Bioengineering van Humanized Botmarg Microenvironments in Mouse en hun visualisatie door Live Imaging

Summary

Een methode om verschillende gehumaniseerde beenmergnissen in muizen te creëren en te leven, wordt gepresenteerd. Op basis van de ondersteunende niche die door menselijke mesenchymale cellen is gecreëerd, induceert de toevoeging van menselijke endotheelcellen de vorming van menselijke vaten, terwijl de toevoeging van rhBMP-2 de vorming van chimerisch volwassen weefsel van humane muizen veroorzaakt.

Abstract

Menselijke hematopoietische stamcellen (HSC's) zijn gevestigd in het beenmerg (BM) niche, een ingewikkeld multifactorisch netwerk van componenten die cytokines produceren, groeifactoren en extracellulaire matrix. Het vermogen van HSCs om stil te blijven, zelfherzien of te differentiëren, mutaties te verwerven en kwaadaardig te worden, hangt af van de complexe interacties die ze met verschillende stromale componenten vestigen. Om de kruispunten tussen menselijke HSC's en de menselijke BM-niche in fysiologische en pathologische condities te waarnemen, hebben we een protocol ontworpen om ectopisch model en beeld een geanimeerde BM niche in immunodeficiënte muizen te maken. We tonen aan dat het gebruik van verschillende cellulaire componenten de vorming van menselijke structuren mogelijk maakt en de mogelijkheid biedt om langdurig humaan hematopoietische engraftment te behouden. Met behulp van twee-foton microscopie kunnen we deze structuren in situ bij de single-cellresolutie imiteren, waardoor een krachtig nieuw instrument voor de functionele karakterisering van de menselijke BM mMicro-omgeving en zijn rol bij het reguleren van normale en kwaadaardige hematopoiesis.

Introduction

Cel-beslissingen die in stamcelcompartimenten worden waargenomen, worden streng geregeld door zowel intrinsieke als extrinsieke factoren. In het bijzonder wordt nu algemeen erkend dat de BM micro-omgeving een fundamentele rol speelt bij het beheersen van de schakelaar in HSC's van een rustige naar een actieve toestand, evenals in hun zelfvernieuwing of differentiatieleerbeslissing ¹ . Bovendien blijkt uit recente bevindingen dat hematologische kwaadaardigheden de functie van de BM micro-omgeving beïnvloeden, wat wijst op het bestaan ​​van actieve kruisvorming tussen de twee compartimenten ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Ondanks recente vooruitgang blijven veel sleutelvragen over hoe de activiteit van specifieke BM-niche-componenten bijdraagt ​​aan HSC-gedrag en maligne transformatie.

De BM micro-omgeving is een zeer heterogeen Eenige en complexe mix van veel verschillende celtypes, elk met gespecialiseerde functies. De overvloedige endotheliale (EC) en vasculaire component regelen de omzet van het nutriënten- en metaboliet, de ingreep en uitkomst van verschillende cellen naar en van de BM, en diverse HSC-functies ^{7 , 8} . Mesenchymale stromale cellen (MSC's), een heterogene populatie van ongedifferentieerde stamcellen en voorlopers verricht via drie lijnen (dwz osteogene, chondrogene een adipogene), zijn een fundamenteel onderdeel van de BM niche. Deze MSC's lokaliseren zich zowel in de centrale gebieden van de BM en in de nabijheid van het endostale gebied. Zij kunnen worden geassocieerd met vasculaire structuren en zijn betrokken bij de regulering van HSC functie ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13 ,}"> 14 ^{, 15} .

Veel rapporten suggereren dat HSCs op verschillende gedefinieerde plaatsen binnen de merg verblijven en dat hun functie kan afhangen van hun precieze lokalisatie. De meeste huidige kennis over HSC's en hun interactie met de BM micro-omgeving komen uit muizenstudies ¹ . Het gebruik van xenograftmodellen heeft deze kennis uitgebreid naar menselijke normale en kwaadaardige HSCs, ingrijpen in de muizen BM van immunodeficiënte muizen ^{16 , 17 , 18 , 19 , 20} . Hoewel dit een geldig model vertegenwoordigt, bevat het nog steeds vele uitdagingen, zoals de noodzaak om de ontvanger muis in de meeste gevallen voorwaarde te geven voor menselijke HSC homing en engraftment of de cross-species barrière en zijn slecht begrepen invloed op cel-cel interacties en functies.

Het gebruik van neutraliserende antilichamen en genetisch gemodificeerde muizen, samen met xenotransplantatie, heeft bijgedragen aan het complexe dialoog dat menselijke HSC's met hun micro-omgevingen vestigen. De introductie en ontwikkeling van intravitale twee-foton confocale microscopie heeft deze studies een stap vooruit gezet, waardoor de directe, hoge resolutie en dynamische beeldvorming van het beenmerg ^{19 , 20 , 21 , 22 mogelijk is} en een krachtig instrument voor de functionele Karakterisering van de BM micro-omgeving en zijn rol bij het reguleren van de HSC-functie. Om sommige van de problemen die zich voordoen bij klassieke xenotransplantatiemodellen te omzeilen, is het concept engineering een humanized BM structuur op de voorgrond gebracht. Samenvoegen van biomaterialen en cellimplantatieconcepten, rapporten hebben aangetoond dat de haalbaarheid van het menselijk botmPijl-micro-omgeving in heterotopische gebieden ^{23 , 24 , 25 , 26 , 27} . Dit maakt de mogelijkheid om bioengineering in muismodellen te gebruiken om menselijke normale en kwaadaardige hematopoiesis ^{28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39} , tumorigenese en metastase ^{40 , 41 , 42} te bestuderen ^{. , 43 , 44} .

