Methodenartikel

Protocol voor HER2 vissen combineren van de voordelen van Cryo-behoud en formaline fixatie met een niet-kruis-mailkoppeling, formaline-gratis weefsel fixatief

DOI:

10.3791/55885

⸱

25 december 2017

 ,  ,  ,  , 
1Christian Doppler Laboratory for Biospecimen Research and Biobanking Technologies, Institute of Pathology, Medical University Graz, 2Institute of Pathology, Medical University Graz, 3Research and Development, Qiagen GmbH

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is vaak vereist in combinatie met histopathologie en moleculaire diagnostiek voor selectie van therapie in gepersonaliseerde geneeskunde. Een nieuwe niet-kruis-mailkoppeling, formaline-gratis weefsel-fixeerspray waarmee hoge kwaliteit morfologische, moleculaire en vis analyses van het zelfde model door toevoeging van een na fixatie stap voordat vis wordt aangeboden.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Morfologische beoordeling van formaline-vaste, paraffine-ingebedde weefselsteekproeven van (FFPE) is de gouden standaard voor kanker diagnostiek voor decennia als gevolg van haar uitstekende behoud van morfologie. Gepersonaliseerde geneeskunde biedt steeds meer individueel aangepast en gerichte therapieën voor gekarakteriseerd afzonderlijke ziekten ingeschakeld door gecombineerde morfologische en moleculair analytische technieken en diagnostiek. Prestaties van morfologische en moleculaire tests uit de dezelfde FFPE monster is uitdagend vanwege de negatieve impact van formaline door chemische wijziging en cross-linking van nucleïnezuren en proteïnen. Een niet-kruis-mailkoppeling, formaline-gratis weefsel fixatief heeft onlangs ontwikkeld om te voldoen aan beide eisen, dat wil zeggen, voor het behoud van de morfologie zoals FFPE en biomoleculen zoals cryo-behoud. Aangezien vis vaak in combinatie met histopathologie en moleculaire diagnostiek vereist is, testten we de toepasselijkheid van vis protocollen betreffende weefsels behandeld met deze nieuwe fixeerspray. We vonden dat na fixatie van formaline van histologische secties van niet-kruis-linking, formaline-vrije en paraffine-ingebedde (NCFPE) borst kanker weefsel gegenereerd gelijkwaardige resultaten voor mensen met FFPE weefsel in menselijke epidermale groeifactor receptor 2 (HER2) FISH-analyse. Dit protocol beschrijft hoe een vis assay oorspronkelijk ontwikkeld en gevalideerd voor FFPE weefsel kan worden gebruikt voor NCFPE weefsels door een eenvoudige stap na fixatie van histologische secties.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gepersonaliseerde geneeskunde afhankelijk steeds meer van Multi-parameter proeven waarbij morfologische en moleculair weefsel analyses. Formaline fixatie van weefsels als de gouden standaard biedt uitstekende morfologische kwaliteit1,2. Echter interfereert formaline-geïnduceerde chemische modificatie en cross-linking van proteïnen en nucleïnezuren3,4,5 negatief met moleculaire analyse6. Deze moleculaire wijzigingen beperken de kwaliteit van nucleïnezuren en proteïnen en kan resulteren in gen reeks artefacten7 of verminderde gevoeligheid van de polymerase-kettingreactie (PCR)-gebaseerd testen8. Hoewel grote inspanningen werden meegenomen naar het optimaliseren van moleculaire tests voor FFPE weefsel, is cryo-behoud van weefsels in algemene superieur aan formaline fixatie, waardoor het noodzakelijk wordt om te splitsen weefselmonsters voor behoud van de verschillende procedures. Om te voorkomen dat de behoefte aan cryo-behoud voor moleculaire analyses, een niet-kruis-mailkoppeling, formaline-vrije kleefpoeders, PAXgene weefsel werd ontwikkeld. Dit commercieel beschikbare systeem bestaat uit een fixatie en een stabilisatie oplossing met verschillende alcoholen, azijnzuur en een oplosbare organische verbinding. Goede behoud van nucleïnezuren, eiwitten (phospo) en morfologie werd getoond in verscheidene studies6,9,10,11,12,,13.

Een bepaalde toepassing in kanker diagnostiek is vis opsporen van een brede waaier van chromosomale wijzigingen, zoals translocaties, submicroscopische verwijderingen en amplifications 14. Bijvoorbeeld, twintig procent van de invasieve borst kanker tumoren Toon versterking van de menselijke epidermale groeifactor receptor 2 (HER2) gene15,16,17, die geassocieerd met een slechte prognose18 wordt ,19. Bepaling van de HER2 overexpressie en versterking status bij borstkanker door vis nodig is om te kiezen van patiënten voor anti-HER2-gerichte therapie en is een metgezel diagnostische vermeld door de Federal Drug Association (FDA) (http://www.fda.gov/ MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)17. In staat te stellen een brede toepassing van vis gebaseerde metgezel diagnostiek in de gezondheidszorg zijn testen ontwikkeld en goedgekeurd voor FFPE weefsels.

