Viervoudige Immunostaining van de Olfactorische Lamp voor Visualisatie van Olfactorische Sensorische Axon Moleculaire Identiteitscodes

Summary

Olfactorische zintuiglijke neuronen vormen een grote verscheidenheid aan axon-sorterende moleculen om een ​​goede neurale schakeling te vormen. Dit protocol beschrijft een immunohistochemische kleuring methode om combinatorische expressies van axon-sorterende moleculen te visualiseren bij de axon termini van olfactorische sensorische neuronen.

Abstract

Het muisolfactorische systeem wordt vaak gebruikt om mechanismen van neurale circuitvorming te bestuderen door zijn eenvoudige anatomische structuur. Een Olfactory Sensory Neuron (OSN) is een bipolaire cel met een enkel dendriet en een enkele onbewerkte axon. Een OSN expresseert slechts één Olfactor Receptor (OR) gen, OSN's die een bepaald type OR uitdrukken, convergeren hun axonen naar een paar sets van invariant glomeruli in de Olfactory Bulb (OB). Een opvallend kenmerk van OSN-projectie is dat de uitgedrukte OR's instructieve rollen spelen in axonale projectie. OR's regelen de expressie van meerdere axon-sorteermoleculen en genereren de combinatorische moleculaire code van axon-sorteermoleculen bij de OSN axon termini. Om de moleculaire mechanismen van OR-specifieke axonbegeleidingsmechanismen te begrijpen is het daarom van vitaal belang om hun expressieprofielen op de OSN axon termini te identificeren binnen dezelfde glomerulus. Het doel van dit artikel was om methoden voor het verzamelen van zoveel glomeruli als mogelijk te introducerenE op een enkele OB-sectie en voor het verrichten van immunostaining met behulp van meerdere antilichamen. Dit zou de vergelijking en analyse van de expressiepatronen van axon-sorterende moleculen mogelijk maken zonder kleurvariatie tussen OB-secties te verklaren.

Introduction

Tijdens de ontwikkeling zijn neuronen precies verbonden met elkaar om de juiste neurale circuits te vormen, die kritiek is voor de normale hersenfunctie. Aangezien afwijkende neurale circuits in de hersenen vermoedelijk de oorzaak zijn van psychische stoornissen zoals autisme en schizofrenie, is het begrip van de mechanismen van neurale circuitvorming een van de belangrijkste uitdagingen op het gebied van neurowetenschappen.

In het olfactorische systeem van de muis vertoont elke Olfactory Sensory Neuron (OSN) in het Olfactory Epithelium (OE) slechts één functioneel Olfactor Receptor (OR) gen en OSN's die hetzelfde uitdrukken of hun axonen convergeren naar een specifiek paar glomeruli op stereotiepe locaties in de Olfactory Bulb (OB) ^{1 , 2} . Het muisolfactorische systeem is een uitstekend model systeem voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van neurale circuitvorming omdat onderzoekers de OR-expressie kunnen gebruiken om een ​​specifieke s te identificerenUbtype van OSN's en visualiseer de projectiesites van OSN axons als duidelijke glomerulaire structuren. Een opvallend kenmerk van OSN-projectie is dat OR's instructieve rollen spelen bij het projecteren van OSN-axons naar de OB ^{3 , 4 , 5 , 6} . Meer specifiek, nadat OSN-axonen worden geleid om de doelgebied te benaderen, worden ze gescheiden om glomerulus op een OR-afhankelijke manier te vormen. Vorige onderzoeken hebben aangetoond dat OR moleculen de expressie van axon-sorterende moleculen regelen, die glomerulaire segregatie ^{7 , 8} regelen. Bovendien suggereert accumulerende bewijs dat OR moleculen de neuronale identiteitscode genereren door een unieke combinatie van axon-sorterende moleculen ⁹ . Om het mechanisme van OR-afhankelijke glomerulaire segregatie te begrijpen, is het daarom nodig om de expressieprofielen van axon-sorterende moleculen te karakteriserenEcules in OSN's.

Fluorescerende immunostaining is een gebruikelijke methode om de expressie van specifieke genen te visualiseren. Aangezien eiwitten van axon-sorterende moleculen overwegend gelokaliseerd zijn aan OSN-axonen, moeten onderzoekers OB-afdelingen gebruiken om hun expressiepatronen in OSN's te karakteriseren. Coronale doorsnede van de OB is routinematig gebruikt voor immunostaining. Deze voorbereiding verliest echter de topografische informatie langs de voor- en achterste as in dezelfde OB-sectie. We ontwikkelden daarom een ​​parasagittale voorbereiding van de mediale zijde van de OB, die zo veel mogelijk glomeruli op de zelfde OB-sectie kan monteren. Gecombineerd met immunostaining met behulp van meerdere antilichamen, maakt dit preparaat de vergelijking en analyse van de expressiepatronen van axon-sorterende moleculen zonder kleursvariatie tussen OB-secties mogelijk.