Gebaseerd op eerdere ervaring in botweefseltechniek en in vivo beeldvorming ^{19 , 22 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52} beschrijven we een protocol voor bioengineer en organische biologische humane BM-weefsels. Deze structuren zijn afkomstig van de implantatie van humane BM-afgeleide stromacellen in collageen gebaseerde steigers subcutaan ingeënt in immunodeficiënte muizen. In een eerdere rapportage hebben we aangetoond dat menselijke MSC's de vorming van een menselijke micro-omgeving waarborgen voor de inplanting van humane hematopoietische cellen ⁴⁵ . Verder beschrijven we hoe de co-implantatie van een ander menselijk BM-celcomponentS, zoals menselijke endotheelcellen (hEC) en / of cytokines die belangrijk zijn voor botvorming ( bijv. HBMP2), werken samen met hMSCs om verschillende gehumaniseerde micro-omgevingen te genereren, die in situ live-imaged kunnen worden.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd onder PPL 70/8904, goedgekeurd door het UK Home Office en overeenkomstig de richtlijnen van Cancer Research UK. Het gebruik van humaan navelstrengbloed (UCB) en primaire humane acute myeloïde leukemie (AML) -monsters werd goedgekeurd door het Ethische Comité van East London na toestemming en werd uitgevoerd overeenkomstig de Verklaring van Helsinki.

1. Bioengineering Collagen-gebaseerde Steigers met Humane Hematopoietische en Stroomcellen

OPMERKING: Het gehele protocol moet worden uitgevoerd in steriele omstandigheden en met steriel materiaal. Celcultuurmedium 1 komt overeen met hMSC-medium (MEM-a, P / S en 10% hMSC-FBS); Celcultuurmedium 2 komt overeen met EC-medium (M199, 20% FBS, P / S, 10 mM HEPES, 50 μg / ml heparine, 2 mM glutamine en 50 μg / ml ECGS) en celkweekmedium 3 komt overeen met hematopoietisch celmedium (H5100 En P / S).

1. Bereiding navelstrengbloed mOnonucleaire cellen (CB-MNC's) of primaire AML (beenmerg of perifere bloed MNC's) met behulp van een Ficoll-Paque dichtheidsgradiënt, volgens bekende protocollen ⁵³ .
   1. Voor AML, verwijder de T-cellen met behulp van OKT.3-antilichaam. Incubeer 4 μg OKT.3 per 1 x 10 ⁶ AML MNCs gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur voordat u de cellen in PBS wassen. Indien nodig, cryopreserve de MNC's in FBS met 10% DMSO bij 2 x 10 ⁸ cellen per ml.
2. Bereid hMSC (cultuurmedium 1) en EC (cultuurmedium 2) celculturen op. Plate hMSC-cellen (zie de tabel van materialen ) op reguliere celkweekflessen in hMSC-medium. Plate ECs (zie de Tabel van Materialen ) op collageen 1-beklede oppervlakken in EC-medium.
3. 85-90% celconfluentie Verwijder het medium tweemaal wassen met PBS en voeg trypsine-EDTA-oplossing (20 ui per ^cm2).
   1. Controleer na 5 minuten dat cellen losgelaten zijn. Herstel de cellen door 1:3 met celcultuurmedium. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten en opnieuw opschorten in het bijbehorende medium voor elk celtype en tel de cellen met een Neubauer kamer.
   2. Gebruik cellen bij 2 x 10 ⁶ - 10 ⁷ cellen per ml. Als beide celtypes samen moeten worden gebruikt, meng dan de hMSC- en EC-suspensies in een 1: 1-verhouding.
4. Zet de celsuspensie over op een insulinspuit.
5. Met behulp van een scalpel, snijd de gelamineerde gelatine spons ( bijv. Gelfoam) eerste steiger (20 mm x 60 mm x 7 mm) in 24 stuks van gelijke grootte (6,6 mm x 7,5 mm x 7 mm, figuren 1A en B ).
6. Reconstitute gelatine steigers door onderdompeling in PBS (5 min).
7. Eén voor één zet de steigers zachtjes op een steriel weefsel om overtollige PBS te verwijderen. Breng de steigers over naar een putje van een 24-putjesplaat (ultra-lage bevestigingsoppervlak) en gebruik de injectiespuit om 50 μL bevattende 10 ⁵ - 10 ⁶ cellen (hMSC alÉén of in combinatie met hEC; Figuur 1C ).
8. Herhaal stap 1.7 met elke steiger totdat alle benodigde steigers worden geplant met stromale cellen.
9. Incubeer gedurende 1 uur in een celcultuur incubator (37 ° C en CO ₂ 5%).
10. Vul elk goed met 3 ml celkweekmedium 1 ( Figuur 1D ) en stuur de steigers terug naar een celcultuur-incubator (37 ° C en CO ₂ 5%) gedurende de incubatie gedurende de nacht. Gebruik celcultuurmedium 2 als EC's in de steigers gebruikt worden.
11. Ontdooi CB-MNC's en isoleer CD34 ⁺ cellen van hen na een geschikt CD34 ⁺ sectie kit protocol. Scherp de geselecteerde CD34 ⁺ cellen in medium 3 en tel ze in een Neubauer kamer.
    OPMERKING: Hier werden cellen gebruikt bij een concentratie van 2 x 10 ⁶ cellen per ml.
    1. Als AML-patiënt afgeleide primaire monsters worden gebruikt, doe de cellen op, verdun ze 1:10 in FBS, centrifugeer ze gedurende 5 minuten op 300Xg, de cellen resuspenderen in PBS-2% FBS, voeg anti-humaan CD3-antilichaam toe (2 - 4 μg per 10 ⁶ cellen) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 xg en resuspendeer in hematopoietische celmedium aangevuld met cytokinen (20 ng / ml granulocyt-kolonistimulerende factor (G-CSF), 20 ng / ml IL-3 en 20 ng / ml trombopoietine (TPO)) .
12. Herhaal stappen 1.7 - 1.9, maar in dit geval zaaien 1 x 10 ⁵ humane hematopoietische cellen in plaats van stromale componenten, zoals hierboven.
    1. Vul de put met 3 ml celkweekmedium 3 ( Figuur 1D ) en stuur de steigers terug naar een celcultuur-incubator (37 ° C en CO ₂ 5%) gedurende de incubatie gedurende de nacht. Gebruik een 1: 1 mix van celcultuurmedia 2 en 3 Als EC's in de steigers gebruikt worden.
13. Voor alleen recombinant humane botmorfogenetische eiwit-2 (rhBMP-2) dragerschalen, zet de steigers een voor een voorzichtig op een steriel weefsel om overtollige P te verwijderen.BS. Breng de steigers over naar een putje van een u-bodem, 96-putjesplaat ( Figuur 1E ) en voeg 5 μL rhBMP-2 toe, waarbij de steiger grondig wordt bedekt.
    1. Voeg 20 μL trombine toe, gevolgd door 20 μl fibrinogeen, waarbij de steiger elke keer grondig bedekt wordt ( Figuur 1F ). Herhaal de procedure voor elke steiger totdat alle benodigde steigers worden behandeld en 5 tot 10 minuten bij 37 ° C incuberen. Controleer of stolling succesvol is gevormd.