In een eerdere studie toonden we dat NCFPE weefsels kunnen niet worden gebruikt voor het testen van de vis die zijn goedgekeurd voor FFPE weefsel. Tests van tijd reeks andere post fixatie procedures van NCFPE weefsels met 4% gebufferd formaldehyde bleek dat fixatie tijden van 18 h of langer van NCFPE weefselsecties post bereikt echter gelijkwaardige resultaten voor mensen met FFPE weefsels14.

In deze studie, wij bieden een gedetailleerd protocol en aantonen dat de gevolgen van niet-kruis-mailkoppeling, formaline-gratis weefsel fixatie en 24 h 4% gebufferd formaldehyde na fixatie op secties gebruikt voor HER2 vis en RNA kwaliteit uit de dezelfde primaire weefsel monster.

figure-introduction-1
Figuur 1: Diagram toont de stappen voor fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en RNA analyse van formaline vaste paraffine ingesloten (FFPE) en niet-Kruis-koppeling, formaline-vrije vaste paraffine ingebedde weefsels (NCFPE). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de medische universiteit van Graz (referentie nummer 20-066), Oostenrijk. Weefselsteekproeven werden twee gevallen van chirurgisch gereseceerd primaire invasieve borstkankers verkregen nadat de patiënten schriftelijke geïnformeerde toestemming had gegeven.

1. de weefsels fixatie

Opmerking: Weefsel fixatie is uitgevoerd ofwel met standaard gebufferde formaline-oplossing (SBFS), gedefinieerd als 10% formaline-oplossing met een massafractie van 3,7% (overeenkomend met de breuk van een volume van 4%) formaldehyde gebufferd op een pH van 6.8 pH 7,2 volgens CEN/TS 16827-1:2015 of de niet-cross-mailkoppeling, formaline-gratis weefsel fixatie systeem (ook de alternatieve fixatie oplossing hieronder genoemd) bestaande uit een fixatief en een stabilisator oplossing bij kamertemperatuur (RT).

  1. Snijd de borst kanker weefselsteekproeven met een steriel scalpel in twee helften elk 4 mm dik om te zorgen voor voldoende weefsel hoeveelheid. Gebruik een maximumgrootte van 4 x 15 x 15 mm voor NCFPE of SBFS weefsel fixatie.
  2. Plaats elk halfjaar van het specimen van de tumor in een cassette standaard weefsel en het onderdompelen in SBFS of de alternatieve fixatie oplossing gedurende 24 uur met een volume per volumeverhouding (v/v) van 4 delen fixeer en enerzijds weefsel (4 mL/1 g weefsel (idealiter 10 mL/1 g)).
  3. Breng het alternatief-vaste monsters in de stabilisator oplossing voor 2-72 h door openen van de container, de cassette weefsel door 180° draaien en het dompelen.
  4. Plaats de cassettes van het weefsel met de monsters SBFS-fixed in 250 mL 70% ethanol voor 30 min op RT te verwijderen van de resterende SBFS.
    Opmerking: Deze stap is belangrijk om SBFS verontreiniging van niet-kruis-mailkoppeling fixeer-behandelde monsters in de geautomatiseerde weefsels-processor, die de heilzame eigenschappen van niet-kruis-mailkoppeling fixatives voor behoud van biomoleculen vernietigen zou te voorkomen.
    Let op: SBFS is een gevaarlijke oplossing veroorzaakt irritatie van de huid, ernstige oogbeschadigingen, de reactie van een allergische huid kan veroorzaken, wordt verdacht van het veroorzaken van genetische afwijkingen, kanker, irritatie van de luchtwegen, slaperigheid en veroorzaakt schade aan organen kan veroorzaken. De alternatieve fixeerspray is vergiftig bij inademing, aanraking met de huid en opname door de mond, irriterend voor de ogen en de huid, gevaar voor ernstige onherstelbare effecten bij inademing, aanraking met de huid en opname door de mond. Inhalatie- en fysiek contact moeten worden vermeden voor beide fixatie-oplossingen. Draag geschikte beschermende kleding, handschoenen en bescherming van de ogen en gezicht. Werken in een zuurkast.
  5. Ga naar bewerking, insluiten en weefsel segmenteren (punten 2 en 3).

2. de weefsels verwerking en insluiten

  1. Uitvoeren van de stapsgewijze uitdroging van weefsel cassettes met de vaste weefselmonsters in 70% (2 x 15 min), 80% (30 min), 90% (60 min) en ethanol 99% (2 x 60 min), gevolgd door xyleen (2 x 60 min). Vervolgens infiltreren met parafin in een geautomatiseerde weefsel processor (4 x 45 min).
  2. Plaats de uitgedroogd en paraffine-geïnfiltreerd monsters met pincet (alternatief en SBFS vaste) in metalen mallen.
  3. Insluiten van de monsters in 5-10 mL gesmolten paraffine (stollen punt 56-58 ° C) met behulp van een paraffine insluiten instrument.
  4. Plaats de mallen op een koeling bord bij-5 ° C gedurende 30 min.
  5. De blokken van paraffine-ingebedde weefsel herstellen van de mallen.
  6. Opslaan van de resulterende blokken (alternatief-vaste, paraffine-ingebedde (NCFPE) en SBFS-fixed paraffine-ingebedde (FFPE)) in het donker bij 4 ° C tot gebruik.

