, gebruik tenminste twee van hen voor lege controles. Kies de uiteinden aan elke kant en gebruik de overige kanalen voor eiwitverdunningen. De volgende PH-domeinconcentraties werden getest: 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 en 2,50 μM. Ongeveer 200 μl van elke verdunning was voldoende om binnen 30 minuten evenwicht te bereiken.
  2. Eén tegelijk, ontkoppel elke uitlaatpijp en breng 200 μL van elke eiwitverdunning aanHet uitlaatkanaal met een pipet. Zet geen druk uit, laat de zwaartekracht het werk doen. Maak de tip van de pipet los en laat het aan het microfluïdische apparaat bevestigen.
  3. Herhaal de bovenstaande stap voor elk kanaal en zorg ervoor dat luchtbellen tijdens dit proces niet in de kanalen worden geïntroduceerd.
  4. Verlaag de inlaatbuis naar een bodem onder het microfluïdische apparaat om het eiwit door de microkanalen te stromen. Tape het vrije uiteinde van de buis aan een afvalbak. Flow de eiwitverdunningen gedurende 30 minuten.
    OPMERKING: dit zal de stroom omdraaien en het eiwit in de kanalen laten introduceren. De tijd voor evenwicht en het benodigde volume van de eiwitverdunningen zal afhangen van de affiniteit van de interactie.
  5. Klik in het linker paneel van de software onder het tabblad 'Tijdsverloop' op 'Start' om opnieuw afbeeldingen te starten.
  6. Herhaal stap 5.15 om ervoor te zorgen dat evenwicht bereikt wordt. Wanneer het experiment is voltooid, sla de tijdsverloop ophet dossier.

7. Membraanvloeistof beoordelen

OPMERKING: Fluorescentie herstel Na Photobleaching (FRAP) moeten experimenten worden uitgevoerd met elke nieuwe partij SUV's en schoongemaakte glazen deklagen om ervoor te zorgen dat de SLB's vloeibaar zijn.

  1. Volg de procedure voor het reinigen van glazen deklagen (1.1-1.6), het vervaardigen van micropatterned PDMS-blokken (2.1-2.5), het voorbereiden van SUV's (3.1-3.8), het assembleren van het microfluïdische apparaat (4.1-4.5) en het vormen van SLB's (5.1-5.17) zoals eerder beschreven.
  2. Focus de microscoop op de bilayer, zet de belichtingstijd naar 200 ms en de binning tot 1.
  3. Foto-bleek een cirkelvormige vlek met een 532 nm, 2 mW laserstraal (13 μM radius). Onmiddellijk na fotolakken, begin elke 3 s voor de eerste 45 s elke 3 s afbeeldingen vast te leggen, gevolgd door een 30 s interval gedurende de rest van de tijd (15 min totale duur). Zodra de gegevensverzameling voltooid is, sla het tijdverloopbestand op.
  4. Selecteer de gebleekte aRea met behulp van het cirkel tekeninstrument om fluorescentie intensiteit waarden te verwijderen als een functie van de tijd. Daarnaast selecteert u nog twee gebieden in de buurt, één die overeenkomt met een ongebleekte regio en een die overeenkomt met een regio zonder SLB's.
  5. Bereken het fluorescentie herstel ( y ) met behulp van de volgende vergelijking:
    figure-protocol-1
    OPMERKING: Hier geeft F t de intensiteit van het gebleekte gebied als een functie van de tijd, F 1 staat voor de fluorescentie-intensiteit voor het bleken (gebruik 1 als een genormaliseerde waarde in dit geval); F 0 is de achtergrondintensiteit.
  6. Plot fluorescentie herstel (y-as) als een functie van de tijd (x-as) om een ​​FRAP-curve te genereren. Vervolgens past u de gegevens op een enkele exponentiële functie als volgt,
    figure-protocol-2
    OPMERKING: hier staat A voor de mobiele fractie en k is de kinetische constante voor de mobiele fractie, die wordt gebruikt om de half-tijd te berekenen naar herstel ( t 1/2 ):
    figure-protocol-3
  7. Gebruik de t 1/2 om de diffusieconstante ( D ) te berekenen:
    figure-protocol-4
    OPMERKING: hier staat R voor de straal van de laserstraal (13 μm). De diffusieconstante voor een vloeibare bilayer moet ≥1,0 ​​μm 2 / s zijn.

8. Verwerking van gegevens

OPMERKING: De routine van de data analyse zal afhankelijk zijn van de microscoop, beeldverwerkingssoftware en de curve-fit software die wordt gebruikt.