2. Chirurgische implantatie van Bioengineered Steigers

OPMERKING: hier werden mannelijke of vrouwelijke, 6- tot 12-weken oude NSG-muizen gebruikt. Aangezien de dieren immunodeficiënt zijn, dienen alle procedures in steriele omstandigheden te worden uitgevoerd. Stappen 2.10 - 2.13 zijn gerelateerd aan overlevingsstrategieën en post-chirurgische zorg.

1. 60 - 120 minuten voor de operatie, ondergaan pijnstillend medicatie (carprofen, 5 mg / kg lichaamsgewicht / muis) onder de huid.
2. Induceren anesthesie in een kamer met 0,5% isofluraan en 2 l / min _O2. Muizen moeten continu worden gecontroleerd tijdens de procedure. Verplaats het dier naar het chirurgische gebied in slechte positie om de rug gemakkelijk te kunnen bereiken. Houd het dier onder narcose via een neuskegel toevoeren 1,5% isofluraan en 2 l / min _O2. Houd de muis onder de verdoving tijdens de chirurgische procedure en controleer de dierlijke toestand regelmatig.
3. Terwijl het onder anesthesie is, gebruik oogmisk gel in de ogen van de muis om droogheid te voorkomen en houd de muis bij 37 ° C.
4. Scheer de chirurgische ruimte aan de achterkant van de muis met behulp van een elektrische trimmer. Om de huid te steriliseren, doe een katoenen tip in verdunde clorexidine (verdund 1:10 in PBS) en gebruik deze tip om het huidoppervlak te reinigen. Herhaal deze procedure tweemaal.
5. Met behulp van steriele tang en een scalpel (of een schaar), maak een 0,5 tot 0,7 cm anterior-to-posterior volledige insnijding van de huid. Gebruik de ingevoerde pincetOnder het subcutane weefsel om een ​​zak te maken.
6. Steek de steiger subcutaan in, zorg ervoor dat het diep in de zak zit ( Figuur 1G en H ). Sluit de incisie met chirurgische lijm ( Figuur 1I en J ).
7. Om post-chirurgische pijn te behandelen, moet buprenorfine (0,1 mg / kg lichaamsgewicht) subcutaan toegediend worden.
8. Plaats tijdens het herstel het dier aan de zijkant in een voorverwarmde kooi en controleer het herstel tot het normale gedrag wordt waargenomen.
9. Verdun pijnstillende medicatie in water (carprofen, 0,1 mg / ml water) en geef het aan dieren als drinkwater gedurende 4 dagen na de operatie.
10. Controleer het dier en de wond regelmatig gedurende de 48 uur na de operatieperiode voor mogelijke bijwerkingen.

3. Muisbehandelingen, Euthanasie, en Sample Retrieval voor Imaging

OPMERKING: Analyse van de steigers wordt uitgevoerd tussen8 en 24 weken na implantatie.

1. 60 minuten voor beeldvorming, houd de geïmplanteerde muis warm in een verwarmingsbox bij 37 ° C en injecteer 100 μL humaan immunoglobuline intravenously om onspecifieke plaatsen te blokkeren.
2. 30 min voor beeldvorming, intravenously toedienen 10 μg (per muis) van specifieke antilichamen om de cellen van belang te labelen.
3. 5 minuten voor beeldvorming, toediening 15 μL (verdund in 100 μl PBS) van 655 nm fluorofoor gelabeld, vaatpoolmiddel (655-VPA) voor het visualiseren van vasculaire structuren.
4. Euthanize de muis via cervicale dislocatie.
5. Gebruik een scherpe schaar, maak een longitudinale huidinsnijding op de achterkant van de muis, in de buurt van de oorspronkelijke implantatieplaats.
6. Met behulp van een pincet en een schaar, scheid de huid zorgvuldig van de subcutane zak waar de steiger geïmplanteerd is.
7. Houd de steiger met pincet vast en ontkiem het zachtjes uit de huid door het resterende membraan a te snijdenNd weefsel rond de steiger met behulp van een schaar. Zie voorbeelden van steigers die worden hersteld in Figuur 2 .
8. Bevestig de steiger met snelwerkende kleeflijm aan een afbeeldingsplaat (een 35 mm x 10 mm Petri-schotel) en vul deze op met zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur.
9. Voor BMP-steigers, voordat u de plaat met PBS invult, gebruik een chirurgische microdrill om het botoppervlak te dunken onder een microchirurgische microscoop; Dit maakt het mogelijk om visualisatie van fluorofore en beeldopname met hoge resolutie te maken. Gebruik de 1.2 of 1.6 mm burren, afhankelijk van de grootte van de steiger.
   OPMERKING: De gebruiker zal beseffen hoeveel te boren, afhankelijk van de dikte van het bot. In het algemeen, aangezien de BMP-stellingen vascularized zijn, verandert het bot licht en verandert het rood wanneer het de juiste dikte voor beeldvorming nadert.
10. Plaats de plaat op het stadium van de confocale microscoop.

