Verbetering van de toepassing van ultrahoog moleculair gewicht biotinyleerd Dextran Amine voor Thalamocortical projectie traceren in de Rat

Samenvatting

Hier presenteren we een verfijnde protocol om effectief biotinyleerd dextran amine (BDA) labelen met een fluorescerende vlekken methode via een wederzijdse neurale traject weer te geven. Het is geschikt voor het analyseren van de fijnstructuur van BDA labeling en onderscheiden van andere neurale elementen onder een confocale laser scanning microscoop.

Samenvatting

Ultrahoog moleculair gewicht biotinyleerd dextran amine (BDA) heeft als een hooggevoelige neuroanatomische tracer gebruikt voor vele decennia. Aangezien de kwaliteit van haar labeling werd beïnvloed door verschillende factoren, hier, bieden wij een verfijnde protocol voor de toepassing van ultrahoog moleculair gewicht BDA voor het bestuderen van de optimale neurale labelen in het centrale zenuwstelsel. Na de stereotactische injectie van BDA in de kern van de ventrale posteromedial (VPM) van de thalamus in de rat door middel van een fijne glazen pipet, was de BDA gekleurd met fluorescerende streptavidine-Alexa (AF) 594 en counterstained met fluorescerende Nissl vlek AF500/525. Op de achtergrond van de groene Nissl kleuring, werd de rode BDA labeling, met inbegrip van de neuronale cel organen en axonale terminals, meer duidelijk aangetoond in de Somatosensorische cortex. Bovendien Dubbel fluorescerend kleuring voor BDA en de calcium-bindende eiwit parvalbumin (PV) werd uitgevoerd om te observeren van de correlatie van BDA labeling en PV-positieve interneuronen in de corticale doelgroep, bieden de mogelijkheid om te studeren van de lokale neurale circuits en hun chemische kenmerken. Dus, deze verfijnde methode is niet alleen geschikt voor het visualiseren van hoge kwaliteit neurale labelen met het hoge molecuulgewicht BDA via wederzijdse zenuwbanen tussen de thalamus en cortex cerebri, maar ook toestaat de gelijktijdige demonstratie van andere neurale markeringen met fluorescerende histochemie of Immunochemie.

Inleiding

Ultrahoog moleculair gewicht BDA (10.000 moleculair gewicht), een zeer gevoelige tracer, is gebruikt voor het traceren van de zenuwbanen in het centrale zenuwstelsel voor meer dan 20 jaar¹. Hoewel het gebruik van de BDA een gemeenschappelijk neurale tract traceren techniek is, kan de kwaliteit van het BDA labeling in dieren worden beïnvloed door verschillende factoren^1,-^2,3. Onze recente onderzoek is gebleken dat de optimale structuur van BDA labeling is niet alleen een goede na injectie overlevingstijd is gekoppeld, maar ook gecorreleerd met de kleuring methode⁴. Tot nu, conventionele avidin-Biotine-peroxidase complex (ABC) en daar-fluoresceïne isothiocyanaat streptavidine-AF594 werden kleuring methoden gebruikt voor het openbaren van de BDA labeling in eerdere studies^{2,3, 4,5}. In vergelijking, kan fluorescerende vlekken voor BDA worden eenvoudig uitgevoerd.

Oog op de uitbreiding van de toepassing van ultrahoog moleculair gewicht BDA, was een geraffineerde protocol van Madrid introduceerde in de huidige studie. Na de injectie van BDA in de VPM van de thalamus in de rat hersenen werd BDA labeling geopenbaard door de gewone methode van het standaard ABC kleuring en dubbele fluorescerende vlekken, die werd uitgevoerd voor het observeren van de correlatie van BDA labeling en basic neurale elementen of interneuronen in de corticale doelstelling met streptavidine-AF594 en fluorescerende Nissl histochemie of PV-Immunochemie, respectievelijk. Door de wederzijdse zenuwbanen tussen VPM en de primaire Somatosensorische cortex (S1)^6,7,8, we gericht onze waarneming op BDA labelen in de axonen van het thalamocortical geprojecteerd en corticothalamic geprojecteerde cel Soma in de S1. Door dit proces moeten wij bieden niet alleen een gedetailleerd protocol voor het verkrijgen van de hoge kwaliteit van neurale labelen met ultrahoog moleculair gewicht BDA, maar ook een geraffineerde protocol betreffende de combinatie van fluorescent BDA labeling en andere tl neurale markeringen met histochemie of Immunochemie. Deze aanpak verdient de voorkeur om de lokale neurale circuits en hun chemische kenmerken onder een confocale laser scanning microscopie te studeren.

