Verbetering van de toepassing van ultrahoog moleculair gewicht biotinyleerd Dextran Amine voor Thalamocortical projectie traceren in de Rat

Summary

Hier presenteren we een verfijnde protocol om effectief biotinyleerd dextran amine (BDA) labelen met een fluorescerende vlekken methode via een wederzijdse neurale traject weer te geven. Het is geschikt voor het analyseren van de fijnstructuur van BDA labeling en onderscheiden van andere neurale elementen onder een confocale laser scanning microscoop.

Abstract

Ultrahoog moleculair gewicht biotinyleerd dextran amine (BDA) heeft als een hooggevoelige neuroanatomische tracer gebruikt voor vele decennia. Aangezien de kwaliteit van haar labeling werd beïnvloed door verschillende factoren, hier, bieden wij een verfijnde protocol voor de toepassing van ultrahoog moleculair gewicht BDA voor het bestuderen van de optimale neurale labelen in het centrale zenuwstelsel. Na de stereotactische injectie van BDA in de kern van de ventrale posteromedial (VPM) van de thalamus in de rat door middel van een fijne glazen pipet, was de BDA gekleurd met fluorescerende streptavidine-Alexa (AF) 594 en counterstained met fluorescerende Nissl vlek AF500/525. Op de achtergrond van de groene Nissl kleuring, werd de rode BDA labeling, met inbegrip van de neuronale cel organen en axonale terminals, meer duidelijk aangetoond in de Somatosensorische cortex. Bovendien Dubbel fluorescerend kleuring voor BDA en de calcium-bindende eiwit parvalbumin (PV) werd uitgevoerd om te observeren van de correlatie van BDA labeling en PV-positieve interneuronen in de corticale doelgroep, bieden de mogelijkheid om te studeren van de lokale neurale circuits en hun chemische kenmerken. Dus, deze verfijnde methode is niet alleen geschikt voor het visualiseren van hoge kwaliteit neurale labelen met het hoge molecuulgewicht BDA via wederzijdse zenuwbanen tussen de thalamus en cortex cerebri, maar ook toestaat de gelijktijdige demonstratie van andere neurale markeringen met fluorescerende histochemie of Immunochemie.

Introduction

Ultrahoog moleculair gewicht BDA (10.000 moleculair gewicht), een zeer gevoelige tracer, is gebruikt voor het traceren van de zenuwbanen in het centrale zenuwstelsel voor meer dan 20 jaar¹. Hoewel het gebruik van de BDA een gemeenschappelijk neurale tract traceren techniek is, kan de kwaliteit van het BDA labeling in dieren worden beïnvloed door verschillende factoren^1,-^2,3. Onze recente onderzoek is gebleken dat de optimale structuur van BDA labeling is niet alleen een goede na injectie overlevingstijd is gekoppeld, maar ook gecorreleerd met de kleuri....

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door de ethische Commissie op de China Academy van Chinese medische wetenschappen (referentienummer 20160014). Alle procedures zijn uitgevoerd met inachtneming van de nationale instituten van gezondheid gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren (nationale academie Press, Washington, D.C., 1996). Vier volwassen mannelijke ratten (gewicht 250-280 g) werden gebruikt in deze studie. Alle dieren zijn gehuisvest in een 12 h licht/donker cyclus met gecontroleerde temperatuur en vochtigheid, en gratis toegang hebben tot voedsel en water. De instrumenten en materialen die worden gebruikt in de huidige studie werden toonde in

Results

Voortbestaan van 10 dagen post injectie van BDA in de VPM volstond voor de productie van intense neurale etiketten op de bijbehorende corticale gebieden ipsilaterale aan de zijkant van de injectie (Figuur 2). Zowel conventionele ABC en fluorescerende vlekken van procedures voor de BDA bleek de vergelijkbaar patroon van neurale labeling op de S1, inclusief anterogradely label thalamocortical axonen en retrogradely met het label corticothalamic neuronen (

Discussion

Het selecteren van een juiste tracer is een cruciale stap voor een succesvolle neurale tracering experiment. In de familie van de BDA, ultrahoog moleculair gewicht BDA (10.000 molecuulgewicht) werd aanbevolen bij voorkeur worden vervoerd via het traject anterograde neurale in tegenstelling tot laag molecuulgewicht BDA (3.000 molecuulgewicht)^{2,3 , 11 , 12 , 13}........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biotinylated dextran amine (BDA)	Molecular Probes	D1956	10,000 molecular weight
Streptavidin-Alexa Fluor 594	Molecular Probes	S32356	Protect from light
500/525 green fluorescent Nissl stain	Molecular Probes	N21480	Protect from light
Brain stereotaxis instrument	Narishige	SR-50
Freezing microtome	Thermo	Microm International GmbH
Confocal imaging	Olympus	FV1200
system
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Sprague Dawley	Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences	SCKX (JUN) 2012-004
Vectastain ABC Kit	Vector Laboratories	PK-4000
superfrost plus microscope slides	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm
Photoshop and Illustration	Adobe	CS5