Methodenartikel

Retrovirale Scanning: Mapping MLV Integration Sites om de specifieke codespecifieke regio's te definiëren

7.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55919

⸱

28 mei 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Genome Research, Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia, 2Laboratory of Chromatin and Gene Regulation During Development, Imagine Institute, 3Institute for Biomedical Technologies, CNR, 4Généthon, 5Sorbonne Paris Cité - Université Paris Descartes

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol voor de genoom-brede mapping van de integratie-sites van Moloney-muizen-leukemie-virus-gebaseerde retrovirale vectoren in menselijke cellen.

Samenvatting

Moloney muizen leukemie (MLV) -virus gebaseerde retrovirale vectoren integreren overwegend in geacyleerde versterkers en promoters. Om deze reden kunnen mLV-integratieplaatsen worden gebruikt als functionele markers van actieve regulerende elementen. Hier presenteren wij een retrovirale scan tool, waarmee de genoom-breed identificatie van celspecifieke enhancers en promotors mogelijk is. In het kort wordt de doelcellenpopulatie getransduceerd met een mLV-afgeleide vector en genomisch DNA wordt verteerd met een frequent snijbeperkingsenzym. Na ligatie van genomische fragmenten met een compatibele DNA-linker maakt linker-gemedieerde polymerase kettingreactie (LM-PCR) de amplificatie van de virus-gastheer-genoomverbindingen mogelijk. Massieve sequentiebepaling van de ampliconen wordt gebruikt om het mLV integratieprofiel genoom breed te definiëren. Tenslotte worden clusters van terugkerende integraties gedefinieerd om celspecifieke regulerende gebieden te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de activatie van specifieke transcriptieprogramma's van de celtype.

bijv. Somatische stamcellen) die robuuste markers voor toekomstige isolatie hebben.

Inleiding

Celidentiteit wordt bepaald door de expressie van specifieke sets genen. De rol van cis-regulerende elementen, zoals promotors en enhancers, is van cruciaal belang voor de activatie van specifieke transcriptieprogramma's van de celtype. Deze regulerende gebieden worden gekenmerkt door specifieke chromatinfuncties, zoals eigenaardige histon-modificaties, transcriptiefactoren en co-factoren binding, en chromatin toegankelijkheid, die veel gebruikt zijn voor hun genoom-brede identificatie in verscheidene celtypes 1 , 2 , 3 . In het bijzonder wordt het genoom-breed profiel van acetylering van histon H3-lysine 27 (H3K27ac) algemeen gebruikt om actieve promoters, versterkers en superversterkers 4 , 5 , 6 te definiëren.

Moloney muizen leukemie virus (MLV) is een gamma-retrovirus dat algemeen gebruikt wordt voor genenOverdracht in zoogdiercellen. Na het infecteren van een doelcel, wordt het retrovirale RNA-genoom getranscribeerd in een dubbelstrengs DNA-molecuul dat virale en cellulaire eiwitten bindt om het pre-integratiecomplex (PIC) te assembleren. De PIC komt in de kern en bindt de gastheercelchromatine. Hier bemiddelt de virale integrase, een belangrijke PIC component, de integratie van het provirale DNA in het gastheer-genoom. MLV-integratie in het genomische DNA is niet willekeurig, maar komt in actieve cis-regulerende elementen, zoals promoters en versterkers, op een celspecifieke wijze 7 , 8 , 9 , 10 voor . Dit eigenaardige integratieprofiel wordt gemedieerd door een directe interactie tussen de mLV integrase en de cellulaire bromodomain en extraterminale domein (BET) eiwitten 11 , 12 , 13 . BET eiwitten (BRD2, BRD3 enBRD4) fungeren als een brug tussen gastheerchromatine en mLV PIC: door hun bromomaten herkennen zij sterk geacyleerde cis-regulerende gebieden, terwijl het extraterminale domein interactieert met de mLV integrase 11 , 12 , 13 .