  1. Open de time-lapse-bestanden van eerder (vanaf stap 5.17) en daarna (vanaf stap 6.6) de PH-domein titreren. Ga naar het laatste frame van elk time-lapse bestand en doe een lijn scan over alle microkanalen om de fluoresc te verkrijgenEnce intensiteit data als functie van de afstand in pixels ( Figuur 6A ). Breng de gegevens over naar een spreadsheet software.
  2. Voor elke microkanaal (voor en na PH-domeintoevoeging), steek een aantal gegevens uit in het kanaal en aan beide zijden van het kanaal dat de basislijn vertegenwoordigt ( Figuur 7A ).
    OPMERKING: De fluorescentieintensiteit van het blanco kanaal moet ongewijzigd zijn gebleven. Alle andere kanalen worden genormaliseerd naar het lege kanaal, dus het is van cruciaal belang om twee lege kanalen te hebben en ervoor te zorgen dat hun fluorescentieintensiteiten consistent blijven met elkaar.
  3. Gebruik de onderstaande formule om de data te normaliseren naar het blanco kanaal; Een voorbeeldberekening is verschaft in figuur 7B .
    figure-protocol-5
    OPMERKING: Hier vertegenwoordigt ΔF- eiwit de achtergrond-getrokken fluorescentie-intensiteit van het eiwitkanaal, Δ; F- blanco vertegenwoordigt de achtergrond-getrokken fluorescentie-intensiteit van het blanco kanaal, voor en na verwijzen naar voor en na eiwittitratietrappen, en a vertegenwoordigt de correctiefactor, welke de verhouding is van de fluorescentie-intensiteiten van het eiwitkanaal en het blanco kanaal ([ F eiwit / F blanco ] pre ) bij een preproteïntitratiestap. Aangezien de fluorescentie-intensiteit afneemt als een functie van de PH-domeinconcentratie, zullen genormaliseerde gegevens negatief in waarde zijn.
  4. Bepaal de genormaliseerde fluorescentie als een functie van de PH-domeinconcentratie en pas bij een Langmuir-isotherm ( Figuur 6C ) met behulp van een curve-fit software (zie Material Table ).
    figure-protocol-6
    OPMERKING: Hier vertegenwoordigt ΔF de verandering in fluorescentie-intensiteit ten opzichte van de maximale verandering in fluoRescensintensiteit wanneer een verzadigingsconcentratie van eiwitten aanwezig is ( ΔF max ), terwijl de K d, app de schijnbare dissociatieconstante vertegenwoordigt, die gelijk is aan de bulkproteïne concentratie ( [PLC-δ1 PH] ) waarbij 50% dekking ( Membraan gebonden complex) wordt bereikt. Dit is een evenwichtsgebonden bindende meting, zodat de genormaliseerde gegevens geschikt zijn voor een eenvoudige Langmuir isotherm om een ​​schijnbare experimentele parameter K d, app te extraheren. Op basis van de fitting software de Kd, app voor PLC-δ1 PH-PI (4,5) P2 interactie 0,39 ± 0,05 pM (Figuur 6B).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We gebruikten de pH modulatie test om de PLC-δ1 PH domein PI-studie (4,5) P2 interactie in een PIP-on-a-chip micro-inrichting (figuur 1). Door middel van een gedetailleerd protocol hebben we aangetoond hoe u microfluidische apparaatcomponenten kunt voorbereiden en monteren, kleine unilamellaire vesicles (SUV's) maken ( Figuur 2 ), SLB's vormen binnen een apparaat ( Figuur 3 ) en g...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Elke PIP variant, zij het bij lage concentraties, is aanwezig op het cytosolische oppervlak van specifieke organellen, waar zij bijdragen aan de totstandbrenging van een unieke fysieke samenstelling en functionele specificiteit van het organellair membraan 1 . Een van de belangrijkste toepassingen van PIP's is als een specifiek docking platform voor de veelheid van eiwitten die specifieke subcellulaire lokalisatie en / of activatie 6 , 7