3. de weefsels segmenteren en dia voorbereiding voor vis

Opmerking: FFPE secties worden direct gebruikt voor vis, terwijl dia's met NCFPE secties post in SBFS voor 24 h vóór vis procedure worden vastgesteld.

  1. Een eenmalig gebruik mes in de microtoom invoegen en aanpassen van de microtoom aan 10 µm.
  2. Neem het eerste blok van de koeling plaat en het invoegen van het instrument.
  3. Trim het blok tot een egaal oppervlak is bereikt. Reinig de microtoom met een borstel en aan te passen aan 3 µm. Gooi de eerste 2-3 secties.
  4. Snij 3 µm secties van NCFPE en FFPE blokken en plaats ze in een bad met koud water (ultrazuiver water).
    Opmerking: Voor het verkrijgen van betere foto's zonder overlappende kernen, hier, beelden van 2 µm secties in plaats van 3-5 µm zoals aanbevolen in de manufacturer´s-instructies worden weergegeven.
  5. Elke drijvende sectie met een fijne kwast en een naald op een gecoate microscoopglaasje voor de hechting van de weefselsecties halen.
  6. Deze dia duik in een warme (40 ° C) water bad en laat de sectie volledig strekken.
  7. De sectie terug op de dia door zorgvuldig de dia uit het water te trekken en voorkomen van rimpels.
  8. Laat die alle secties bij kamertemperatuur gedurende 1 uur drogen.
  9. Verwarm de dia's bij 70 ° C gedurende 30 minuten in een incubator te smelten de paraffine.
  10. Zet de dia's horizontaal in een glazen pot kleuring.
  11. Hydrateren de secties stapsgewijze op RT in de kleuring potten gevuld met 250 mL elke van de volgende vloeistoffen: 100% xyleen 2 x 15 min, 96% ethanol 90% ethanol 2 min, 80% ethanol 2 min, 70% ethanol 2 min, 50% ethanol, 2 x 15 min 2 min , en gedistilleerd water 2 x 10 min.
    Let op: Deparaffinization en rehydratie stappen uitvoeren in een zuurkast, giftige volatilized oplosmiddelen niet inademen.
    Opmerking: Afhankelijk van de secties en weefsel, het kan noodzakelijk zijn voor het testen van verschillende incubatie keer vooraf.

4. na fixatie van NCFPE specimens

  1. Na fixatie van NCFPE dia's door ze te plaatsen in een nieuwe kleuring pot gevuld met SBFS gedurende 24 uur op RT. plaats de pot in een zuurkast tijdens de 24 h na fixatie stap uitvoeren
  2. De overtollige SBFS verwijderen door te wassen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (3 x 10 min) en gedestilleerd water (2 x 10 min).

5. fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)

Opmerking: Hier vissen wordt uitgevoerd met behulp van de verkrijgbare HER2/CEN17 dual kleur sonde Kit volgens de instructies van de fabrikant. Laat niet de weefselsecties te drogen tijdens de kruising en wassen stappen. Laat niet de DNA sonde en 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) DNA counterstain oplossingen aan het licht worden blootgesteld gedurende een langere periode. Voer deze stappen uit in het donker met behulp van Svetonepronitsaemyi containers. Afhankelijk van de leeftijd en de stap van de fixatie van het monstermateriaal, verhogen of verlagen de denaturering en wassen temperaturen om betere hybridisatie resultaten te verkrijgen.