Hier beschrijven we het retrovirale scannen, een nieuw gereedschap om actieve cis-regulerende gebieden te lokaliseren op basis van de integratie eigenschappen van mLV. In het kort worden cellen getransduceerd met mLV-afgeleide retrovirale vector die het verbeterde groene fluorescerende eiwit (eGFP) reportergen tot expressie brengt. Na de genomische DNA-extractie worden de kruisingen tussen de 3'-lange terminale herhaling (LTR) van de mlV-vector en het genomische DNA geamplificeerd door linker gemedieerde PCR (LM-PCR) en massief opeenvolgend. MLV-integratieplaatsen worden toegewezen aan het menselijk genoom en genomische gebieden die sterk gerangschikt zijn door mLV worden gedefinieerd als clusters van mLV-integratieplaatsen.

Retrovirale scanNing werd gebruikt om celspecifieke actieve regulerende elementen in verschillende menselijke primaire cellen 14 , 15 te definiëren. MLV clusters co-mapped met epigenetisch gedefinieerde promoters en enhancers, waarvan de meeste actieve histonenmerken, zoals H3K27ac, bevatten en cellspecifiek waren. Retrovirale scanning laat de genoombrede identificatie van DNA regulatorische elementen toe in prospectief gezuiverde celpopulaties 7 , 14 , evenals in retrospectief gedefinieerde celpopulaties, zoals keratinocytstamcellen, die geen effectieve markers voor toekomstige isolatie hebben 15 .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. MLV-transductie van menselijke cellen

  1. Isolatie doelcellen en transduceer ze met een mLV-afgeleide retrovirale vector die het eGFP reportergen bevat en pseudotypeert met Vesicular Stomatitis Virus G (VSV-G) of het amphotropische envelopglycoproteïne 16 .
    1. Bewaar mock-transduced cellen als negatieve controle voor de volgende analyses. Aangezien mLV-gebaseerde retrovirale vectoren effectieve verdeling van cellen kunnen transduceren, kweek de doelcellenpopulatie in omstandigheden die celverdeling stimuleren. Transductie condities moeten specifiek worden geoptimaliseerd voor elk celtype dat onderzocht wordt. Celgroei en transductietoestanden voor humane hematopoietische stamcellen, T-cellen en epidermale cellen zijn beschreven in Referenties 7, 14, 15 en 17.
  2. 48 uur na transductie, 100.000 cellen resuspenderen in 300 μl fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) die 2% foetaal runder serum bevat en eGFP expressie meten fLage cytometrische analyse (488 nm excitatie laser). Gebruik mock-transduced cellen als negatieve controle. Voor optimale integratie site retrieval, zuiver GFP + cellen door Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).
  3. Verzamel 0,5 tot 5 miljoen cellen voor genomische DNA-bereiding. Een langere cultuurperiode (> 7 dagen) heeft de voorkeur om het niet geïntegreerde provirus te verdunnen en noodzakelijk bij het analyseren van de langetermijn nakomelingen van bona fide stamcellen (zie discussie sectie en referentie 15 ). De celpellets kunnen worden gesneden en opgeslagen bij -80 ° C tot aan het gebruik.