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

DS en CEC werden gedeeltelijk ondersteund door subsidie ​​AI053531 (NIAID, NIH); SS en PSC werden ondersteund door subsidie ​​N00014-14-1-0792 (ONR).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dekglasje
Glas Dekglasjes: RechthoekenFisher Scientific12-544B22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicaatglas
7X ReinigingsoplossingMP Biomedicals976670Detergentia
PYREX KristallisatiebakjeCorning3140-190Borosilicaat glazen bakje met een platte bodem; Diameter x Hoogte (190 x 100 mm); Distributeur: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0Paragon IndustriesSC-2Oven
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PDMS
Sylgard 184 Silicone Elastomer KitDow Corning4019862Polydimethylsiloxaan (PDMS); Distributeur: Ellsworth Adhesives
PYREX DroogkastVWR89134-402Vacuum geschikt
Biopsie punchHarris15110-10Harris Uni-Core; 1,0 mm diameter; Miltex Biopsie Punch met Plunger (Cat. Nr. 15110-10) kan als alternatief worden gebruikt
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Apparaat
Plasma ReinigingssysteemPlasmaEtchPE25-JW2-traps Direct Drive Olie Vacuümpomp, O2 service (Krytox Charged)
Digitaal HotplateBenchmarkH3760-HGekocht via Denville Scientific (Cat. Nr. 1005640)
Mat Micro SlideVWR48312-003Mat, Geselecteerd en Voorgereinigd; Gemaakt van Zwitsers Glas; Dikte: 1 mm; Afmetingen: 75 x 25 mm; GR 144
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Vorm
AutoCADAutodeskv.2016Ontwerpsoftware voor het ontwerp van fotomaskers
FotomaskerCAD/Art ServicesN/AOntwerp met zwarte achtergrond en heldere kenmerken werd gedrukt op een transparante masker (5 x 7 inch) door CAD/Art Services met een resolutie van 20k dpi
Silicone WafersUniversity Wafer1575Prime Grade, Enkelzijdig Gepolijst; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Dikte
SU-8 50MicroChem Corp.N/ANegatieve Toon Fotoresist; Eigendom van Penn State Nanofabrication Facility
SU-8 OntwikkelaarMicroChem Corp.N/AEigendom van Penn State Nanofabrication Facility
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
SUV
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholineAvanti Polar Lipids850457CPOPC
L-α-fosfatidylinositol-4-fosfaatAvanti Polar Lipids840045XPI4P
L-α-fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaatAvanti Polar Lipids840046XPI(4,5)P2
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamineAvanti Polar Lipids850757CPOPE; Vereist voor de synthese van oSRB-POPE
Lissamine Rhodamine B Sulfonylchloride (gemengde isomeren)ThermoFisher ScientificL-20Vereist voor de synthese van oSRB-POPE
pH Gevoelige Fluorescerende Lipiden Sonde (oSRB-POPE)In-houseN/AIn-house Synthese (Huang D. et al. 2013)
Glas ScintillatieglasVWR66022-06520 mL volumecapaciteit
Aquasonic 250DVWRN/AUltrasoon Waterbad
Nuclepore Track-Etched MembranesWhatman110605Polycarbonaat Membraan; Diameter: 25 mm; Porie Grootte: 0.1 um; Distributeur: Sigma-Aldrich
ChloroformVWRCX1054-6HPLC kwaliteit
LIPEX ExtruderTransferra NanosciencesT.001LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder
Viscotek 802 DLSMalvern InstrumentsN/ADynamische Lichtverstrooiing; Eigendom van Penn State X-Ray Crystallography Facility
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Gegevensanalyse
GraphPad PrismGraphPad Softwarev.6Curve-fitting software voor gegevensanalyse
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Microscoop
Axiovert 200M Epifluorescent MicroscoopCarl Zeiss MicroscopyN/AMicroscoop
AxioCam MRm CameraCarl Zeiss MicroscopyN/ACamera
X-Cite 120Excelitas TechnologiesN/ALichtbron
Alexa 568 Filter SetCarl Zeiss MicroscopyN/AEx/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 SoftwareCarl Zeiss MicroscopyN/ABeeldverwerkingssoftware
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anders
TipsVWR10034-132200 uL pipette tips; Dunne en gladde tip voor he