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door de ethische Commissie op de China Academy van Chinese medische wetenschappen (referentienummer 20160014). Alle procedures zijn uitgevoerd met inachtneming van de nationale instituten van gezondheid gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren (nationale academie Press, Washington, D.C., 1996). Vier volwassen mannelijke ratten (gewicht 250-280 g) werden gebruikt in deze studie. Alle dieren zijn gehuisvest in een 12 h licht/donker cyclus met gecontroleerde temperatuur en vochtigheid, en gratis toegang hebben tot voedsel en water. De instrumenten en materialen die worden gebruikt in de huidige studie werden toonde in Figuur 1.  Vóór de operatie, werden alle instrumenten, zoals het stereotaxic frame en glazen pipet, gereinigd met behulp van 70% ethanol.

1. chirurgische Procedures

1. Het bepalen van de coördinaat interessegebied in VPM met behulp van een stereotaxic atlas⁹ (figuur 2A).
2. Bereiden van een 1 µL micro-injectiespuit voorzien van een glazen micropipet (met een tip diameter van ongeveer 10-20 µm) (Figuur 1 d) en test het met vloeibare paraffine.
3. Anesthetize de ratten met 7% Chloraalhydraat (0,7 mL/100 g) door intraperitoneale injectie.
4. Zodra diepe verdoving wordt bevestigd met staart knijpen en pedaal terugtrekking reflex, de bovenkant van het hoofd van het dier met een elektrisch scheerapparaat te scheren en scrub de chirurgische site 3 keer met 10% Povidon jodium gevolgd door 70% ethanol respectievelijk.
5. Plaats de rat in het stereotaxic apparaat door het plaatsen van botte oor bars in de oren van de rat bovenste snijtanden in de mond houder (figuur 1E) plaatsen en vervolgens toepassen ophthalmic zalf op de ogen.
6. Reinig de hoofdhuid van de chirurgische site weer met behulp van 70% ethanol. Gebruik steriele chirurgische handschoenen en handdoeken om de operatie onder steriele omstandigheden.
7. Maak een Sagittaal incisie in de huid met een scalpel langs de Sagittaal hechtdraad (figuur 1F).
8. Schraap de spier en het periosteum uit de buurt van de schedel met behulp van steriele katoen-tipped applicatoren tijdens de operatie te controleren (figuur 1F) bloeden.
9. Met behulp van vooraf gedefinieerde coördinaten van een atlas (figuur 2A), bepalen de locatie (3,3-mm Bregma punt, 2,6 mm recht aan middellijn) van craniotomy (figuur 1G).
10. Het uitvoeren van een craniotomy met behulp van een burr boor met een ronde-tip beetje (#106) (Figuur 1 H), en blijven boren om over een 1 mm diepte binnen een paar minuten tot het bereiken van de hersenvliezen (figuur 1I).
11. De dura mater bloot van de hersenschors over de injectieplaats (figuur 1I) van microforceps met accijnzen.
12. Vloeibare paraffine in de micro-spuit met 10% BDA (10.000 molecuulgewicht, in gedestilleerd water) oplossing (figuur 1J) wijzigen
13. Monteren van de spuit in de apparatuur van microinjection en verbinding maken met een micro-pomp (Figuur 1 K).
    Opmerking: De geïnjecteerd volume is afhankelijk van de snelheid van de micro-pomp. Hier werd het aangepast aan 30 nL/min (Figuur 1 L).
14. Onder een stereomicroscoop, plaatst u een glas micropipet handmatig met de apparatuur van microinjection in de VPM via de corticale oppervlak van de hersenen op de diepte van 5.8 mm (Figuur 1 M).
15. Druk-injecteren een 100 nL 10% BDA in de VPM over een periode van 3 min (35 nL/min) met een micro-pomp (Figuur 1 L, M).
16. Na injectie, bewaar de pipet op plaats voor een extra 5 min en vervolgens langzaam te trekken.
17. Suture de wonde met steriele draad (figuur 1N). Volg uw lokale dierenverzorgers Comité richtlijnen voor pre- en post chirurgische analgesie.
18. Plaats de rat in een warme herstel ruimte totdat het bewustzijn herwint en weer volledig wordt hersteld.
19. De herstelde rat terugkeren naar zijn kooi.