4. Live-imaging met behulp van twee-foton microscopy

OPMERKING: Gebruik bij gebruik van niet-afgedankte detectors (NDD) altijd de NDD-schuifregelaar voor beeldvorming om de fluorescentie naar de NDD te leiden. De configuratie van de microscoop is verschaft in figuur 3 .

1. Schakel de microscoop en de computer in, start de software door te klikken op "Start systeem" en ga naar de modus "Acquisitie".
2. Tik op het vak 'Show manual tools'. In de "Laser" -menu schakel de twee-foton-laser aan en laat het opwarmen en stabiliseren.
3. Activeer tegelijkertijd "Kanaalmodus" en "Schakel elk frame in." Selecteer in het menu 'Lichtpad' de optie 'Niet Descanned' en 'Main Beam Splitter MBS 760+'. Tik op om de vier NDD's te activeren en de configuratie in te stellen, zoals afgebeeld in Figuur 3 .
   OPMERKING: Met deze configuratie wordt het collageensignaal van botstructuren (secOnd harmonische generatie, SHG) wordt verzameld bij 380 - 485 nm, FITC-hCD31 + menselijke endotheelcellen en AF488-hCD45 + humane hematopoietische cellen bij 500-550 nm en 655-VPA bij 640 - 690 nm.
4. Stel in het menu 'Kanalen' de 'laserlengte' in op 890 nm en de stroom tot 50%. Stel de "Gain (Master)" in op 500-600, de "Digital Offset" op 0 en de "Digital Gain" op 15 voor elk kanaal. Pas deze waarden aan zodra de aanschaf is gestart.
5. Stel in de 'Acquisition Mode' de vereiste parameters in om beelden met hoge resolutie te verkrijgen zonder het weefsel te beschadigen en de fluorophoren te bleken. Stel "Scan-modus" in op "Frame", "Frameformaat" naar "x512 y512," Line Step "tot 1," Speed ​​"tot 9," Gemiddeld getal "tot 8," Bitdiepte "naar" 8 Bit " Modus "naar" regel, "" richting "naar" bidirectioneel "en" methode "om" te betekenen ".
   1. Zet de "ZoOm "naar 1 voor de eerste scan van de afbeelding, en verhoog het indien nodig om op bepaalde gebieden te concentreren.
6. Plaats de plaat die het steiger op de microscoopstadium bevat onder de 20X, 1.0 NA waterdempingslens en laat de lens zakken tot het de zoutoplossing raakt. Zet de focus van de lens op de steiger met behulp van de microscoop-oculairen, met behulp van een lamp als de lichtbron.
7. Activeer het menu "Z-stack", selecteer de "First / Last" -functie en stel het gewenste interval in tussen twee achtereenvolgende segmenten ( bijvoorbeeld 2-μm Z-stack). Houd de intervallen constant in de Z-stapel.
8. Selecteer 'Live' om een ​​live scan van het monster te maken en pas de 'Digital Gain' en 'Digital Offset' aan voor een optimale belichting. Om tegelijkertijd meerdere kanalen te visualiseren, selecteert u de "Split" -functie.
9. In het "Stage" menu, in de modus "Live", scan de afbeelding en "Markeer" regio's van interEst (ROI), zoals de locatie van humane hematopoietische cellen en vasculaire structuren. Wanneer de scan van het monster is voltooid, ga dan naar de eerste ROI om afbeeldingen te starten.
10. Stel in de modus "Live" de boven- en onderkant van de 3D-Z-stack rondom het bezienswaardigheid in met behulp van de "Set first" en "Set last" functies. Zodra u klaar bent, zet u het centrum, "C." Begin de overname van de ROI met de knop "start experiment". Zie voorbeelden van afbeeldingen in figuur 4 , figuur 5 en figuur 6 .
11. Zodra de aankoop is voltooid, sla de afbeelding op in de aangewezen map. Ga naar de volgende ROI en herhaal stap 4.10. Zodra het experiment is voltooid, verwijder de afbeeldingsplaat uit de microscoop, verwijder het monster zorgvuldig uit de plaat en reinig eventuele resterende lijm.
12. Bereid het monster voor de volgende analyse techniek.

5. ProefprocesG voor Histologie en Immunostaining

OPMERKING: Monsters worden verwerkt volgens het protocol dat wordt beschreven in de algemene laboratoriumtechnieken van JoVE ^54, waarbij de monsterfixatie-, embedings- en sectieprocessen worden beschreven. Botvormende monsters dienen gedurende 7 dagen behandeld te worden in een EDAL-ontkalkingsmiddel tussen de fixatie- en embedingsprocessen. De blokkerende / permeabiliseringsoplossing is 10 mM PBS pH 7,4 buffer met 1% Triton X-100, 1% boviene serumalbumine (BSA) en 10% normaal geiten serum (NGS).

1. Leg de plakjes in xyleen gedurende 10 min), xyleen gedurende 5 min, 100% ethanol gedurende 5 minuten, 70% ethanol gedurende 5 minuten, 50% ethanol gedurende 5 minuten en _H2O gedurende 5 minuten.
2. Breng de plakken over op een citraat gebaseerde antigeen ontmaskende werkoplossing.
3. Kook de plakken gedurende 15 minuten en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur.
4. Was de plakjes in 10 mM PBS pH 7,4 oplossing met 1% Triton X-100 (5 min, 3 keer).
5. Verplaats de samPles aan de blokkerende / permeabiliseringsoplossing en incuberen gedurende 30 minuten.
6. Voeg primair antilichaam toe verdund in blokkerende / permeabiliseringsoplossing en incubeer overnacht bij 4 ° C.
7. Was de plakjes in 10 mM PBS pH 7,4 oplossing met 1% Triton X-100 (5 min, 3 keer).
8. Voeg secundair antilichaam verdund in blokkerende / permeabiliseringsoplossing gedurende 1 uur in het donker bij kamertemperatuur.
9. Was met H ₂ O (5 min, 3 keer).
10. Om de achtergrondfluorescentie te verminderen, dompel de plakjes in Soedan Black werkoplossing gedurende 10 minuten, in het donker en bij kamertemperatuur.
11. Was de plakjes in H ₂ O (5 min, 3 keer).
12. Monteer de plakjes met behulp van fluorescerend montagemedium met DAPI (0,5 μg / ml).
13. Bewaar de plakjes bij 4 ° C en controleer of het montagemedium droog is voordat u fluorescente beeldvorming uitvoert. Zie voorbeeldafbeeldingen in Figuur 7 .