  1. Plaats een kleuring pot met 250 mL warmte voorbehandeling oplossing citroenzuur in een waterbad van 98 ° C.
  2. Plaats de gerehydrateerd FFPE en na vaste NCFPE dia's in de pot en incubeer gedurende 15 minuten.
Gebruik niet meer dan zes dia's per pot kleuring.
  • Wassen van de dia's in gedestilleerd water gedurende 3 minuten op RT in een nieuwe kleuring pot.
  • Voor proteolyse, plaatst u de dia's in een temperatuur gecontroleerde kruising systeem bij 37 ° C.
    1. Onmiddellijk, breng de-kant-en-klare pepsine oplossing (2mg/ml) ontkleuring (~ 30 µl per druppel) naar de weefselsecties totdat het volledig bedekt is. Incubeer gedurende 9 min bij 37 ° C in de kruising systeem.
      Opmerking: Een incubatietijd van 5-15 min wordt aanbevolen. De optimale tijd voor proteolyse moet vooraf worden vastgesteld.
    2. Plaats van de dia's in een pot met was buffer SSC en incubeer gedurende 5 min.
    3. De dia's in gedestilleerd water gedurende 1 min spoelen op RT.
    4. Uitvoeren van uitdroging van de secties in de volgende gesorteerde alcoholen: 50%, 70%, 90% en 100%, elk voor 1 min. lucht drogen de secties.
    5. Voor hybridisatie, Pipetteer 10 µL van HER2/CEN17 sonde naar de gedroogde weefselsecties, dekking van elk monster met een dekglaasje aan en verzegel het met rubber-cement.
      Opmerking: 10 µL van de sonde wordt aanbevolen per 22 x 22 mm weefsel gebied. Een zachte opwarming van de aarde van de sonde maakt de pipetting proces gemakkelijker. Vermijd bubbels en lange blootstelling van de sonde aan het licht.
    6. Co denatureren sonde en specimen DNA in het systeem van de kruising bij 75 ° C gedurende 10 minuten.
    7. De kruising systeem ingesteld op 37 ° C en 's nachts te vermengen.
    8. Verwijder voorzichtig het rubber-cement met een tang na kruising en opsporing.
    9. Incubeer de dia's in een kleuring pot met 37 ° C vooraf opgewarmd 1 x wassen buffer A voor 5 min. verwijderen de coverslips.
    10. Wassen de dia's met behulp van vooraf opgewarmd 1 x wassen buffer A tweemaal gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
    11. Uitdrogen van de dia's in 70%, 90% en 100% ethanol, 1 minuten elk.
    12. De monsters in de lucht droog en beschermen tegen licht.
    13. Voor vlekken, breng 30 µL DAPI-oplossing voor het gehybridiseerde gebied vermijden van bubbels. Dekking van de secties met een dekglaasje aan.
    14. Incubeer gedurende 15 minuten beschermd tegen licht.
    15. Verwijder voorzichtig de overtollige DAPI-oplossing door zachtjes te drukken op de dia tussen filtreerpapier.
    16. De dia's bij 2-8 ° C in het donker opslaan voor maximaal 2 weken tot evaluatie door confocale microscopie.

    • 6. confocal imaging en scannen van dia's van vis

    1. Uitvoeren van de confocal imaging en scannen van dia's op een confocal digitale scanner is uitgerust met een 40 x / 1.2 nb objectief, quad band filters (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) en een 5.5Mpx, 16 bit, gekoeld wetenschappelijke aanvullend metalen zuurstofverbinding semiconductor (CMOS) camera.
    2. Verwerven van de beelden met filters voor groen (excitatie: 503 nm, emissie: 528 nm) en oranje (excitatie: 547 nm, emissie: 572 nm) kanalen.

    7. interpretatie

    Opmerking: De sonde HER2/CEN17 is een mengsel van een rode fluorescerende gemerkt CEN17 sonde specifiek voor de regio Alfa satelliet centromeric van chromosoom 17 (D17Z1) en een groene fluorescerende-gelabelde HER2 sonde specifiek voor het HER2-gen (sonde locatie 17q12). Tumor specimens met een HER2:CEN17 verhouding ≤2.0 per kern worden gescoord als normaal, overwegende dat degenen met een HER2:CEN17 verhouding ≥2.0 als versterkte17worden gescoord.

    1. Het uitvoeren van de analyse van de kwaliteit van de beelden met de open source CaseViewer 2.120.
      1. Evalueren ten minste 20 cellen die zich in twee verschillende regio's van de invasieve component van het carcinoom bevinden zoals gedefinieerd door een patholoog. Duidelijk te onderscheiden goed gedistribueerde kernen deelnemen aan het tellen gebied. Uitsluiten van het weefsel regio's aan de grens en de ingeklapte of geperst gebieden tellen.