2. Versterking van mLV-integratieplaatsen door linker-gemedieerde PCR (LM-PCR)

  1. Bereiding van genomisch DNA (gDNA)
    1. Extract gDNA met behulp van een kolom gebaseerde DNA extractie kit en volg het protocol voor gekweekte cellen, volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Restrictie enzym digestiop
    1. Stel 4 restrictie-enzymverdichten per monster in 1,5 ml buizen op. Digest 0,1 tot 1 μg gDNA in elke buis door 1 μL Tru9I (10U) en 1 μl buffer M in een eindvolume van 10 μl toe te voegen. Incubeer de reacties bij 65 ° C gedurende 6 uur of 's nachts.
    2. Voeg bij elke reactie 1 μL PstI (10U), 1 μl buffer H en 8 μl water toe. Incubeer de reacties bij 37 ° C gedurende 6 uur of 's nachts. Monsters kunnen bij -20 ° C opgeslagen worden tot het gebruik.
  3. Linker ligatie
    1. Bereid een 100 μM Tru9I linker voorraadoplossing in een 1,5 ml buis door de linker plus streng en linker minus strand oligonucleotiden bij een 100 μM concentratie te mengen. Zet de buis in een water ingesteld op 100 ° C en laat het afkoelen bij kamertemperatuur. Tru9I linker voorraadoplossing kan bij -20 ° C tot gebruik worden opgeslagen.
    2. Stel 8 linkerligatie reacties op in 1,5 ml buizen. Voeg bij elke reactie het volgende bestanddeel toeS tot 10 μL restrictie-enzymvertering: 1,4 μl 10X T4 DNA-ligase-reactiebuffer, 1 μl 10 μM linker Tru9I, 1 μL (2000U) T4 DNA-ligase en 0,6 μl water. Incubeer bij 16 ° C gedurende 3 tot 6 uur. Monsters kunnen bij -20 ° C opgeslagen worden tot het gebruik.
  4. Eerste PCR
    1. Stel 48 PCR reacties op (6 reacties van elke ligatiebuis) in 0,2 ml buizen. Voor elke PCR voeg de volgende reagentia toe aan 2 μl ligeringsreactie: 5 μl 10X PCR buffer, 2 μl 50 mM magnesiumsulfaat, 1 μl 10 mM deoxynucleotide (dNTP) Mix, 1 μl 10 μM linker primer, 1 ΜL 10 μM mLV-3 'LTR primer, 0,3 μL (1,5U) Taq DNA Polymerase en 37,7 μl water. Primersequenties worden weergegeven in Tabel 1.
    2. Voer PCR-reactie uit in een thermische cyclus met verwarmd deksel, als volgt: 95 ° C gedurende 2 minuten; 25 cycli van 95 ° C gedurende 15 s, 55 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 1 min; 72 °; C voor 5 minuten; Vasthouden bij 4 ° C. Monsters kunnen bij -20 ° C opgeslagen worden tot het gebruik.
  5. Tweede PCR
    1. Stel 48 PCR reacties (1 uit elke "eerste PCR" buis) in 0,2 ml buizen op. Voor elke PCR, voeg de volgende componenten toe aan 2 μL van de eerste PCR-reactie: 5 μl 10X PCR buffer, 2 μL 50 mM magnesiumsulfaat, 1 μl 10 mM dNTP Mix, 1 μl 10 μM linker geneste primer, 1 ΜL 10 μM mLV-3 'LTR geneste primer, 0,3 μl Taq DNA Polymerase (1,5 U) en 37,7 μl water. Gebruik geneste primers die zijn ontworpen voor de specifieke massieve sequencing strategie gekozen: (i) linker geneste primer en mLV-3 'LTR geneste primer compatibel met Illumina platform; (Ii) linker geneste primer en mLV-3 'LTR geneste primer compatibel met Roche platform. Primersequenties staan ​​vermeld in Tabel 1 .