Results

In figuur 1 worden representatieve afbeeldingen van de zaad- en implantatieprocessen van de steigercel getoond. Let op in figuur 1C dat cellen direct in de steiger worden ingespoten. In figuur 1G , let op dat er in de achterkant van de muis een snede is gemaakt, waar de subcutane zak wordt gecreëerd en de steiger wordt geïmplanteerd. Figuur 2 toont de bruto morfologie van verschillende steigers die in NSG muizen geïmplanteerd zijn en na 8 weken worden opgehaald. Let op de lichte vascularisatie in hMSC-zaadstaven ( Figuur 2A ). Het samenvoegen van menselijke EC's met hMSC's in de steiger maakt het mogelijk om meer relevante vasculatuur te vormen in steigers ( Figuur 2B ). Tenslotte veroorzaakt de aanwezigheid van rhBMP-2 botvorming. In deze zaak zijn de opgerichte steigers groter, en ze worden gevormd doorBotachtig hardweefsel.

Figuur 3 toont de configuratie van de kanaalconfiguratie op de microscoop voor livebeelden met NDD (details in de figuurlegenda). Figuur 4 en Video 1 tonen menselijke hematopoietische cellen in hMSC-gecoate steigers. Steigers werden 8 weken na implantatie geëxplanteerd en na de intraveneuze inenting van AF488-hCD45 antilichaam en 655-VPA. Deze procedure zorgt voor het visualiseren van geïmplanteerde humane hematopoietische cellen en de vasculaire structuur door twee-foton confocale microscopie. In dit geval tonen de beelden bloedvaten (655-VPA) in steigers en de langetermijngangering van humane hematopoietische cellen (AF488-hCD45) in het steigerparenchym. Figuur 5 en Video 2 komen overeen met menselijke steigers die met hECs en hMSCs worden gezaaid. 8 weken na de operatie werden steigers na de intraveneus geëxplanteerdOus inoculatie van FITC-hCD31 antilichaam en 655-VPA, en beelden werden verworven met een twee-foton confocale microscoop, zoals eerder vermeld. Afbeeldingen tonen de participatie van hEC's in de vorming van vaten in de steiger, wat resulteert in een murine-menselijke chimere vasculatuur.

Figuur 6A toont representatieve gegevens van de aanpak die wordt gebruikt om botvorming in MSC-steigers te stimuleren. In vergelijking met eerdere figuren, 8 weken na implantatie, werd de intraveneuze inoculatie van 655-VPA uitgevoerd, steigers werden opgehaald en beelden werden verkregen met twee-foton confocale microscopie. RhBMP-2-gestimuleerde steigers veroorzaken de vorming van botweefsel, die kan worden geconfronteerd door de SHG (cyan kleur in de beelden) die door het calcium in het bot wordt verstrekt. De afgebeelde afbeeldingen tonen ook de vorming van holtes en vascularized endosteal weefsel, die sterk lijken op het BM endostale weefsel. In figuur 6B en Video 3 werden hECs geïmplanteerd met hMSCs. Steigers werden opgehaald na de intraveneuze inoculatie van FITC-hCD31 antilichaam en 655-VPA, en twee-foton confocal microscopie beelden tonen de participatie van hEC's in de neovascularisatie in een botvormende steiger.

Figuur 7 toont representatieve beelden van histologie, een procedure die is uitgevoerd om eerder beschreven resultaten te bevestigen. Immunofluorescente beelden tonen muisvasculatuur, hECs, hMSCs en langdurig geïmplanteerde humane hematopoietische cellen in de steigerstructuren. Steigers die zijn opgehaald uit muizen werden vastgezet en gebruikt voor immunofluorescentie. In de rhBMP-2 drager botvormende steigers ( Figuur 7D- F ), let op de morfologie van het weefsel, die op rijp beenmerg lijkt met vetweefsel. In deze botvormende steiger tonen we dat hMSC's fibroblasten zijn, wat t zou aantonenHoed dragen zij bij tot nieuw gevormde weefsel als stromale cellen. We tonen ook menselijke adipocyte marker expressie, wat aangeeft dat hMSCs ook bijdragen aan de vorming van vetweefsel.

Figuur 1. Representatieve afbeeldingen van de cel-zaaizaad- en implantatieprocessen. A) Aanvankelijke steiger en zijn snijmethode met behulp van een scalpel. B) 24 stuks verkregen uit de eerste steiger. C) Steiger cel-zaaimethode met behulp van een spuit. D) Gezaagde steigers met kweekmedium, klaar om te worden geïmplanteerd. EF) Specifieke stappen voor botvormende steigers: E) Steiger wordt overgebracht naar een 96-putje u-bodemplaat en F) representatief beeld van de methode die wordt gebruikt om rhBMP2, trombine en fibrinogeen aan het steiger toe te voegen. GJ) Surgi Cal implantatie procedure onder algemene verdoving: G) wond gecreëerd in de huid en steiger implantatie, H) implantatie methode, en IJ) wond sluit procedure met behulp van chirurgische lijm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Verschillende steigers die van muizen worden opgehaald. Representatieve beelden van MSC steigers (links), MSC + EC steigers (midden), en MSC + EC + BMP steigers (rechts). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