Referenties

  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K. Phosphoinositides in cell architecture. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (8), a004796(2011).
  3. Picas, L., Gaits-Iacovoni, F., Goud, B. The emerging role of phosphoinositide clustering in intracellular trafficking and signal transduction. F1000Res. 5, (2016).
  4. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Lett. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  5. Balla, T. Phosphoinositides: Tiny lipids with giant impact on cell regulation. Physiol Rev. 93, 1019-1137 (2013).
  6. Lemmon, M. A. Membrane recognition by phospholipid-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 99-111 (2008).
  7. Kutateladze, T. G. Translation of the phosphoinositide code by PI effectors. Nat Chem Biol. 6 (7), 507-513 (2010).
  8. Harlan, J. E., Hajduk, P. J., Yoon, H. S., Fesik, S. W. Pleckstrin homology domains bind to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Nature. 371 (6493), 168-170 (1994).
  9. Garcia, P., et al. The pleckstrin homology domain of phospholipase C-delta 1 binds with high affinity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in bilayer membranes. Biochemistry. 34 (49), 16228-16234 (1995).
  10. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (23), 10472-10476 (1995).
  11. Flesch, F. M., Yu, J. W., Lemmon, M. A., Burger, K. N. Membrane activity of the phospholipase C-delta1 pleckstrin homology (PH) domain. Biochem J. 389, 435-441 (2005).
  12. Narayan, K., Lemmon, M. A. Determining selectivity of phosphoinositide-binding domains. Methods. 39 (2), 122-133 (2006).
  13. Scott, J. L., Musselman, C. A., Adu-Gyamfi, E., Kutateladze, T. G., Stahelin, R. V. Emerging methodologies to investigate lipid-protein interactions. Integr Biol (Camb). 4 (3), 247-258 (2012).
  14. Dowler, S., Currie, R. A., Downes, C. P., Alessi, D. R. DAPP1: A dual adaptor for phosphotyrosine and 3-phosphoinositides. Biochem J. 342, 7-12 (1999).
  15. He, J., et al. Molecular basis of phosphatidylinositol 4-phosphate and ARF1 GTPase recognition by the FAPP1 pleckstrin homology (PH) domain. J Biol Chem. 286 (21), 18650-18657 (2011).
  16. Ceccarelli, D. F., et al. Non-canonical interaction of phosphoinositides with pleckstrin homology domains of Tiam1 and ArhGAP9. J Biol Chem. 282 (18), 13864-13874 (2007).
  17. Huang, S., Gao, L., Blanchoin, L., Staiger, C. J. Heterodimeric capping protein from Arabidopsis is regulated by phosphatidic acid. Mol Biol Cell. 17 (4), 1946-1958 (2006).
  18. Yu, J. W., et al. Genome-eide analysis of membrane targeting by S. cerevisiae pleckstrin homology domains. Mol Cell. 13 (5), 677-688 (2004).
  19. Jung, H., Robison, A. D., Cremer, P. S. Detecting protein-ligand binding on supported bilayers by local pH modulation. J Am Chem Soc. 131 (3), 1006-1014 (2009).
  20. Huang, D., Zhao, T., Xu, W., Yang, T., Cremer, P. S. Sensing small molecule interactions with lipid membranes by local pH modulation. Anal Chem. 85 (21), 10240-10248 (2013).
  21. Saxena, A., et al. Phosphoinositide binding by the pleckstrin homology domains of Ipl and Tih1. J Biol Chem. 277 (51), 49935-49944 (2002).
  22. Knödler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. Biotechniques. 38 (6), 858-862 (2005).
  23. Baumann, M. K., Swann, M. J., Textor, M., Reimhult, E. Pleckstrin homology-phospholipase C-delta1 interaction with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate containing supported lipid bilayers monitored in situ with dual polarization interferometry. Anal Chem. 83 (16), 6267-6274 (2011).
  24. Saliba, A. E., et al. A quantitative liposome microarray to systematically characterize protein-lipid interactions. Nat Methods. 11 (1), 47-50 (2014).
  25. Arauz, E., Aggarwal, V., Jain, A., Ha, T., Chen, J. Single-molecule analysis of lipid-protein interactions in crude cell lysates. Anal Chem. 88 (8), 4269-4276 (2016).
  26. Best, Q. A., Xu, R., McCarroll, M. E., Wang, L., Dyer, D. J. Design and investigation of a series of rhodamine-based fluorescent probes for optical measurements of pH. Org Lett. 12 (14), 3219-3221 (2010).
  27. Lee, J., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6 (1), 1-18 (2014).
  28. Poyton, M. F., Sendecki, A. M., Cong, X., Cremer, P. S. Cu(2+) binds to phosphatidylethanolamine and increases oxidation in lipid membranes. J Am Chem Soc. 138 (5), 1584-1590 (2016).
  29. Karasek, P., Grym, J., Roth, M., Planeta, J., Foret, F. Etching of glass microchips with supercritical water. Lab Chip. 15 (1), 311-318 (2015).
