Methodenartikel

Analyse van de Gap Junction-afhankelijke Transfer van miRNA met 3D-FRAP Microscopy

DOI:

10.3791/55870

⸱

19 juni 2017

 ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), 2Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 3Department of Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, University of Rostock

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we de toepassing van driedimensionale fluorescentie herstel na photobleaching (3D-FRAP) voor de analyse van de gap-junction-afhankelijke shuttling van miRNA. In tegenstelling tot veelgebruikte methoden, maakt 3D-FRAP het mogelijk om de intercellulaire overdracht van kleine RNA's in realtime te kwantificeren, met een hoge spatio-temporale resolutie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kleine antisense RNA's, zoals miRNA en siRNA, spelen een belangrijke rol in cellulaire fysiologie en pathologie en kunnen bovendien gebruikt worden als therapeutische middelen bij de behandeling van verschillende aandoeningen. De ontwikkeling van nieuwe, innovatieve strategieën voor miRNA / siRNA therapie is gebaseerd op een uitgebreide kennis van de onderliggende mechanismen. Recente gegevens suggereren dat kleine RNA's tussen cellen worden uitgewisseld op een kloppende koppelingsafhankelijke wijze, waardoor genregulerende effecten in de ontvangercel worden geïnduceerd. Moleculaire biologische technieken en flow cytometrische analyse worden vaak gebruikt om de intercellulaire uitwisseling van miRNA te bestuderen. Deze methoden bieden echter geen hoge temporale resolutie, die nodig is bij het bestuderen van de kloofverbindingsflux van moleculen. Daarom, om de impact van miRNA / siRNA als intercellulaire signaalmoleculen te onderzoeken, zijn er nieuwe tools nodig die de analyse van deze kleine RNA's op het cellulaire niveau mogelijk maken. Het onderhavige protocol beschrijft de apPlicatie van driedimensionale fluorescentieherstel na photobleaching (3D-FRAP) microscopie om de kloofverbinding-afhankelijke uitwisseling van miRNA moleculen tussen hartcellen te verduidelijken. Belangrijk is dat deze eenvoudige en niet-invasieve live-cel beeldvorming benadering het visualiseren en kwantificeren van de gap junctionele shuttling van fluorescent gelabelde kleine RNA's in real time, met een hoge spatio-temporale resolutie. De gegevens verkregen door 3D-FRAP bevestigen een nieuwe route van intercellulaire genregulatie, waarbij kleine RNA's fungeren als signaalmoleculen in het intercellulaire netwerk.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kleine niet-codering-RNA's zijn belangrijke spelers in cellulaire genregulatie. Deze moleculen zijn samengesteld uit 20-25 nucleotiden die binden aan een specifiek doelmRNA, wat leidt tot de blokkering van de translatie of tot mRNA-afbraak 1 , 2 . Het genregulerende proces dat wordt uitgevoerd door kleine RNA's, zoals miRNA en siRNA, is een zeer geconserveerd mechanisme dat in veel verschillende soorten 3 is gevonden. In het bijzonder zijn miRNA moleculen van cruciaal belang voor een verscheidenheid aan fysiologische processen, waaronder proliferatie, differentiatie en regeneratie 4 , 5 . Daarnaast wordt de dysregulatie van miRNA expressie toegeschreven aan veel pathologische aandoeningen. Overeenkomstig is aangetoond dat miRNAs geschikt zijn als biomarkers voor diagnose en als therapeutische middelen voor gentherapie 6 , 7 .

Gap junctions (GJs) zijn gespecialiseerde eiwitstructuren in het plasmamembraan van twee aangrenzende cellen die de diffusieuitwisseling van moleculen met een molecuulgewicht van tot 1 kD mogelijk maken. Ze zijn aangetoond dat ze belangrijk zijn voor weefselontwikkeling, differentiatie, celdood en pathologische stoornissen zoals kanker of hart- en vaatziekten 8 , 9 , 10 . Verscheidene moleculen zijn beschreven om GJ kanalen te kunnen overschrijden, met inbegrip van ionen, metabolieten en nucleotiden. Interessant, werden ook GJs gevonden om een ​​weg te geven voor de intercellulaire beweging van kleine RNA's 11 , 12 . Zo kunnen miRNAs niet alleen handelen in de cel waarin ze worden geproduceerd, maar ook binnen de ontvanger cellen. Dit wijst op de rol van miRNAs in het intercellulaire signaaltransductiesysteem. Tegelijkertijd tonen de gegevens aanDie kloof intercellulaire communicatie is nauw verbonden met de miRNA functie. Door de significante invloed van miRNA en GJ's op homeostase, pathologie en diagnose van het weefsel, zal een uitgebreid begrip van de functie van GJ's en de daarmee verband houdende intercellulaire dynamiek van miRNA de mechanismen van miRNA-gebaseerde aandoeningen verduidelijken en nieuwe strategieën ontwikkelen voor MiRNA therapieën.