4 / 55914fig3.jpg "/>
Afbeelding 3. Kanaalconfiguratie. De installatie van de microscoopfilter wordt weergegeven. A) Er zijn vier NDD detector modules: in de eerste module zijn er twee filterblokken; De tweede en derde module hebben elk een filterkubus; En de laatste module heeft geen kubus (niet gebruikt). De eerste fotomultiplierbuis (PMT) is bestemd voor het verre kanaal (640 - 690 nm), die de lagere golflengten weerspiegelt; De volgende zijn 380 - 485 nm, 500 - 550 nm en 555 - 625 nm (de volgorde is altijd van de lagere tot de hogere golflengten). B) De fluorofore emissies detecteerbaar met de bovenstaande configuraties (kleur gecodeerd). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. MSC Steiger S toestaan ​​voor de vorming van een niche voor humane hematopoietische cellen. A) en B) 3D reconstructies van Z-stapels, genomen na-explant, na intraveneuze inoculatie met AF488-hCD45 (groen), om humane hematopoietische cellen te etiketteren en 655-VPA (magenta) m om vasculatuur te labelen. Schaalstaven vertegenwoordigen 20 μm in A en B (bovenste panelen) en 5 μm in B (onderste panelen). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Video 1. MSC-steigers laten toe voor de vorming van een niche voor humane hematopoietische cellen . 3D reconstructie van humane hematopoietische cellen (AF488-hCD45) geassocieerd met de vasculatuur (655-VPA) in de MSC-steiger (collageenstructuren: SHG, cyaan). Elke stapel meet 140 x 140 μm.Ef = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video1.mov" target = "_ blank"> Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Figuur 5. Menselijke EC's nemen deel aan de vorming van menselijke schepen in MSC-steigers. 3D reconstructie van vasculatuur (655-VPA) gevoerd door EC's van menselijke oorsprong (FITC-hCD31) in MSC + EC steigers. Schaalstaven vertegenwoordigen 20 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Video 2. Menselijke EC's nemen deel aan de vorming van georganiseerde schepen in MSC-steigers. 3D reconstructie van menselijke EC's (FITC-hCD31) Sculature (655-VPA) in MSC + EC steigers. Elke stapel meet 240 x 240 μm. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Figuur 6. rhBMP-2 Carrier Steigers hebben botoppervlakken en geanualiseerde vasculatuur die vergelijkbaar zijn met de Beenmerg. A) 3D reconstructie van MSC + BMP steigers die de vorming van botstructuren (SHG-cyaan) en vasculatuur (655-VPA) tonen. Schaalstaven vertegenwoordigen 100 μm (links), 70 μm (midden) en 50 μm (rechts). B) 3D reconstructie van MSC + EC + BMP steigers die gehumaniseerde vaten tonen (655-VPA) gevoerd met menselijke ECs (FITC-hCD31). Schaalstaven vertegenwoordigen 50 μm (links) en 30 μm (midden en rechts).14 / 55914fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

Video 3. rhBMP-2 Carrier Steigers hebben botoppervlakken en geanualiseerde vasculatuur die vergelijkbaar is met de Beenmerg. 3D reconstructie van MSC + VERA + BMP steiger (bot: SHG; schepen: 655-VPA; menselijke ECs: FITC-hCD31). Elke stapel meet 600 x 600 μm. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Figuur 7. Representatieve beelden van immunofluorescentie uitgevoerd op vaste steigers. AF) Immunofluorescentie studies uitgevoerd om menselijke cellen geïmplanteerde i te lokaliserenN steigers. AC) Steigers geïmplanteerd met hECs, hMSCs en hHSCs. DF) Botvormende steigers geïmplanteerd met hECs, hMSCs en hHSCs. De kleurkanalen zijn als volgt: AD) menselijke EC (hCD31) en muisvasculaire structuur (endomucine, ENDOM), BE) hMSCs (hVimentin, hVIM) en muisvasculaire cellen (endomucine, ENDOM), C) humane hematopoietische cellen (hCD45) En muisvasculatuur (endomucine, ENDOM) en F) humane adipodifferentiatie-gerelateerde eiwitten (hADRP) en muisvasculatuur (endomucine, ENDOM). Schaalstaven vertegenwoordigen 10 μm (A en C), 20 μm (B en E) en 40 (D en F) μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Betekenis met betrekking tot bestaande methoden:

In dit protocol beschreef we een methode om verschillende gehumaniseerde microomgevingen in muizen te genereren en hun architectuur te visualiseren via twee-foton microscopie en histologie. De verstrekte representatieve gegevens tonen de haalbaarheid van de aanpak aan, met behulp van verschillende stromacellen om geanimeerde weefsels te manipuleren. Het protocol heeft specifieke toepassingen op de studie van humane hematopoietische cellen en nicotine-afkomstig van beenmerg in normale en pathologische omstandigheden. Deze toepassingen omvatten de studie van klonale evolutie, drugscreening en kruisvorming tussen menselijke HSC's en stromale componenten. In het opkomende gebied van weefseltechniek zijn verschillende alternatieve benaderingen voorgesteld. Benaderingen omvatten de ontwikkeling van 3D humanized BM structuren in vitro ^{55 , 56 , 57 ,}S = "xref"> 58 ^{, 59 , 60 , 61 , 62 , 63} en het orthotopische transplantaat van gehumaniseerde BM-steigers in muizen ⁶⁴ . Onze aanpak heeft het voordeel om zowel de complexiteit van het in vivo systeem te combineren met de makkelijke anatomische toegankelijkheid van het gehumaniseerde weefseltransplantaat.

Wijzigingen en probleemoplossing:

Een bron van variabiliteit in dit protocol kan worden gevonden in de selectie van cellen die gebruikt worden om de steigers te zaaien. In ons werk hebben we BM-afgeleide hMSC's gebruikt. Mesenchymale cellen kunnen echter worden verkregen uit verschillende weefsels, die onderscheidende eigenschappen kunnen tonen afhankelijk van de oorsprong. Daarom kan het gebruik van hMSC's afgeleid van verschillende organen overwogen worden. Echter, hun vermogen om botweefsel in vivo te vormen moet worden getest voor gebruik in deze pRotocol. Dit protocol gebruikt een commercieel beschikbare menselijke endotheelcelbron ( dwz E4ORF1-getransduceerde HUVEC). Onlangs is het gebruik van orgaanspecifieke endotheelcellen voor verschillende doeleinden gerapporteerd ^{65 , 66} . Bovendien kan het gebruik van primaire hEC's afgeleid van de BM een interessante verbetering voor het protocol vertegenwoordigen. Daarom kan het gebruik van verschillende bronnen van endotheelcellen verschillende in vivo uitkomsten produceren.