2. perfusions en secties

1. Na een overlevingstijd van typisch 10 dagen, door het dier met een overdosis van 10% urethaan (2 mL/100 g) door intraperitoneale injectie voor het opwekken van euthanasie te injecteren.
2. Perfuse de experimentele ratten in de kap (figuur 1O).
   1. Zodra de adem stopt, open met schaar en pincet, de borstholte van de rat tot het hart. Invoegen van een intraveneuze katheter in het linkerventrikel naar de aorta, en open vervolgens de juiste oorschelp.
   2. Eerst perfuse met 0,9%-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij fysiologische temperatuur (37 ° C) ongeveer 1-2 minuten totdat het bloed uit het hart verlaten is duidelijk, en ga dan verder met 250-300 mL 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PB, pH 7.4).
3. Na de perfusie, incise van de hoofdhuid en open de schedel en vervolgens uit de rat hersenen ontleden. Na het vaststellen van de ontleed hersenen in 4% paraformaldehyde gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (26 ° C), vervolgens de cryoprotect in 30% sacharose in 0,1 M PBS (pH 7.4) voor 3 dagen bij 4 ° C tot de hersenen is ondergedompeld in de oplossing (Figuur 1 P).
4. Zodra de hersenen wordt ondergedompeld in de oplossing, verdeel de hersenen in drie blokken in de coronale richting op de hersenen matrices (figuur 1T). Het centrale blok bevat de VPM en S1.
5. Snijd het centrale blok van de hersenen bij 40 µm een bevriezing werkgebied microtoom systeem in de coronale richting glijden. Het verzamelen van deze secties ordelijk in een 6-well schotel met 0,1 M PBS (pH 7.4) (cijfers 1R, S).

3. standaard ABC kleuring

Opmerking: Gratis zwevende secties van elk derde coronale deel van de hersenen werden gebruikt voor het visualiseren van de BDA labelen met standaard ABC procedure¹⁰.

1. Spoel de secties in 0,1 M PBS voor ongeveer 1 minuut.
2. Incubeer de secties in 1%-oplossing van de ABC in 0,1 M PB (pH 7.4) met 0,3% Triton X-100 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
3. Wassen van de secties driemaal in 50 mM Tris buffer (pH 7.4).
4. Vlek van de secties in een oplossing met 0,02% 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) en 0,01% H₂O₂ in 50 mM Tris buffer voor ongeveer 2-5 minuten bij kamertemperatuur.
5. Wassen van de secties driemaal in 50 mM Tris buffer (pH 7.4).
6. Monteer de secties op Microscoop dia's met behulp van standaard histochemische technieken (figuur 1T; Zie Aanvullende Video bestand III, perfusie en secties).
7. De secties in de lucht bij kamertemperatuur 's nachts droog.
8. Uitdrogen van de secties kort in een reeks van alcohol (50%, 70%, 95%, 100%) oplossingen. Onderdompelen van de dia's in elke oplossing voor ongeveer 15 s. Laat de dia's te drogen tussen elke stap niet.
9. Schakel de secties in xyleen driemaal, ongeveer 20 min.
10. Doe 2 of 3 druppels balsem op de segmenten dan plaatst u coverslips op de secties.

4. dubbele fluorescerende vlekken voor BDA en neurale basiselementen in de hersenschors

Opmerking: In tegenstelling, dubbele fluorescerende vlekken werd uitgevoerd voor de observatie van de correlatie van BDA labeling en neurale basiselementen op de aangrenzende secties met het bovenstaande gebruikt met streptavidine-AF594 en counterstained met fluorescerende Nissl vlek AF500/525.

1. Spoel de secties in 0,1 M PBS voor ongeveer 1 minuut.
2. Incubeer de secties in een gemengde oplossing van streptavidine-AF594 (1:500) en AF500/525 groen fluorescent Nissl vlek (1:1, 000) in 0,1 M PBS (pH 7.4) met 0,3% Triton X-100 gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
3. Wassen van de secties driemaal in 0,1 M PB (pH 7.4).
4. Monteer de secties op Microscoop dia's met behulp van standaard histochemische technieken. Droog de secties in de lucht gedurende ongeveer 1 uur.
5. Coverslips toepassen op de fluorescerende secties met 50% glycerine in gedistilleerd water voor observatie.