  30. Thomas, M. S., et al. Print-and-peel fabrication for microfluidics: what's in it for biomedical applications? Ann Biomed Eng. 38 (1), 21-32 (2010).
  31. Waheed, S., et al. 3D printed microfluidic devices: enablers and barriers. Lab Chip. 16 (11), 1993-2013 (2016).
  32. Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers. J Vis Exp. (105), e53158(2015).
  33. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16 (12), 2806-2810 (1977).
  34. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61 (10), 429-444 (2006).
  35. Hamai, C., Yang, T., Kataoka, S., Cremer, P. S., Musser, S. M. Effect of average phospholipid curvature on supported bilayer formation on glass by vesicle fusion. Biophys J. 90 (4), 1241-1248 (2006).
  36. Tero, R. Substrate effects on the formation process, structure and physicochemical properties of supported lipid bilayers. Materials. 5 (12), 2658-2680 (2012).
  37. Ferguson, K. M., Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Sigler, P. B. Structure of the high affinity complex of inositol trisphosphate with a phospholipase C pleckstrin homology domain. Cell. 83 (6), 1037-1046 (1995).
  38. Simonsson, L., Hook, F. Formation and diffusivity characterization of supported lipid bilayers with complex lipid compositions. Langmuir. 28 (28), 10528-10533 (2012).
  39. Cong, X., Poyton, M. F., Baxter, A. J., Pullanchery, S., Cremer, P. S. Unquenchable surface potential dramatically enhances Cu(2+) binding to phosphatidylserine lipids. J Am Chem Soc. 137 (24), 7785-7792 (2015).
  40. Robison, A. D., et al. Polyarginine interacts more strongly and cooperatively than polylysine with phospholipid bilayers. J Phys Chem B. 120 (35), 9287-9296 (2016).
  41. Robison, A. D., Huang, D., Jung, H., Cremer, P. S. Fluorescence modulation sensing of positively and negatively charged proteins on lipid bilayers. Biointerphases. 8 (1), 1(2013).
  42. Tabaei, S. R., et al. Formation of cholesterol-rich supported membranes using solvent-assisted lipid self-assembly. Langmuir. 30 (44), 13345-13352 (2014).
  43. Johnson, S. J., et al. Structure of an adsorbed dimyristoylphosphatidylcholine bilayer measured with specular reflection of neutrons. Biophys J. 59 (2), 289-294 (1991).
  44. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12 (5), 1343-1350 (1996).
  45. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  46. Renner, L., et al. Supported lipid bilayers on spacious and pH-responsive polymer cushions with varied hydrophilicity. J Phys Chem B. 112 (20), 6373-6378 (2008).
  47. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: Silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys J. 79 (3), 1400-1414 (2000).
  48. Pace, H., et al. Preserved transmembrane protein mobility in polymer-supported lipid bilayers derived from cell membranes. Anal Chem. 87 (18), 9194-9203 (2015).
  49. Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: Influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29 (46), 14204-14213 (2013).
  50. Paridon, P. A., de Kruijff, B., Ouwerkerk, R., Wirtz, K. W. Polyphosphoinositides undergo charge neutralization in the physiological pH range: A 31P-NMR study. Biochim Biophys Acta. 877 (1), 216-219 (1986).
  51. Liu, C., Huang, D., Yang, T., Cremer, P. S. Monitoring phosphatidic acid formation in intact phosphatidylcholine bilayers upon phospholipase D catalysis. Anal Chem. 86 (3), 1753-1759 (2014).
  52. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).
  53. Hsu, N. Y., et al. Viral reorganization of the secretory pathway generates distinct organelles for RNA replication. Cell. 141 (5), 799-811 (2010).
  54. Del Campo, C. M., et al. Structural basis for PI(4)P-specific membrane recruitment of the Legionella pneumophila effector DrrA/SidM. Structure. 22 (3), 397-408 (2014).
  55. Kolli, S., et al. Structure-function analysis of vaccinia virus H7 protein reveals a novel phosphoinositide binding fold essential for poxvirus replication. J Virol. 89 (4), 2209-2219 (2015).
  56. Cho, N. J., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is an HCV NS5A ligand and mediates replication of the viral genome. Gastroenterology. 148 (3), 616-625 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

PIP on a chip assayondersteunde lipide dubbellagenpH modulatie assayfosfolipase C PH domeinfosfatidylinositol 45 bisfosfaatfabricage van microflu dische apparatenkleine unilamellaire vesiclesmeting van fluorescentie intensiteitschijnbare dissociatieconstante

Gerelateerde artikelen