We hebben NSG-immunocompromised recipient muizen gebruikt om de implantatie van gehumaniseerde steigers te bevorderen en weefselafwijzing te vermijden. Wij uitsluiten niet de mogelijkheid om dit protocol te gebruiken om ectopische beenmergweefsels te manipuleren in andere muisstammen. Inderdaad kan rhBMP-2 botvorming in verschillende zoogdiermodellen ^{47 , 48 , 49 , 50} induceren ^{, 52 . Echter, verschillen in cellevendabiliteit en langetermijntransplantatie zullen waarschijnlijk worden waargenomen met behulp van verschillende stammen / modellen.}

De timing van het herstel van de steiger kan ook flexibel zijn, afhankelijk van het uiteindelijke doel van het experiment. In het gepresenteerde protocol herstellen we de monsters op 8-12 weken na implantatie om de langdurige hematopoietische ingreep te beoordelen. Om vroege stappen van de menselijke BM nicheformatie te bestuderen ( bijv. Osteochondrale weefselvorming ⁴⁷ of vaatontwikkeling), kunnen verschillende tijdspunten worden gekozen.

De live-imaging techniek die we beschreven in dit protocol zijn aangegeven voor korte termijn beeldvorming van explants. Het gebruik van een evenwichtige kamer voor het behoud van fysiologische temperatuur, zuurstofspanning en CO ₂ concentratie dient in aanmerking te worden genomen bij langdurige beeldvorming, zoals het bestuderen van motiliteitsgedrag.

Critical StEps in het protocol:

Onder de uitdagingen die verband houden met het protocol, wijzen we op de technische vaardigheden die nodig zijn voor een aantal stappen. Mesenchymale en endotheelcellen dienen gebruikt te worden bij cijfers met lage celpassages; anders is, zullen ze niet in staat zijn om de menselijke hematopoietische cellen engraftment te ondersteunen in vivo of deel te nemen aan de novo vaatstelsel en botvorming in vivo. Wij raden aan het gebruik van hMSC's en hEC's in de passages 1 - 5. Voorbereiding van de steiger en de zaadcellen hebben basiscellencultuurvaardigheden en kennis van de eigenschappen van de specifieke cellen die in de procedure worden gebruikt. Het operatieprotocol is vrij eenvoudig maar vereist een beetje oefening. Onderhoud van een aseptische omgeving om verontreiniging van de geïmplanteerde steigers in immunodeficiënte muizen te vermijden is cruciaal om het succes van het experiment te waarborgen. Voorbeeld explant en live imaging vereisen chirurgische praktijk (vooral voor het gebruik van de microdrill) en kennis van deMicroscoop systeem. Tenslotte vereisen steekproefverwerking en histologie basiskennis van de te gebruiken technieken.

Beperkingen van de techniek:

De aanpak die we beschrijven maakt het mogelijk visualisatie van levende humane hematopoietische cellen die een gehumaniseerd beenmergmilieuomgeving bevinden, waarbij menselijke endotheelcellen die vasculaire structuren vormen en mesenchymale cellen vormen bot- / beenmergruimte. Aangezien het weefsel in vivo wordt gevormd, zal de uiteindelijke constructie nog steeds chimère zijn (menselijk en muizen). Dit probleem moet in aanmerking worden genomen, omdat het chimere weefsel de complexiteit en het milieu van menselijk beenmerg niet volledig kan nabootsen.

De geïmplanteerde steigers hebben een beperkte grootte (we hebben een maximum van 6,6 x 7,5 x 7 mm geprobeerd) en kunnen daarom een ​​beperkt aantal cellen voor xenotransplantatie hosten. Het absolute aantal herstelde cellen zal ook beperkt zijn; Dus moet het aantal geïmplanteerde steigersBerekend als een functie van het aantal cellen dat nodig is voor het experiment.

De afbeeldingsapplicatie die we hebben beschreven is bijzonder nuttig voor het observeren van grote gebieden levend weefsel op dieptes van 150-200 μm van het oppervlak zonder de architectuur te beschadigen en de cellen te beschadigen. Daarom staat het niet voor de visualisatie van de gehele steiger mogelijk. Als een volledige scan van het weefsel nodig is, zouden standaard immunofluorescentiebenaderingen meer geschikt zijn.

Toekomstige Toepassingen:

De toekomstige richting van dit bioengineered model zou zijn om de complexiteit van de menselijke componenten in het weefsel te verhogen. De kennis en karakterisering van de menselijke BM niche is in de afgelopen jaren gevorderd ⁶⁷ en het beschreven protocol kan een interessant platform zijn om de functie van deze nieuwe cellulaire componenten en oplosbare factoren te bestuderen, evenals hun rol bij het ondersteunen van normale / maligneMier HSCs.