    8. RNA kwaliteit

    1. RNA extractie
      1. Zorg ervoor dat alle instrumenten en hulpmiddelen RNAse gratis worden. Gebruik een oplossing RNAse-verwijderen.
      2. Knippen 10 tot 20 delen (5 µm dik) van NCFPE of FFPE monsters gebruikend microtome volgens het protocol tot stap 3.8.
      3. RNA uittreksel uit NCFPE monsters met behulp van de RNA-isolatie kit (Zie de tabel van materialen). Het uittreksel van RNA van FFPE monsters met behulp van een FFPE RNA isolatie kit.
        Opmerking: Extractie van RNA van niet-kruis-mailkoppeling fixatives vereist een isolatie-methode aangepast aan de fixatie-methode. Gebruik niet een andere RNA isolatie methode (bijvoorbeeld Trizol, RNeasy FFPE, etc. voor NCFPE model).
      4. Bepaal het RNA concentratie en zuiverheid met behulp van een spectrofotometer. De verhouding van de absorptie bij 260 nm en 280 nm (A260/280) moet worden ~ 2.0.
      5. De geïsoleerde RNA bij-70 ° C bewaren tot verdere analyse.
    2. Uitvoeren van een glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) real-time omgekeerde transcriptie PCR inleidingen gebruiken voor het genereren van waarbij van verschillende lengtes8,9.
      1. Gebruik een cDNA omgekeerde transcriptie kit volgens de instructies van de manufacturer´s voor cDNA synthese. Gebruik 500 ng RNA van elk monster. Bewaren cDNA bij-20 ° C tot verder gebruik.
      2. De master mix van PCR volgens de instructies van de manufacturer´s voor te bereiden.
      3. Pipetteer de master mix van PCR in triplicates in een 384-well reactie plaat. Toevoegen van 4 µL van 1:16 verdund cDNA (PCR sjabloon). De PCR volgens de instructies van de manufacturer´s uit te voeren.
        Opmerking: Voor menselijke GAPDH, werden de volgende inleidingen gebruikt: GAPDH naar voren: 5´-CCACATCGCTCAGACACCAT-3´; GAPDH omgekeerde: 71 bp 5´-ACCAGGCGCCCAATACG-3´, 153 bp 5´-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3´, 200 bp 5´-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3´, 277 bp 5´-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3´, 323 bp 5´-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3´ en 530 bp 5´-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3´.
      4. Analyseer de resultaten met behulp van een software die van toepassing zijn op de machine van PCR. Niet-specifieke producten moeten worden uitgesloten op basis van het smelten van de kromme analyse21.

    Resultaten

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    VIS HER2 bepaling:

    De HER2-vis signaal intensiteiten van FFPE en NCFPE zijn vergelijkbaar (Figuur 2). Beide gevallen in de meeste cellen tonen een duidelijke overmaat van het groene signaal (indicatief van de versterkte HER2-gen locus) in vergelijking met het rood signaal (CEN17 referentie gen). Daarom toont de zaak een versterkte HER2-gen, wat betekent dat deze patiënt verwachting inspelen op trastuzumab, een anti-HER2 gerichte therapie. Het FFPE-model diende als positieve controle. De signalen die waargenomen in niet-neoplastische cellen (zowel in FFPE en NCFPE) dienen als interne verwijzing en negatieve controle voor HER2 gene versterking. Voor elke analyse-serie, moet ten minste één sectie met bekende gene amplificatie status als positieve controle worden gebruikt voor de kruising reactie.

    RNA kwaliteit:

    Overeenkomstige FFPE en NCFPE samples uit twee verschillende gevallen tonen verschillen in RNA kwaliteit door gebruik te maken van real-time omgekeerde transcriptie PCR. Resultaten tonen verschillende versterking efficiëntie voor verschillende amplicon lengtes (dat wil zeggen, 71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) van de GAPDH-mRNA. Alle Ct (cyclus drempel) waarden, verkregen uit FFPE monsters waren hoger dan die van NCFPE. Dit verschil toont de lagere PCR amplificability van mRNA geïsoleerd uit FFPE weefsels, suggereert een meer uitgesproken chemische modificatie. Bovendien, de hogere Ct-waarden voor lang in vergelijking met korte waarbij zijn indicatie voor mRNA fragmentatie. Ter vergelijking: de Ct waarde hellingen van de lengtes van de verschillende amplicon toont meer uitgesproken mRNA versnippering in FFPE dan NCFPE weefsels (Figuur 3).

    figure-results-1
    Figuur 2: representatieve resultaten van HER2 vis voor overeenkomstige formaline vaste paraffine ingesloten (FFPE) en niet-kruis-mailkoppeling, vrij van formaline vaste paraffine-ingebedde weefselsecties (NCFPE). Overeenkomstige monsters uit de dezelfde FFPE (A) en NCFPE (B) weefsels worden weergegeven. In tegenstelling tot normale interfase cellen (C), waar twee groen (HER2) en twee rode (CEN17)-signalen worden verwacht, cellen met versterkte HER2-gen locus vertegenwoordigen meerdere exemplaren van de groene signalen (HER2) (D). De status van de versterking van het HER2 was identiek in zowel FFPE als de post vaste NCFPE-secties (A, B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    figure-results-2
    Figuur 3: resultaten van een real-time omgekeerde transcriptie PCR-test gebruikt voor de controle van de kwaliteit van het RNA. Y-as: Ct (cyclus drempel) waarden van de GAPDH-gen worden weergegeven voor verschillende amplicon lengtes (71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) op de x-as. mRNA werd geïsoleerd uit FFPE en NCFPE van twee verschillende borst kanker weefselsteekproeven verwerkt in parallelle en getranscribeerde aan cDNA voor PCR. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Discussie

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    De resultaten tonen aan dat twee belangrijkste bevindingen. Eerst is een eenvoudige 24u SBFS na fixatie stap van de secties gesneden uit NCFPE weefsels voldoende om het verkrijgen van gelijkwaardige resultaten voor mensen met FFPE in de vis analyses met behulp van vis testen voor FFPE weefsels goedgekeurd (Zie ook naslaginformatie14). Dit protocol heeft het voordeel van het gebruik van vis tests oorspronkelijk ontwikkeld en goedgekeurd voor FFPE zonder de behoefte aan uitgebreide revalidatie (bijvoorbeeld door het optimaliseren van de pre kruising voorwaarden voor non-cross-linked weefsel). Precies zoals beschreven in de instructies van de fabrikant kan de vis-protocol worden gebruikt.