Verder is een immunohistochemische kleuring methode gepresenteerd zonder postfixatie met PFA aEn sucrose behandeling. Met deze methode kunnen onderzoekers voldoende kwalitatief goede kleurdata verkrijgen voor multivariabele data-analyse. De hier beschreven protocollen geven details van krachtige methoden voor onderzoekers die de olfactieve neurale kringvorming bestuderen.

Protocol

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd met goedkeuring van het ethiekcomité voor dierproeven aan de Universiteit van Tokio en volgens de richtlijnen van de Universiteit van Tokio voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren.

1. Bereiding van oplossingen

1. Bereid 0,01 M fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS) op: Voeg een PBS-tablet (0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,010 M PO ₄ ^3- , pH 7,4) toe aan 1 liter gedistilleerd water en roer bij kamertemperatuur totdat het volledig is opgelost.
2. Bereid 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS: voeg 4 g PFA toe aan 100 ml PBS. Roer de oplossing bij 60 ° C tot het volledig is opgelost.
   1. Na het oplossen van de PFA in PBS, pas de pH van de oplossing aan op 7.4 met 1 N natriumhydroxide (NaOH). Dan afkoelen op ijs en filter de oplossing door een filterpapier om eventuele deeltjes te verwijderen. Bewaren bij 4 ° C.
      Let op: Neem de nodige zorg bij gebruik van deze reagentia. HandvatMet zorg en handschoenen, veiligheidsbril en laboratoriumjas onder een chemische kap.
      OPMERKING: Gebruik verse 4% PFA oplossing bereid binnen 2 d.
3. Bereid 0,01 M PBS aangevuld met 0,3% Triton X-100 (PBST): voeg 3 ml Triton X-100 tot 997 ml PBS toe. Roer de oplossing bij RT totdat het volledig is opgelost.
4. Bereid 1% en 5% blokkerende oplossing op: voeg 10 g schuimmelk toe aan 200 ml PBST om 5% blokkerende oplossing voor te bereiden. Roer bij RT totdat het volledig is opgelost. Verdun 5% blokkerende oplossing vijf keer met PBST om 1% blokkerende oplossing te bereiden.

2. Voorbereiding van parasitaire OB secties

1. Gebruik dieren tussen 1-2 weken oud. Deze leeftijdsgroepen zijn geschikt voor de volgende experimenten omdat glomeruli duidelijk zichtbaar zijn en de hersenen met de schedel kunnen worden gesneden.
2. Verdoof het dier met een intraperitoneale injectie van pentobarbital (50 mg / kg lichaamsgewicht). Perfectioneer het dier transcardiaal met ijskoud 4% PFA in PBS. Hanteer voorzichtig en gebruik handschoenen, veiligheidsbril en laboratoriumjas onder een chemische kap.
3. Na perfusie, snijd het hoofd met een schaar en verwijder de huid zorgvuldig. Zet dan een mes van de schaar in de ruimte tussen de bovenste en onderste tanden en snijd horizontaal om de onderste kaakbeen te verwijderen. Trim het overtollige weefsel met pincet en een schaar om het olfactieve weefsel te verlaten, inclusief de OB en OE.
   OPMERKING: Verwijder niet de schedel rondom de OB omdat dit de mediale glomeruli rechtop rechtop houdt.
4. Dompel het olfactieve weefsel in PBS om de lucht in de neusholte te verwijderen. Knip het achterste gedeelte van de hersenen verticaal af en plaats het olfactieve weefsel op de bodem van de embeddingvorm met het snijvlak naar beneden. Vul de schimmel met Optimal Cutting Temperature (OCT) compound en doei de vorm dan in vloeibare stikstof.
   1. Nadat het weefsel in de verbinding volledig is bevroren, incubeer het in de cryosTat bij -20 ° C gedurende 1 uur.
5. Maak seriële parasagittale secties (10 μm) van de OB met een cryostat en verzamel ze door vast te houden aan MAS-gecoate glazen glijbanen. Na het plakken, droog de dia's onmiddellijk met een droogtrommel.

3. Dag 1: Quadruple Immunostaining van de OB Slices

1. Was de glijbanen gedurende 5 minuten met PBS bij RT. Herhaal 3 keer.
2. Blok de niet-specifieke bindingsplaatsen door de glijbanen 1 uur in te incuberen met de 5% blokkeringsoplossing bij RT.
3. Incubeer de dia's O / N met een cocktail van primaire antilichamen (400 μl elke dia) in de 1% blokkerende oplossing bij RT. Gebruik de volgende primaire antilichamen: antilichaam anti-Kirrel2-antilichaam (1: 1000), geit anti-semaforine-7A (Sema7A) antilichaam (1: 500), anti-OL-protocadherine (OLPC) antilichaam (1: 500) En anti-vesiculaire glutamaat transporter2 van de muis (VGLUT2) antilichaam (1: 500).

