Dit manuscript beschrijft methodes voor het toepassen van peptide microarray technologie op specificiteit profilering van antilichamen die histonen herkennen en hun post-translationele modificaties.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Analyse van Histone Antilichaam Specificiteit Met Peptide Microarrays
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Post-translationele modificaties (PTM's) op histonproteïnen worden op grote schaal onderzocht voor hun rol bij het reguleren van chromatinestructuur en genexpressie. De massaproductie en distributie van antilichamen die specifiek zijn voor histone PTM's, hebben dit onderzoek op grote schaal vergemakkelijkt. Aangezien histon PTM-antilichamen belangrijke reagentia zijn voor veel chromatin-biochemie toepassingen, is een nauwkeurige analyse van antilichaamspecificiteit noodzakelijk voor nauwkeurige data-interpretatie en voortdurende vooruitgang op het gebied. Dit protocol beschrijft een geïntegreerde pijpleiding voor het ontwerp, fabricage en gebruik van peptide microarrays voor het profileren van de specificiteit van histonantilichamen. De ontwerp en analyse aspecten van deze procedure worden vergemakkelijkt door ArrayNinja, een open source en interactief softwarepakket dat we onlangs ontwikkeld hebben om de aanpassing van microarrayformaten te stroomlijnen. Deze pijpleiding is gebruikt om een groot aantal commercieel verkrijgbare en veel gebruikte histone PTM antibodies te screenenS, en gegevens die gegenereerd worden uit deze experimenten zijn vrij beschikbaar via een online en expanderende Histone Antibody Specificity Database. Naast histonen kan de hierin beschreven algemene methodologie in grote mate toegepast worden op de analyse van PTM-specifieke antilichamen.
Inleiding
Genomisch DNA wordt elegant verpakt in de eukaryote celkern met histonproteïnen om chromatine te vormen. De herhalende subeenheid van chromatine is het nucleosoom, dat bestaat uit 147 basisparen DNA die rond een octamerische kern van histonproteïnen - H2A, H2B, H3 en H4 1 worden gewikkeld. Chromatine is in ruime mate georganiseerd in losgekoppelde euchromatine en strak verpakte heterochromatin domeinen. De mate van chromatine compactie regelt de mate waarin eiwit machines kunnen toegang krijgen tot het onderliggende DNA om fundamentele DNA-templated processen zoals replicatie, transcriptie en reparatie uit te voeren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Installeren en uitvoeren van ArrayNinja
- Download en installeer Oracle Virtual Box van www.virtualbox.org.
- Download en uncomprimeer de ArrayNinja virtuele machine (VM) van http://research.vai.org/Tools/arrayninja.
- Open Virtual Box en voeg de ArrayNinja VM toe door op 'Machine', 'Add' te klikken en selecteer arrayninja.vbox uit de map waar ArrayNinja VM is opgeslagen.
- Start ArrayNinja door deze in Virtual Box te selecteren en op de groene 'start' pijl te klikken.
- Virtual Box zal een nieuw venster openen en een bericht tonen dat de VM kan worden geopend door de webbrowser naar localhost te nav....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol is gebruikt om een peptide microarray platform te ontwerpen en fabriceren voor de analyse van histon PTM antilichaam specificiteit. De array vraagt een bibliotheek met meer dan 300 unieke peptidefuncties (20 tot 40 resten in lengte), die veel van de bekende combinaties van PTM's vertegenwoordigen, gevonden op kern- en varianthistonproteïnen 38 . Deze pijpleiding is een werkhorst voor het screenen van veel veelgebruikte en in de handel verkrijg.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De betrouwbaarheid van antilichamen in biomedische onderzoekstoepassingen is voornaamste 46 , 47 . Dit geldt met name in chromatin biochemie gezien de positie van antilichamen als belangrijke instrumenten voor de meerderheid van de technieken ontwikkeld om de overvloed en verdeling van histon PTMs te karakteriseren. Het protocol presenteerde hier details een geoptimaliseerde pijpleiding voor het ontwerp, fabricage en gebruik van peptide microarrays om de histon .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Van Andel Research Institute en een onderzoeksbijdrage van de National Institutes of Health (CA181343) naar SBR
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Printing Buffer | ArrayIt | PPB | |
| BSA | Omnipure | 2390 | |
| Streptavidin-coated glass microscope slides | Greiner Bio-one | 439003-25 | |
| polypropylene 384 well plate | Greiner Bio-one | 784201 | |
| Biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | |
| contact microarray printer | Aushon | 2470 | Aushon 2470 Microarray Printer |
| contact microarray printer | Gene Machines | OmniGrid 100 | OmniGrid Microarray Printer |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Blocking Buffer | ArrayIt | SBB | |
| Hydrophobic wax pen | Vector Labs | H-4000 | ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen |
| Silicon Gasket | Grace Bio-labs | 622511 | |
| Hybridization Vessel | Thermo Scientific | 267061 | of soortgelijk vat |
| Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21244 | Alexa Fluor 647 (anti-konijn) |
| Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21235 | Alexa Fluor 647 (anti-muis) |
| Wax Imprinter | ArrayIt | MSI48 | |
| Tween-20 | Omnipure | 9490 | |
| Microarray Scanner | Innopsys | InnoScan 1100AL | of equivalent microarray scanner |
| EipTitan Histone Peptide Microarray | Epicypher | 112001 | |
| AbSurance Pro Histone Peptide Microarray | Millipore | 16668 | |
| MODified Histone Peptide Array | Active Motif | 13001 | |
| Histone Code Peptide Microarrays | JPT | His_MA_01 | |
| Wax | Royal Oak | GulfWax | voor wax imprinter |
| Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber | VWR | 97000-284 | |
| High throughput microscope slide washing chamber | ArrayIt | HTW | |
| Microscope slide centrifuge | VWR | 93000-204 | |
| Antibody 1 | Abcam | 8898 | |
| Antibody 2 | Millipore | 07-473 | |
| Biotinylated histone peptide | EpiCypher | 12-0001 | Voorbeeldpeptide. Vergelijkbare peptiden met verschillende modificaties zijn verkrijgbaar bij verschillende commerciële bronnen. |
| ImageMagick | https://www.imagemagick.org/script/index.php | ||
| ArrayNinja | https://rothbartlab.vai.org/tools/ |
Referenties
- van Steensel, B. Chromatin: constructing the big picture. EMBO J. 30 (10), 1885-1895 (2011).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Rothbart, S. B., Strahl, B. D.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