    2. Voer PCR-reactie uit in een thermische cyclus met verwarmd deksel, als volgt: 95 ° C gedurende 2 minuten; 25Cycli van 95 ° C gedurende 15 s, 58 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 1 min; 72 ° C gedurende 5 minuten; Vasthouden bij 4 ° C. Monsters kunnen bij -20 ° C opgeslagen worden tot het gebruik.
    3. Pool de 48 geneste PCR-reacties in een 15 ml buis (eindvolume van 2,4 ml). Monsters kunnen bij -20 ° C opgeslagen worden tot het gebruik.
  6. Bepaal de aanwezigheid en de grootte van de LM-PCR producten door agarosegel elektroforese.
    1. Voeg 4 μL Loadbuffer toe aan 20 μL LM-PCR producten en laad het monster op een 1% agarosegel, samen met een 100 bp DNA ladder. Loop de gel bij 5 V / cm gedurende 30 tot 60 minuten en visualiseer de PCR-producten door ethidiumbromide-kleuring.
    2. Voer een LM-PCR-reactie uit van het mock-getransduceerde monster als negatieve controle.
  7. Precipiteer de ampliconen door 0,1 volumes natriumacetaatoplossing (3 M, pH 5,2) en 2,5 volumes 100% ethanol toe te voegen. Meng en vries bij -80 ° C gedurende 20 minuten.
    1. Spin at fuLl gedurende 20 minuten in een standaard microcentrifuge bij 4 ° C versnellen. Gooi de supernatant weg en doe de pellet met 70% ethanol. Spin bij volle snelheid in een standaard microcentrifuge bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
    2. Gooi de supernatant weg en laat de pellet drogen. Voeg 200 μl water van PCR-gehalte toe en vul het DNA opnieuw op. Monsters kunnen bij -20 ° C opgeslagen worden tot het gebruik.
  8. Voeg 20 μL laadbuffer toe aan 100 μl van de LM-PCR producten en laad het monster op een 1% agarosegel, samen met een 100 bp DNA ladder.
    1. Loop de gel bij 5 V / cm gedurende 30 tot 60 minuten en snijd het gedeelte van de gel met 150 tot 500 bp-lange ampliconen.
    2. Reinig de LM-PCR producten met een kolom gebaseerde gel extractie kit en meet de concentratie met behulp van een UV spectrofotometer.
  9. Gebruik 1 μL bibliotheek om de lengte van de LM-PCR producten te evalueren met behulp van een bioanalysator, volgens de instructies van de fabrikant.
  10. Shotgun kloning van ampliconen
    1. Gebruik 20 ng van de gezuiverde LM-PCR-producten en kloneer ze in de pCR2.1-TOPO-vector volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Volg sequentieringsreacties met behulp van de M13 Universal Primer, gevolgd door genomische mapping van de resulterende sequenties, om de aanwezigheid van de virale-genoomverbindingen (inclusief de mLV-3 'LTR geneste primer) in> 50% van de klonen te onthullen om passende monsters te identificeren Voor massale sequencing. Voorbeeld van een virale-genoomverbinding:
      figure-protocol-1
      MLV-3 'LTR geneste primer 454 en linker geneste primer 454 ( tabel 1 ) zijn vetgedrukt en het 3'-uiteinde van de virale LTR cursief. De menselijke genomische sequentie is gemarkeerd in rode tekst (chr10: 6439408-6439509, hg19).