    Kleine wijzigingen van de instructies van de manufacturer´s beschreven in dit protocol (bijvoorbeeld weefsel sectie diameter en incubatie periodes in de deparaffinization stappen) resultaat van eerdere aanpassingen, die uitdrukkelijk door de fabrikant is aanbevolen Als gevolg van het gebruik van verschillende weefseltypes (HLA) en fixatie methoden.

    De stap na fixatie is essentieel, omdat het vereist een chemische reactie tijd van 18-24 h, die strekt zich uit de tijd van de analyse door een dag maar staat dezelfde dagelijkse workflow ontwikkeld voor FFPE weefsels (Figuur 1). SBFS wordt gemeld dat het weefsel op een gemiddelde van 1 mm per uur,22 tot en met 5 mm in 2 h afhankelijk van het type23,24van weefsel doordringen. De observatie dat alleen na fixatie langdurig van meer dan 18 h kon veranderen de eigenschappen van NCFPE naar FFPE afdelingen, geeft aan dat er sprake is van cruciaal belang voor het bereiken van de gewenste resultaten1 niet de penetratie van de fixeer, maar de chemische reactie tijd ,14.

    Ten tweede, het resterende weefsel van de NCFPE die niet voor fixatie van de post gebruikt wordt kan worden gebruikt voor verdere moleculair analyses zoals de biomoleculen goed bewaard gebleven zijn. Dit werd aangetoond door real-time omgekeerde transcriptie PCR (Figuur 3). De bepaling is meer gevoelig en specifiek zijn dan het electropherogram afkomstige RIN waarde (RNA integriteit nummer) met betrekking tot kwaliteit van de RNA (dat wil zeggen, chemische modificatie en fragmentatie) voor mRNA geïsoleerd van paraffine-ingebedde weefsels8. Kwaliteitscontrole was beperkt in deze studie tot PCR in real time aangezien onafhankelijke groepen hebben aangetoond dat naast RNA, de kwaliteit van DNA en eiwitten geïsoleerd van NCFPE beter dan die van FFPE weefsels 8,9, is 13.

    Het protocol gepresenteerd volgt, indien van toepassing (bijv. SBFS recept, fixatie voorwaarden, de controle van de kwaliteit van het RNA, validatie), de eisen van de technische specificaties van de CEN voor vooraf analytische procedures voor in-vitro diagnostiek (IVD), die hebben onlangs vrijgegeven door het Europees Comité voor normalisatie (CEN) (bijvoorbeeld CEN/TS 16827-1:2015 voor RNA-isolatie uit FFPE weefsels waarin wordt verwezen naar de ISO 15189 norm).

    De methode is beperkt tot deze specifieke fixeerspray. Hoewel het goede behoud van biomoleculen en morfologie met behulp van de niet-cross-mailkoppeling, formaline-gratis fixeerspray is gepresenteerd in verschillende studies, wordt het voornamelijk gebruikt in onderzoek maar niet in routine medische toepassingen. Een van de redenen is dat vervanging van de goudstandaard SBFS fixatie door een ander fixeer een verscheidenheid van validatieonderzoek vereisen zou aangezien niet alle protocollen die zijn geoptimaliseerd voor FFPE materiaal kunnen worden gebruikt voor materialen met niet-kruis-mailkoppeling fixatives bevestigd. Andere weefsel fixatie methoden werden niet getest voor deze vis-protocol.

    De eenvoudige na fixatie stap beschreven in dit manuscript heeft het voordeel van het gebruik van IVD goedgekeurde testen beide voor FFPE en NCFPE weefsels.

    Openbaarmakingen

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    D.G. is werkzaam bij Qiagen en voorraad opties of bond bedrijven heeft in de pensioenregeling van het bedrijf. De gegevens in dit manuscript verwijzen naar het PAXgene weefsel systeem, dat is ontwikkeld in een gezamenlijke inspanning door Qiagen en PreAnalytiX. Qiagen is industriële partner van de overheid gefinancierde Christian Doppler laboratorium voor Biospecimen onderzoek en Biobanking technologieën. Alle auteurs hebben geen belangenconflict en geen concurrerende financiële belangen.

    Dankbetuigingen

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Wij danken het team van het laboratorium voor moleculaire pathologie bij het Instituut van de pathologie van de medische Universiteit Graz voor hun expertise en ondersteuning. Bovendien, wij danken Iris Kufferath en Daniela Pabst voor technische bijstand, Bernadette Rieger en Sylvia Eidenhammer voor de verwerking van de HER2-gevallen en Kinga Szurian (patholoog) alsmede Tamas Regényi (3DHISTEC). Wij danken Penelope Kungl voor proeflezen van het manuscript. Dit werk heeft financieel ondersteund door het Christian Doppler onderzoeksfonds, het Oostenrijkse federale ministerie van wetenschap, onderzoek en economie en de nationale Stichting voor onderzoek, technologie en ontwikkeling.