Afhankelijk van de mate van gap junctionele koppeling kan de overdracht van miRNA moleculen tussen cellen een zeer snel proces zijn. Daarom is een methodologie die het visualiseren en kwantificeren van de snelle intercellulaire beweging van deze regulerende signaalmoleculen mogelijk maakt. In het algemeen zijn stromingscytometrie en moleculaire biologische technieken toegepast om de shuttling van kleine RNA's 11 , 12 , 13 , 14 aan te tonen . Echter, in tegenstelling tot FRAP microsKopiëren, deze benaderingen ontbreken hoge temporale resolutie, die verplicht is bij het analyseren van de uitwisseling van miRNA via GJs. Bovendien is FRAP microscopie minder invasieve en vertegenwoordigt daarom een ​​krachtige en nieuwe live-cell imaging techniek om de GJ-afhankelijke uitwisseling van moleculen in verschillende celtypen 15 , 16 , 17 te evalueren.

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol waarin de toepassing van 3D-FRAP wordt beschreven om miRNA shuttling tussen cardiomyocyten te beoordelen. Hiervoor werden cardiomyocyten getransfecteerd met fluorescent gelabelde miRNA. Een cel gemarkeerd met dit miRNA werd gefabriceerd, en de gap-junctionele miRNA re-instroom van aangrenzende cellen werd op tijdsafhankelijke wijze geregistreerd. De hoge temporale resolutie van FRAP-experimenten biedt de mogelijkheid kinetische studies uit te voeren voor de nauwkeurige evaluatie van de intercellulaire overdracht van miRNA en siRNA tussen levende cellen. MoreoVer, omdat kleine RNA's kunnen worden uitgewisseld via verschillende mechanismen met zeer verschillende kinetica, kan FRAP-microscopie bijdragen tot het verduidelijken van de mate waarin GJ's betrokken zijn bij de respectieve shuttling-processen 18 . Daarnaast kan 3D-FRAP worden gebruikt om fysiologische en pathologische veranderingen in GJ permeabiliteit te onderzoeken en de invloed ervan op kleine RNA transfer 15 , 19 .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle stappen in dit protocol waarbij neonatale muizen werden betrokken, werden uitgevoerd volgens de ethische richtlijnen voor dierenzorg van het Rostock University Medical Center.

1. Bereiding van celcultuurschotels en het medium voor cardiomyocytcultuur

  1. Bedek een celkweekplaat met 0,1% gelatine in PBS en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C of bij 4 ° C. Verwijder de gelatine en laat het drogen onder de steriele laminaire luchtstroom.
  2. Bereid celcultuurmedium op dat uit 50 ml DMEM wordt aangevuld met 10% foetaal boviene serum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine (P / S). Voorverwarmen tot 37 ° C.