4. Dag 2: Quadruple Immunostaining van de OBSlices

1. Gooi de primaire antilichaamoplossing weg en doe de glijbanen gedurende 5 minuten met PBST bij RT. Herhaal 3 keer.
2. Incubeer de dia's gedurende 1 uur met een cocktail van secundaire antilichamen (400 μl elke dia) in PBS bij RT. Gebruik de volgende secundaire antilichamen: Alexa anti-mousse Alexa Fluor 405 (1: 400), ezel anti-geiten Alexa Fluor 488 (1: 400), Donkere anti-cavia Alexa Fluor 555 (1: 400) Ratten Alexa Fluor 647 (1: 400).
   OPMERKING: Alle secundaire antilichamen zouden afkomstig moeten zijn van dezelfde gastheersoort. Kies een andere golflengte van fluorescentie van secundaire antilichamen voor elk primair antilichaam om te voorkomen dat de golflengtes overlappen.
3. Gooi de oplossing weg en doe de glijbanen gedurende 5 minuten met PBS bij RT. Herhaal 3 keer.
4. Monteer de deklagen op de glijbanen met het montagemedium. Zet hiervoor 2 druppels van het montagemedium op elke dia, en doe dan een deklaag door de luchtbellen te verwijderen.

5. Intensiteit Measurements

1. Verkrijg fluorescerende beelden met een fluorescentiemicroscoop. Gebruik de volgende filterblokjes: DAPI filterkubus (360/40 nm excitatie, 460/50 nm emissie en 400 nm dichroische spiegel) voor Alexa Fluor 405 signalen, GFP filterkubus (470/40 nm excitatie, 525/50 nm emissie, En 495 nm dichroische spiegel) voor Alexa Fluor 488, TRITC filterkubus (545/25 nm excitatie, 605/70 nm emissie en 565 nm dichroische spiegel) voor Alexa Fluor 555 en Cy5 filterkubus (620/60 nm excitatie, 700 / 75 nm emissie en 600 nm dichroische spiegel) voor Alexa Fluor 647.
   Opmerking: Stel de belichtingstijd in om fluorescerende signalen van de afbeelding te verkrijgen zonder verzadiging.
2. Definieer de glomerulaire structuur door immunofluorescentie signalen van VGLUT2. Meet vlekintensiteiten van axon-sorterende moleculen binnen glomeruli met ImageJ.

6. Data-analyse

1. Subtract achtergrondsignalen van de kleurintensiteiten van axon-sorterende moleculen.
2. Bereid thE-expressiedatamatrix, die kolommen bevat die samengesteld zijn uit axon-sorterende moleculen en rijen samengesteld uit de glomeruli.
3. Voer een hoofdcomponentanalyse (PCA) uit met behulp van de voorbereide expressie dataset. Krijg dan de PCA scores, bijdrage ratio's en factor loadings van elk hoofdcomponent.

Results

De olfactieve glomerulaire kaart wordt gevormd door initiële globale targeting en daaropvolgende glomerulaire segregatie van OSN axons ^{1 , 2} . Glomerulaire segregatie wordt gereguleerd door de adhesieve / afstotende axonale interacties gemedieerd door axon-sorterende moleculen waarvan de expressieniveaus worden bepaald door uitgedrukte OR-moleculen ⁷ . De axon-sorterende moleculen die betrokken zijn bij gl...

Discussion

Viervoudige immunostaining van parasagittale OB-secties heeft de visualisatie en kwantificering van de expressieniveaus van maximaal vier axon-sorteermoleculen gelijktijdig mogelijk gemaakt in een groter aantal glomeruli. Door deze multivariabele gegevens te analyseren met PCA kunnen de kenmerken voor de expressie van die moleculen gespeculeerd worden.

Voor succesvolle kleuring is het weefselmonsterbereiding kritisch belangrijk. Sommige protocollen suggereren dat weefsels moeten worden vastg...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4	TAKARA BIO	T9181
Skim Milk	nacalai tesque	31149-75
goat anti-Sema7A antibody	R&D Systems	AF2068
rat anti-OLPC antibody	Merck Millipore	MABT20
mouse anti-VGLUT2 antibody	Merck Millipore	MAB5504
goat anti-BIG-2 antibody	R&D Systems	AF2205
gunea pig anti-Kirrel2 antibody	Operon Biotechnologies		Anti-Kirrel2 antibodies werden gegenereerd door het immuunmaken van cavia's met KLH-geconjugeerde synthetische peptiden (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP
donkey anti-mouse Alexa Fluor 405	Abcam	ab175658
donkey anti-goat Alexa Fluor 488	Jackson ImmunoResearch	705-545-003
donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A21432
donkey anti-rat Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	712-605-153
Paraformaldehyde (PFA)	Wako	162-16065
MAS coated slide glasses	MATSUNAMI	MAS-01
forceps	Fine Science Tools	11253-27
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
dissecting scissors	Fine Science Tools	14090-09
fluorescent microscope	KEYENCE	BZ-X700
DAPI filter cube	KEYENCE	OP-87762
GFP filter cube	KEYENCE	OP-87763
TRITC filter cube	KEYENCE	OP-87764
Cy5 filter cube	KEYENCE	OP-87766
filter paper	ADVANTEC	00011185
O.C.T compound	Sakura Finetek	M71484