    Materialen

    Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
    NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
    SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Germanywww.sav-lp.deFN-200L-4-1Weefselfixeermiddel
    Simport Plastic Ltd., Beloeil, Canadawww.simport.comM-498Veiligheidsapparaat dat etikettering, fixatie en paraffine-inbedding voor weefselmonsters biedt.
    Qiagen GmbH, Hilden Germanywww.qiagen.com765112Voor het verzamelen, fixeren en stabiliseren van weefselmonsters: 10 voorgevulde reagentiakontainers, met PAXgene Tissue FIX en PAXgene Tissue STABILIZER.
    ThermoFisher Scientificwww.thermofisher.com813150Verwerking van biologische monsters van chemische fixatie tot paraffine-infiltratie
    Merck Millipore, Munich, Germanywww.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.htmlMC1009834000Dehydratie van weefselmonsters
    VWR Chemicals, Darmstadt, Germanyhttps://at.vwr.com10293EPDehydratie van weefselmonsters
    ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Vienna, Austriawww.herba-chemosan.at2549662 32Paraffine gebruikt in een weefselverwerkingsapparaat
    Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Vienna, Austriawww.LeicaBiosystems.com39602004Paraffine-inbeddingsmedium
    Sanova Diagnostik, Vienna, Austriawww.sanova.at5229Paraffine-inbeddingsinstrument voor weefsels voor histologie
    Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Austriawww.histocom.infoM 910010Dit apparaat wordt gebruikt voor bijzonder geavanceerde paraffine-snijtechnieken in de biologie en geneeskunde. Alleen bekwaam of speciaal opgeleid personeel mag de microtoom bedienen, d.w.z. het monster klemmen, trimmen, snijden en de secties van het instrument verwijderen.
    Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmarkwww.chem.agilent.comK802021-2Gecoate glazen platen, bedoeld voor het monteren van formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde weefselsecties.
    Qiagen GmbH, Hilden Germanywww.qiagen.com73504Voor zuivering van totaal RNA uit formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde weefselsecties
    Qiagen GmbH, Hilden Germanywww.qiagen.com765134Voor zuivering van totaal RNA uit PAXgene-gefixeerde, paraffine-ingebedde weefselsecties
    ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Germanywww.zytovision.comZ-2015-200Voor de detectie van ERBB2 (ook bekend als HER2) genamplificatie die vaak wordt waargenomen in solide kwaadaardige neoplasmata, bijv. borstkankermonsters.
    3DHISTEC, Budapest, Hungarywww.3dhistech.comDigitaal apparaat voor het scannen van weefselslides uitgerust met een 40x/1.2 NA objectief, Quad band filters (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) filters en een 5.5Mpx, 16 bit, gekoelde wetenschappelijke CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) camera.
    ThermoFisher Scientificwww.thermofisher.com4368814Het High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit bevat alle componenten die nodig zijn voor de kwantitatieve omzetting van maximaal 2 µg totaal RNA naar enkelstrengs cDNA in één 20 µL reactie.
    ThermoFisher Scientificwww.thermofisher.com4367659PCR Master Mix met polymerase, nucleotiden en SYBR Green voor PCR en kwantificering van amplicons.
    ThermoFisher Scientific, Wilmington, DEwww.thermofisher.comSer. Nr. F239Spectrofotometer voor nucleïnezuurkwantificering.
    QuantStudio 7 Flex Real-time PCR Systemwww.thermofisher.com4485701PCR-machine,
    Vysis/Abbott Laboratories. Abbott Park, Illinois, U.S.Awww.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#orderbijv. (ThermoBrite) 07J91-020Temperatuurgeregeld dia-verwerkingssysteem voor in-situ denaturatie/hybridisatieprocedures.