2. Isolatie van neonatale cardiomyocyten

  1. Ontbied neonatale muizen (1-2 dagen oud) door decapitatie met steriele schaar en open de borst langs het sternum. Verwijder het hart met behulp van tang, terwijl u de thorax een beetje duwt en het hart overbrengt in een 24-putjesplaat die ijskoud HBSS bevat(Zonder Ca 2+ en Mg 2+ ).
  2. Verwijder niet-cardiale weefsel en grotere vaten met behulp van steriele tang. Breng schoongemaakte harten over in een 1,5 ml buis die ijskoud HBSS bevat. Gebruik maximaal 5 hartjes per buis voor enzymatische spijsvertering.
  3. Knip de harten met kleine scharen in <0,5 tot 1 mm³ stukken.
  4. Was de gehakte harten met HBSS tweemaal door aspiratie / toevoeging van HBSS met een 1 ml microliterpipet. Verwijder de HBSS volledig voordat u de enzymen toevoegt.
  5. Voor de enzymatische vertering van neonatale harten, gebruik een in de handel verkrijgbare kit en volg het protocol van de fabrikant (zie de tabel van materialen ). Schud de buis die de gehakte hartjes elke 5 minuten bevat, terwijl gedurende 35 minuten met enzymen bij 37 ° C worden geïncubeerd.
  6. Zaadophangende cellen op niet-gecoate celkweekschalen die celkweekmedium bevatten gedurende 1,5-2 uur om de adhesie van de niet-cardiomyocytfractie toe te staan. Herhaal deze stap als een hoge zuiverheidVan cardiomyocyten is nodig. Desgewenst kweek de non-cardiomyocytfractie verder.
    OPMERKING: Voor een celsuspensie van 15 harten kan de preplateringstap worden uitgevoerd op 75 cm² celkweekflessen. Meestal worden ~ 5 x 10 5 cellen verkregen uit een neonataal hart.
  7. Verzamel de supernatant in een 15 ml conische buis en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g. Resuspendeer de cellen in 1 ml celcultuurmedium.
  8. Tel de cellen met een Neocauer chamber hemocytometer, of gebruik een equivalente methode.
  9. Plaat geïsoleerde cardiomyocyten op 6-putjes platen met een dichtheid van 3 x 10 5 cellen / cm². Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 ° C en 5% CO2.
    OPMERKING: Optioneel kunnen cellen op dit moment ook worden getransfecteerd. Echter, verhoogde levensvatbaarheid werd waargenomen toen de cellen één dag werden gekweekt voordat ze onderworpen werden aan elektroporatie.

3. Transfectie met Fluorescently Labeled miRNA

  1. Pre-Warm celcultuurmedium (zie stap 1.2) tot 37 ° C in een waterbad of een equivalente inrichting.
  2. Bereid een 20 μM voorraadoplossing van fluorescerende miRNA in RNase-vrij steriel water op.
  3. Bereid elektroporatiebuffer die 90 mM Na 2 HPO 4 , 90 mM NaH 2 PO 4 , 5 mM KCl, 10 mM MgCl2 en 10 mM natriumsuccinaat bevat en stel de pH op op 7,2; Elektroporatiebuffer kan gedurende meerdere maanden bij -20 ° C worden opgeslagen.
  4. Verwijder de cellen uit de kweekschotel met behulp van 0,05% trypsine gedurende 5 minuten. Inactiveer het trypsine door het toevoegen van celcultuurmedium.
  5. Tel de cellen met een Neocauer chamber hemocytometer, of gebruik een equivalente methode. Centrifugeer de cellen bij 300 xg gedurende 10 minuten.
  6. Resuspendeer de cellen in elektroporatiebuffer om een ​​concentratie van 4 x 10 5 cellen per 100 μl te verkrijgen.
  7. Meng 100 μL cel suspensie met fluorescerende miRNA (uiteindelijke concentratie: 0,25 μM) in een buis enLaad het mengsel in een elektroporatiecuvette.
    1. Bepaal empirisch de juiste hoeveelheid miRNA, afhankelijk van het celtype.
  8. Voer elektroporatie uit met behulp van een elektroporatieapparaat (zie de Tabel van Materialen ), met behulp van het programma "G-009".
  9. Voeg 500 μl voorverwarmd celkweekmedium toe en draag de volledige cel suspensie (4 x 10 5 cellen) in een putje van een 4-putjes glazen bodem kamerglijbaan. Cultuur de cellen gedurende 1 dag bij 37 ° C in een 5% CO 2 atmosfeer.
    OPMERKING: voor de FRAP-analyse is een celdichtheid van ~ 80% optimaal. De transfectie van gelabelde miRNA moet uitsluitend worden uitgevoerd met behulp van elektroporatie. Aangezien de homogene verdeling van gemerkte miRNA-moleculen gunstig is voor FRAP-meting, is reagentgebaseerde transfectie niet aanbevolen.