3. Massieve sequencing van mLV Integration Sites

OPMERKING: LM-PCR prodUcts kunnen op basis van commerciele platforms worden gesorteerd (het juiste geneste primerpaar selecteren in de tweede PCR-reactie, zie paragraaf 2.5.1). Voor sequencing door Roche GS-FLX pyrosequencing platform, verwijzen wij u naar de vorige documenten 7 , 14 , 15 . In dit gedeelte wordt een nieuw geoptimaliseerd protocol voor Illumina sequencing platform beschreven.

  1. Bibliotheekvoorbereiding
    1. Stel 1 indexering PCR-reactie per monster in 0,2 ml buizen op. Voor elke PCR, voeg de volgende reagentia toe aan 5 μL (150-170 ng) gezuiverd LM-PCR product: 5 μL Index Primer 1, 5 μL Index Primer 2, 25 μL 2X Master Mix en 10 μl PCR- Kwaliteit water. Gebruik een andere indexcombinatie voor elk monster.
    2. Voer PCR-reacties uit in een thermische cyclus met verwarmd deksel, als volgt: 95 ° C gedurende 3 minuten; 8 cycli van 95 ° C gedurende 30 s, 55 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 30 s; 72 ° C gedurende 5 min; Vasthouden bij 4 ° C.
    3. De PCR-producten zuiveren met behulp van een solid-phase reversibel immobilisatie (SPRI) kraalisolatieprotocol: Voeg in nieuwe 1,5 ml buizen 56 μL kralen aan elk monster toe en volg de instructies van de fabrikant. Oplossen in 25 μl Tris-HCl 10 mM. Bibliotheken kunnen bij -20 ° C worden opgeslagen tot aan het gebruik.
  2. Bibliotheekcontrole
    1. Gebruik 1 μL monster om de bibliotheekgrootte te beoordelen met behulp van een bioanalysator.
    2. Gebruik 1 μL monster om de bibliotheekmolariteit te kwantificeren met behulp van een fluorescentie gebaseerde Real-Time PCR-analyse volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Bibliotheekverdunning en sequencing
    1. Verdun bibliotheken naar 10 nM met behulp van Tris-HCl 10 mM. Voor het bundelen van bibliotheken overbrengt 5 μL van elke verdunde bibliotheek naar een nieuwe 1,5 ml buis en verdund het pool vervolgens tot 4 nM in Tris-HCl 10 mM.
    2. Meng 5 μl verdund zwembad met 5 μL 0,2 N NaOH in een nieuwe 1,5 mL buis, vortex kort, draai-down en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de bibliotheken te denatureren.
    3. Zet buizen op ijs en voeg 990 μL voorgekoelde hybridisatiebuffer (HT1) toe. Aliquot 300 μL gedenatureerde pool in een nieuwe 1,5 ml buis en voeg 300 μl voorafgekoelde HT1 toe om een ​​10 pM eindbibliotheek zwembad te verkrijgen.
    4. Gelijktijdig meng 2 μL PhiX controle bibliotheek (10 nM) met 3 μl Tris-HCl 10 mM in een 1,5 ml buis. Voeg 5 μL NaOH 0,2 N, vortex kort, spin-down en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de verdunde PhiX te denatureren. Doe de buis op ijs en voeg 990 μL voorgekoelde HT1 toe.
    5. Aliquot 300 μL gedenatureerde PhiX in een nieuwe 1,5 ml buis en voeg 300 μl voorafgekoelde HT1 toe om een ​​10 pM uiteindelijke PhiX te verkrijgen.
    6. In een nieuwe 1,5 ml buis mengen 510 μL gedenatureerde bibliotheekpool met 90 μl gedenatureerde PhiX-bibliotheek, waardoor een laatste 10 pM pool met 15% PhiX-controle wordt verkregen.
    7. Pipetteer deze 600 μL monsterVolume in het laadproefreservoir van de ontdooide sequentie-reagentcartridge en ga onmiddellijk door om een ​​lopende 150-cyclus uit te voeren.
      OPMERKING: De kritische reagentia en primersequenties die nodig zijn voor dit protocol zijn vermeld in tabel 1 .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Werkstroom van de retrovirale scanprocedure