    Referenties

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, R. P. Formaldehyde fixation. J. Histochem.Cytochem. 33 (8), 845-853 (1985).
    2. Oosterhuis, J. W., Coebergh, J. W., van Veen, E. B. Tumour banks: well-guarded treasures in the interest of patients. Nat. Rev. Cancer. 3 (1), 73-77 (2003).
    3. Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).
    4. Metz, B., Kersten, G. F., Hoogerhout, P., Brugghe, H. F., Timmermans, H. A., de Jong, A., et al. Identification of formaldehyde-induced modifications in proteins: reactionswith model peptides. J. Biol. Chem. 279 (8), 6235-6243 (2003).
    5. Evers, D. L., Fowler, C. B., Cunningham, B. R., Mason, J. T., O'Leary, T. J. The effect of formaldehyde fixation on RNA: optimization of formaldehyde adduct removal. J.Mol. Diagn. 13 (3), 282-288 (2011).
    6. Groelz, D., Sobin, L., Branton, P., Compton, C., Wyrich, R., Rainen, L. Non-formalin fixative versus formalin-fixed tissue: A comparison of histology and RNA quality. Exp. Mol. Pathol. 94 (1), 188-194 (2013).
    7. Do, H., Dobrovic, A. Sequence artifacts in DNA from formalin-fixed tissues: causes and strategies for minimization. Clin. Chem. 61, 64-71 (2015).
    8. Kashofer, K., Viertler, C., Pichler, M., Zatloukal, K. Quality Control of RNA Preservation and Extraction from Paraffin-Embedded Tissue: Implications for RT-PCR and Microarray Analysis. PloS One. 8 (7), e70714(2013).
    9. Viertler, C., Groelz, D., Gündisch, S., Kashofer, K., Reischauer, B., Riegman, P. H., et al. A new technology for stabilization of biomolecules in tissues for combined histological and molecular analyses. J. Mol. Diagn. 14 (5), 458-466 (2012).
    10. Gundisch, S., Slotta-Huspenina, J., Verderio, P., Maura, C., Ciniselli, S. P., Schott, S., et al. Evaluation of colon cancer histomorphology: A comparison between formalin and PAXgene tissue fixation by an international ring trial. Virchows Arch. 465 (5), 509-519 (2014).
    11. Ergin, B., Meding, S., Langer, R., Kap, M., Viertler, C., Schott, C., et al. Proteomic analysis of PAXgene-fixed tissues. J. Proteome Res. 9 (10), 5188-5196 (2010).
    12. Kap, M., Smedts, F., Oosterhuis, W., Winther, R., Christensen, N., Reischauer, B., et al. Histological Assessment of PAXgene Tissue Fixation and Stabilization Reagents. PLoS ONE. 6 (11), e27704(2011).
    13. Mathieson, W., Marcon, N., Antunes, L., Ashford, D. A., Betsou, F., Frasquilho, S. G., et al. A Critical Evaluation of the PAXgene Tissue Fixation System: Morphology, Immunohistochemistry, Molecular Biology, and Proteomics. Am J Clin Pathol. 146, 25-40 (2016).
    14. Oberauner-Wappis, L., Loibner, M., Viertler, C., Groelz, D., Wyrich, R., Zatloukal, K. Protocol for HER2 FISH determination on PAXgene-fixed and paraffin-embedded tissue in breast cancer. Int J. Exp. Path. 97 (2), 202-206 (2016).
    15. Pauletti, G., Godolphin, W., Press, M. F., Slamon, D. J. Detection and quantitation ofHER-2/neu gene amplification in human breast cancer archival material using fluorescence in situ hybridization. Oncogene. 13 (1), 63-72 (1996).
    16. Owens, M. A., Horten, B. C., Da Silva, M. M. HER2 amplification ratios by fluorescence in situ hybridization and correlation with immunohistochemistry in a cohort of 6556 breast cancer tissues. Clin.Breast Cancer. 5 (1), 63-69 (2004).
    17. Wolff, A. C., Hammond, M. E., Schwartz, J. N., Hagerty, K. L., Allred, D. C., Cote, R. J., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. Arch Pathol Lab Med. 131 (1), 18-43 (2007).
    18. Press, M. F., Bernstein, L., Thomas, P. A., Meisner, L. F., Zhou, J. Y., Ma, Y., et al. HER-2/neu gene amplification characterized by fluorescence in situ hybridization: poor prognosis in node-negative breast carcinomas. J. Clin. Oncol. 15 (8), 2894-2904 (1997).
    19. Yamauchi, H., Stearns, V., Hayes, D. F. When is a tumor marker ready for prime time? A case study of c-erbB-2 as a predictive factor in breast cancer. J. Clin. Oncol. 19 (8), 2334-2356 (2001).
    20. Paulik, R., Micsik, T., Kiszler, G., Kaszál, P., Székely, J., Paulik, N., Várhalmi, E., Prémusz, V., Krenács, T., Molnár, B. An optimized image analysis algorithm for detecting nuclear signals in digital whole slides for histopathology. Cytometry A. , (2017).
    21. Applied Biosystems. QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software. , Publication Number 4489822 (2013).
    22. NCCLS. Quality Assurance for Immunocytochemistry. , Wayne. (1999).
    23. Baker, J. R. Principles of Biological Microtechnique. , London: Methuen. Reprinted 1970, with corrections (1958).
    24. Hewitt, S. M., Lewis, F., Cao, Y., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., et al. Tissue handling and specimen preparation in surgical pathology: issues concerning the recovery of nucleic acids from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Arch Pathol. Lab Med. 132 (12), 1929-1935 (2008).

    Herprints en machtigingen

    Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

    Toestemming aanvragen

    Trefwoorden

    Niet crosslinkende fixatiefformalinenachfixatieNCFPE weefselFFPE weefselin situ hybridisatieRNA kwaliteitsanalyseconfocale microscopieproteolysestapdehydratieserie

    Gerelateerde artikelen