4. Toepassing 3D-FRAP Microscopie (Dag 3)

  1. Warm de microscoop-incubator op tot 37 °; C en schakel het confocale microscoop systeem minstens 2 uur in voor FRAP meting om een ​​thermisch evenwicht vast te stellen en om de mogelijkheid van drift te verminderen. Indien mogelijk, houd een 5% CO 2 atmosfeer in stand.
  2. Steek de kamerschuif in de podiummonsterhouder.
  3. Zoek een cluster getransfecteerde cardiomyocyten met behulp van een 1,4 NA-olie doel (400X vergroting) en 561 nm laser excitatie licht bij lage laser vermogen, met een detectiebereik van 570-680 nm.
    OPMERKING: De definitie van FRAP-instellingen, de opname van het beeld en de analyse werden uitgevoerd met behulp van microscoopspecifieke software (zie de Tabel van Materialen ).
  4. Activeer de "z-stack", "Time Series", "Bleaching" en "Regions" knoppen in de "Setup Manager."
  5. Definieer de FRAP parameters.
    1. Definieer de instellingen voor het maken van beelden in het menu 'Acquisitie modus' door de 'kaderformaat' in te stellen4; Tot 512 x 512, de "lijnstap" naar 1 en de "scantijd" naar <1 s.
    2. In het menu 'Kanalen', instel de laservermogen, verstel en installeer de maximale fluorescentie van minimale laser excitatie ( bijv. Laservermogen: 1-5%); Pas op om de intensiteit van de verzadiging te vermijden. Stel de "pinhole size" in op 2 μm.
    3. Vervolgens selecteert u in het menu 'Regio' het 'ROI-tekenprogramma' en gebruik de cursor om de doelcel, de referentiecel en het achtergrondgebied te markeren. Selecteer indien nodig meerdere doelcellen voor fotobladen.
    4. Pas de fotoboekinstellingen aan in het "Bleaching" menu ( bijv. Iteraties: 9-14, laservermogen voor fotoboeken: 100%, interval van beeldverwerving: 60 s, cycli: 15). Definieer het begin van het bleken na 3 eerste scans.
    5. In het menu "z-stack" definieer je de limieten voor z-stack-acquisitie, afhankelijk van de dikte van de cellen. Pas het "nummer o aanF z-lagen "tot 12-15.
    6. Begin het FRAP-experiment en teken het fluorescentieherstel op.
      OPMERKING: Aangezien de instellingen van een FRAP-experiment afhankelijk zijn van het celtype, de fluorescerende kleurstof en het microscoopsysteem, is het het beste om proefproeven uit te voeren om de optimale parameters voor FRAP te bepalen. Bleken moet voldoende zijn om de initiële fluorescentie-intensiteit met ten minste 50% te verminderen. Typisch moet de fluorescentieherstelling elke 30-60 s worden geregistreerd tot de plateaufase is bereikt.

5. Data-analyse

  1. Creëer maximale projecties van de verworven z-stapels en geef fluorescentie-intensiteitswaarden van de gebleekte doelcellen, de referentiecel en de achtergrond. Met behulp van microscoopspecifieke software klikt u op 'Verwerking' → 'Maximale intensiteitsprojectie' → selecteer bestand → 'Toepassen'.
    1. Als alternatief gebruik je een equivalent beeldanalyse tool ( bijvoorbeeld ImageJ).
  2. Kopieer de fluorescentie-intensiteitsgegevens op alle tijdstippen van de doelcel, de achtergrond en de referentiecel in een spreadsheet.
    1. Trek de achtergrondintensiteit en de intensiteit van de referentiecel af van de intensiteitswaarden van de doelcel om te corrigeren voor fotobakken die tijdens het acquisitieproces worden veroorzaakt. Voer achtergrond- en referentiecorrecties uit voor elk tijdstip.
    2. Normaliseer de gecorrigeerde FRAP-gegevens op de initiële fluorescentie-intensiteit voor het bleken door elke waarde te verdelen door de eerste fluorescentie.
    3. Om de FRAP-curven te verkrijgen, stel de basislijn op de fluorescentie-intensiteit direct na het bleken door de intensiteitswaarden van elk tijdstip af te trekken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we 3D-FRAP microscopie als een niet-invasieve techniek om de gap junctionele shuttling van fluorescerende miRNA te bestuderen binnen neonatale cardiomyocyten. De geïsoleerde cardiomyocyten onthulden het typische gestreepte α-actininepatroon en bevatten grote plaques van Cx43 langs de celcelgrenzen ( Figuur 1A , witte pijlpunten), die de hoge intercellulaire flux van moleculen toonden. De zuiverheid van geïsoleerde cardiomyocyten werd beoorde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MiRNAs zijn belangrijke spelers in cellulaire fysiologie en werden aangetoond als signaalmoleculen door gebruik te maken van oa-GJs als een weg voor intercellulaire uitwisseling 11 , 12 , 22 . Het huidige protocol presenteert een in vitro levende cel imaging techniek om deze GJ-afhankelijke shuttling te karakteriseren met behulp van fluorescerende miRNAs in celclusters.