5. dubbele fluorescerende vlekken voor BDA en interneuronen in de hersenschors

Opmerking: Dubbele fluorescerende vlekken werd uitgevoerd voor het observeren van de correlatie van BDA labeling en interneuronen op de representatieve secties in de corticale doelstelling met streptavidine-AF594 en PV-Immunochemie.

1. Spoel de representatieve secties in 0,1 M PBS (pH 7.4) voor ongeveer 1 minuut.
2. Incubeer de secties in een blokkerende oplossing met 3% normale geit serum en 0,3% Triton X-100 in 0,1 M PBS voor 30 min.
3. Breng de secties in een oplossing van muis monoklonaal anti-PV IgG (1:1, 000) in 0,1 M PBS (pH 7.4) met 1% normale geit serum en 0,3% Triton X-100 voor overnachting bij 4 ° C.
4. Wassen op de volgende dag, de secties driemaal in 0,1 M PBS (pH 7.4).
5. Blootstellen van de afdelingen tot een gemengde oplossing van geit anti-mouse-AF488 secundair antilichaam (1:500), streptavidine-AF594 (1:500), en 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI, 1:40, 000) in 0,1 M PBS (pH 7.4) met 1% normale geit serum en 0,3% Triton X-100 voor 1 h.
6. Herhaal stap 4.3 tot 4.5.

6. waarneming

1. Het nemen van beelden van de VPM axonen van de thalamocortical en de corticothalamic neuronen.
   1. Observeren van de fluorescerende monsters met een confocal imaging systeem uitgerust met doelstellingen lenzen (4 x, NB: 0.13; 10 x, NB: 0,40; en 40 x, NB: 0.95). Gebruik excitatie en emissie golflengten van 405 (blauw), 488 (groen) en 559 (rood) nm.
      Opmerking: Hier, de confocal pinhole is 152 µm (4 x, 10 x) en 105 µm (40 x). De ruimtelijke resolutie van Fotolader is 1024 × 1024 pixels (4 x, 10 x) en 640 × 640 pixel (40 x).
   2. Neem twintig beelden in opeenvolgende frames van 2 µm van elke sectie op de dikte van 40 µm (Z-serie).
   3. De beelden te integreren in een enkel beeld in-focus met de confocal beeldverwerking softwaresysteem voor het analyseren van driedimensionale als volgt: set start brandvlak → set einde brandvlak → stap instellen grootte → Kies diepte patroon → afbeelding capture → Z serie.
2. Helderveld beelden maken door een lichte Microscoop uitgerust met een digitale camera (4 x, NB: 0.13; 10 x, NB: 0,40; en 40 x, NB: 0.95 lenzen). Gebruik een belichtingstijd van 500 ms. gebruik foto-editing software aanpassen van de helderheid en het contrast van afbeeldingen en labels toevoegen.

Resultaten

Voortbestaan van 10 dagen post injectie van BDA in de VPM volstond voor de productie van intense neurale etiketten op de bijbehorende corticale gebieden ipsilaterale aan de zijkant van de injectie (Figuur 2). Zowel conventionele ABC en fluorescerende vlekken van procedures voor de BDA bleek de vergelijkbaar patroon van neurale labeling op de S1, inclusief anterogradely label thalamocortical axonen en retrogradely met het label corticothalamic neuronen (

Discussie

Het selecteren van een juiste tracer is een cruciale stap voor een succesvolle neurale tracering experiment. In de familie van de BDA, ultrahoog moleculair gewicht BDA (10.000 molecuulgewicht) werd aanbevolen bij voorkeur worden vervoerd via het traject anterograde neurale in tegenstelling tot laag molecuulgewicht BDA (3.000 molecuulgewicht)^{2,3 , 11 , 12 , 13}....

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Biotinylated dextran amine (BDA)	Molecular Probes	D1956	10.000 molecuulgewicht
Streptavidin-Alexa Fluor 594	Molecular Probes	S32356	Bescherm tegen licht
500/525 groen fluorescerende Nissl-kleuring	Molecular Probes	N21480	Bescherm tegen licht
Stereotactisch breininstrument	Narishige	SR-50
Cryotoom	Thermo	Microm International GmbH
Confocal beeldvorming	Olympus	FV1200
systeem
Microboor	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Sprague Dawley	Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences	SCKX (JUN) 2012-004
Vectastain ABC Kit	Vector Laboratories	PK-4000
Superfrost plus microscoopglazen	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm
Photoshop en Illustratie	Adobe	CS5