De werkstroom van retrovirale scanprocedure is in figuur 1 geschetst. De doelcellenpopulatie wordt gezuiverd en getransduceerd met een mLV-afgeleide retrovirale vector die een eGFP-reportergen uitmaakt. Het transgen wordt geflankeerd door de twee identieke lange terminale herhalingen (5 'en 3' LTR), waardoor synthese, omgekeerde transcriptie en inte...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier hebben we een protocol beschreven voor genoom-wide mapping van de integratie sites van mLV, een retrovirus dat zich richt op chromatinegebieden, epigenetisch gemarkeerd als actieve promotors en enhancers. Kritieke stappen en / of beperkingen van het protocol omvatten: (i) mLV transductie van de doelcellenpopulatie; (Ii) amplificatie van virus-gastheer kruisingen door LM-PCR; (Iii) het ophalen van een hoge fractie integratieplaatsen. MLV-gebaseerde retrovirale vectoren transduceren delende cellen efficiënt. De lage ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Europese Onderzoeksraad (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), het Italiaanse Ministerie van Onderwijs, Universiteiten en Onderzoek (FIRB-Futuro in Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), het Italiaanse Ministerie van Volksgezondheid (Young Researchers Call 2011 GR-2011-02352026) en de Stichting Imagine Institute (Parijs, Frankrijk).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PBS, pH 7.4ThermoScientific10010031of gelijkwaardig
Fetal Bovine SerumThermoScientific16000044of gelijkwaardig
0.2 ml tubesalgemene lableverancier
1.5 ml tubesalgemene lableverancier
QIAGEN QIAmp DNA mini Kit QIAGEN51306of gelijkwaardig
T4 DNA ligase New England BioLabsM0202T
T4 DNA Ligase Reactie bufferNew England BioLabsM0202T
Linker Plus Strand oligonucleotidealgemene lableverancier5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’  (zuivering graad: SDS-PAGE)
Linker Minus Strand oligonucleotidealgemene lableverancier5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (zuivering graad: SDS-PAGE)
Tru9IRoche-Sigma-Aldrich11464825001
SuRE/Cut Buffer MRoche-Sigma-Aldrich11417983001
PstI Roche-Sigma-Aldrich10798991001
SuRE/Cut Buffer HRoche-Sigma-Aldrich11417991001
Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity Invitrogen11304011
10 mM dNTP MixInvitrogen18427013of gelijkwaardig
PCR grade wateralgemene lableverancier
96-well thermal cycler (met verwarmd deksel)algemene lableverancier
linker primeralgemene lableverancier5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (zuivering graad: PCR graad)
MLV-3’ LTR primeralgemene lableverancier5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (zuivering graad: PCR graad)
linker nested primer 454algemene lableverancier5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](zuivering graad: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer 454algemene lableverancier5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](zuivering graad: SDS-PAGE)
linker nested primer Illuminaalgemene lableverancier5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](zuivering graad: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer Illuminaalgemene lableverancier5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](zuivering graad: SDS-PAGE)
Natriumacetaatoplossing (3M) pH 5.2algemene lableverancier
Ethanol (absoluut) voor moleculaire biologieSigma-AldrichE7023of gelijkwaardig
Topo TA Cloning kit (met pCR2.1-TOPO vector)InvitrogenK4500-01
QIAquick Gel Extraction kitQIAGEN28704
AgaroseSigma-AldrichA9539of gelijkwaardig
Ethidiumbromide Sigma-AldrichE1510of gelijkwaardig
100 bp DNA ladderInvitrogen15628019of gelijkwaardig
6x Loading BufferThermoScientificR0611of gelijkwaardig
NanoDrop 2000 UV-Vis SpectrofotometerThermoScientificND-2000
Nextera XT Index kitIlluminaFC-131-1001 of FC-131-1002
2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix KAPA BiosystemsKK2601
Dynal magnetische stand voor 2 ml tubesInvitrogen12321Dof gelijkwaardig
Agencourt AMPure XP 60 ml kitBeckman Coulter GenomicsA63881
Tris-HCl 10 mM, pH 8.5algemene lableverancier
Agilent 2200 TapeStation systeemAgilent TechnologiesG2964AAof gelijkwaardig
D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5582of gelijkwaardig
D1000 ReagentsAgilent Technologies5067-5583of gelijkwaardig
KAPA Library Quantification Kit voor Illumina platformen (ABI Prism)KAPA BiosystemsKK4835
ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR SysteemApplied Biosystems4329003
NaOH 1.0 N, moleculaire biologie-kwaliteitalgemene lableverancier
HT1 (Hybridisatie Buffer)Illumina Wordt geleverd in de MiSeq Reagent Kit
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycli)IlluminaMS-102-3001
MiSeq SysteemIlluminaSY-410-1003
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001

Referenties

  1. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  2. Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).
  3. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  4. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  5. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  6. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  7. Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors. Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).
  8. Biasco, L., et al. Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell. EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).
  9. De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).
  10. LaFave, M. C., et al. mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).
  11. Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).
  12. Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).
  13. De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).
  14. Romano, O., et al. Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment. Sci Rep. 6, 24724(2016).
  15. Cavazza, A., et al. Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation. Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).
  16. Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).
  17. Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion. PLoS One. 5 (12), e15688(2010).
  18. Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151(2013).
  19. Biffi, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy. Science. 341 (6148), 1233158(2013).
  20. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  21. Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Linker gemedieerde PCRdigestie van genomisch DNArestrictie enzymdigestieflowcytometrie analyseagarosegelelektroforesebibliotheekpreparatiedeep sequencing

Gerelateerde artikelen