Het protocol w...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het ministerie van Onderwijs en Onderzoek Duitsland (FKZ 0312138A en FKZ 316159), de staat Mecklenburg-Voor-Pommeren met EU-structuurfondsen (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 en ESF / IVBM-B35-0010 / 12), de DFG (DA1296-1) en de German Heart Foundation (F / 01/12). Daarnaast wordt RD ondersteund door het FORUN-programma van Rostock University Medical Center (889001), de DAMP Foundation en de BMBF (VIP + 00240).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
neonatal NMRI miceCharles River
GelatinSigma AldrichG70410,1% oplossing in PBS, gesteriliseerd
PBSPan BiotechP04-53500
Dulbecco´s gemodificeerd mediumPan BiotechP04-03550
Penicilline/StreptomycineThermo Fisher Scientific15140122100 U/mL, 100µg/mL
Fetaal bovien serumPan BiotechP30-3306
Celcultuur plasticTPP
Primary Cardiomyocyte Isolation KitThermo Fisher Scientific88281
HBSSThermo Fisher Scientific88281inbegrepen in primaire cardiomyocyte isolatiekit
Trypan blauwThermo Fisher Scientific15250061
miRIDIAN Dy547 gelabelde microRNA MimicDharmaconCP-004500-01-05oplossen in RNAse vrije water, stock oplossing 20µM
Natriumfosfaat monobasischSigmaS3139
Natriumfosfaat dibasischCarl RothT877.2
KaliumchlorideSigmaP9333
MagnesiumchlorideServa28305.01
NatriumsuccinaatCarl Roth3195.1
0,05% Trypsin/EDTA oplossingMerckL2153
4-well- Glass bodem kamer slidesIBIDI80827coaten met 0,1% gelatine oplossing
Amaxa Nucleofector IILonzaprogramma G-009 werd gebruikt voor Elektroporatie 
LSM 780 ELYRA PS.1 systeemZeiss
Excel softwareMicrosoft
α-actinine antilichaamAbcamab9465verdunning 1:200
Connexin43 antilichaamSanta Cruzsc-9059verdunning 1:200
geit anti-muis Alexa 594 antilichaamThermo Fisher ScientificA-11005verdunning 1:300
geit anti-konijn Alexa 488 antilichaamThermo Fisher ScientificA-11034verdunning 1:300
Connexin43 siRNAThermo Fisher ScientificAM16708 ID158724finale concentratie 250 nM
Near-IR Live/Dead Celkleuring KitThermo Fisher ScientificL10119
CellTrace Calcein Red-OrangeThermo ScientificC34851
DAPI nucleaire kleuringThermo ScientificD1306

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
  2. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  3. Grimm, D. Small silencing RNAs: state-of-the-art. Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).
  4. Raghunathan, S., Patel, B. M. Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases. Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).
  5. Sluijter, J. P. G. MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation. ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).
  6. Li, M., Zhang, J. Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases. Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
  7. Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians. Heart. 101 (12), 921-928 (2015).
  8. Maes, M., Crespo Yanguas,, Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).
  9. Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. Role of connexin 43 in cardiovascular diseases. Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).
  10. Naus, C. C., Laird, D. W. Implications and challenges of connexin connections to cancer. Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).
  11. Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA. Oncotarget. 6 (17), Available from: http://www.impactjournals.com/oncotarget 15566-15577 (2015).
  12. Lee, H. K. H., et al. Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal. Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).
  13. Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. Functional microRNA is transferred between glioma cells. Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).
  14. Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -B. Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication. Sci Rep. 6, 19884(2016).
  15. Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30. Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).
  16. Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching. J Biomed Opt. 19 (1), 15001(2013).
  17. Lemcke, H., Nittel, M. -L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression. Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).
  18. Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Gap junctional shuttling of miRNA - A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application. Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).
  19. Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells. Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).
  20. Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).
  21. Laupheimer, M., et al. Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 α and ATP Gradient. Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).
  22. Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells. J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).
  23. Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization. Math Biosci. 280, 50-61 (2016).
  24. Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).
  25. Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins. J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).
  26. Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).
  27. Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis. Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).
  28. Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 8 (1), 166(2007).
  29. Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun. 2, 282(2011).
  30. Squadrito, M. L., et al. Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells. Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).
  31. Zhang, B., Farwell, M. A. microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy. J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).
  32. Chen, Y., Gao, D. -Y., Huang, L. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies. Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Overdracht via gap junctionsmiRNA uitwisseling3D FRAP microscopiefluorescentieherstelcardiomyocytenkweekelectroporatieprocedureConnexine43 expressielive cell imagingfluorescentie RNA trackingfotobleekinganalyse

Gerelateerde artikelen