Bovendien biedt de beeldvormingstechniek het potentieel voor intravitale beeldvorming van de steigers in longitudinale studies, die technische verbeteringen vereisen bij het imago van de steigers in levende, verdoofde muizen, met herstel na de operatie. Deze aanpak zou aanvullende stappen vereisen en is momenteel onderzocht in het laboratorium.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque	Ge Healthcare	17-1440-03
Cd34 positive selection Kit	Stemcell	18056	Store a 4°C.
Magnet	Stemcell	18000
Anti-human CD3 antibody, clone OKT-3	Bioxcell	BE0001-2	Store at 4°C. Used for T cell depletion in primary AML samples.
Cytokines (IL3, G-CSF, and TPO)	PeproTech	200-03, 300-23 and 300-18	For doing the stock: Dilute each one of the cytokines in 100 μL of water and mix them. Add 200 μL, do alicuots of 45 μL and Store at -20 °C.
DMSO	Sigma	D4540
FBS	Life technologies	10270106	Heat-inactivate at 56 °C during 30 min, do aliquots and freeze down. Warm in 37 °C water bath before use.
MEM-α	Invitrogen	32571-028	Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
Myelocult H5100	corning	5100	Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
199	Gibco	41150-020	Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
hMSC-FBS, Heat-inactivated	Gibco	12662-029	Store at -20 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
P/S	Sigma-Aldrich	P0781	Store at -20 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
ECGS	Millipore	02-102	Dilute in culture media and use 0.22 mm filter.
HEPES	Sigma-Aldrich	S1558-50ML	Store at 4 °C.
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149	Store at 4 °C.
Glutamine	Gibco	25030	Store at -20 °C.
Collagen 1 coated cell culture plate	corning	354505
Trypsin-EDTA solution	Thermo-Fisher	25200056	Store at -20 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
hMSC	Lonza	PT-2501	Alternatively, hMSCs we also kindly provided by Dr. Dosquet (University Paris Diderot, Paris) from human bone marrow obtained during orthopaedic surgery under ethical approval 10-038 from IRB00006477.
VeraVec HUVEC endothelial cells	Angiocrine bioscience	hVera101	Alternatively, other human endothelial cell source may be used.
Human hematopoietic cells			Umbilical Cord blood or primary Acute Myeloid Leukemia (AML) samples were obtained from the Royal London Hospital (London, UK) after informed consent and protocol of use was approved by the East London Ethical Committee and carried out in accordance with the Declaration of Helsinki.
Gelfoam, Size 12 - 7mm	Pfizer	00009-0315-08	Alternative supplier: Febelco
PBS	Thermo-Fisher	10010023
Surgical material	Multiple		Sterile forceps, tweezers and sharp scissors.
Sterile tissues			Heat-sterilize paper tissues.
1 mL Syringe with needle of 25G	Terumo	SS+01H25161
Ultra Low Attachment Multiple Well Plates	Corning	3473 or 3471
BMP2	Noricum	rhBMP-2	Dilute at 5 mg/mL in acetic acid 50 mM and store at 4 °C.
Thrombin	Sigma	T8885	Dilute in CaCl2 2%, 500 mL per vial, and store at 4 °C.
Fibrinogen	Sigma	F3879	Dilute at 4 mg/100 mL in PBS. Store at -20 °C. Warm before use.
Tissue-culture dishes 35 mm x 10 mm	Falcon	353001
U-Botton 96 well plate	Falcon	353077
NSG mice	The Jackson Laboratory	5557	NSG mice were a kind gift from Dr Leonard Shultz (The Jackson Laboratory).
Chlorhexidine	G9		Dilute 1:10 before use
Carprofen	Pfizer	Rimadyl	5 mg/kg of mouse
Buprenorphine	Alstoe	Vetergesic	0.1 mg/kg of mouse body weight
Isoflurane	Abbott	B506	Induction of anaesthesia 2%, maintenance 1%
Trimmer	Wella	Contura HS61
Surgical glue	3M	Vetbond
carbomer (polyacrylic acid) as Ophthalmic gel	Novartis	Viscotears Liquid Gel
Human Normal Immunoglobulin	Gammaplex	10g vial	100 mL/mouse intravenously, 30 min before infusion of specific antibody.
NT-QTracker	Invitrogen	Q21021MP	Vessel-pooling agent. Administrate 15 mL/mouse intravenously 5 min before imaging.
AF488-hCD45	Biolegend	304017	100 mL/mouse intravenously, 30 min before imaging.
FITC-hCD31	BD Pharmigen	555445	100 mL/mouse intravenously, 30 min before imaging.
Super glue	Loctite	Super Glue
Micro-Drill Kit	IDEAL - Fisher Scientific	NC9010016
Microsurgical microscope			No specific brand/company is adviced.
LSM 710 NLO	Zeiss		Upright confocal microscope with motorized stage, two-photon laser and 20X 1.0 NA water immersion lens. Alternatively, a microscope with similar specifications could be used.
MaiTai “High Performance” fully automated 1-box 517 mode-locked Ti:Sapphire laser with DeepSee dispersion compensation	Spectra-Physics
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Ethanol	Sigma-Aldrich	32294
Osteosoft	Millipore	1.01728.1000
Polysine slices	Thermo scientific	J2800AMNZ
Antigen unmasking solution	Vector	H-3300	Store at 4 °C. Dilute 1:100 in H2O for working solution.
Triton 100x	Sigma-Aldrich	T9284
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A96470	Store at 4 °C.
Normal Goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	Store at 4 °C.
Endomucin Antibody	Santa Cruz	sc-65495	Store at 4 °C.
hVimentin antibody	Santa Cruz	sc-6260	Store at 4 °C.
hCD31 antibody	DAKO	M0823	Store at 4 °C.
hCD45 antibody	DAKO	M0701	Store at 4 °C.
ADRP (Perilipin2)	antibodies-online	ABIN283918	Store at 4 °C.
Goat anti mouse secondary antibodies	Invitrogen	A11029 or A11005	Store at 4 °C.
Goat anti Rabbit secondary antibodies	Invitrogen	A11037 or A11008	Store at 4 °C.
Goat anti Rat secondary antibodies	Invitrogen	A11007 or A21247	Store at 4 °C.
Sudan Black	Sigma	S2380	Prepare a stock of 1% sudan black in ethanol 70%. Store at RT. Prepare working solution of 0.1% sudan black in ethanol 70% and filter using filter-paper before use.
DAPI	Sigma	D8417	Prepare stock in H20 at 100 mg/mg. Store at 4 °C.
Fluorescent mounting media	Dako	S3023	Add DAPI before use (1:400 from DAPI stock).
Cover glass	VWR	631-0147