Geautomatiseerde Analyse van een Chemische Sensorische Preference Assay van een Nematodebevolking

Samenvatting

We presenteren een gedragsopname-opstelling en protocol waarmee geautomatiseerde analyse van de nematode, Caenorhabditis elegans , de voorkeur geeft aan oplosbare verbindingen in een populatie gebaseerde assay. Dit artikel beschrijft de constructie van een gedragskamer, het gedragsprotocol en het gebruik van videoanalyse software.

Samenvatting

De nematode, het compacte zenuwstelsel van Caenorhabditis elegans van slechts 302 neuronen, ligt onder een divers repertoire van gedrag. Om de dissectie van de neurale circuits die onder deze gedragingen liggen te vergemakkelijken, is het nodig om robuuste en reproduceerbare gedragsanalyses te ontwikkelen. Vorige C. elegans gedragsstudies hebben gebruik gemaakt van variaties van een "drop test", een "chemotaxis assay" en een "retentie assay" om het antwoord van C. elegans op oplosbare verbindingen te onderzoeken. De werkwijze beschreven in dit artikel beoogt de complementaire sterktes van de drie eerder genoemde assays te combineren. Kortom, een kleine cirkel in het midden van elke meetplaat is verdeeld in vier kwadranten met de controle en experimentele oplossingen afwisselend geplaatst. Na de toevoeging van de wormen worden de analyseplaatjes geladen in een gedragskamer waar microscopecamera's de ontmoetingen van de wormen opnemen bij de behandelde gebieden. Automatische video analyse wordt dan uitgevoerd aEn een waarde voor voorkeurindex (PI) voor elke video wordt gegenereerd. De videoverzameling en geautomatiseerde analysefuncties van deze methode minimaliseren de betrokkenheid van de experimentator en eventuele bijbehorende fouten. Bovendien worden kleine hoeveelheden van de experimentele verbinding per test gebruikt en de multicamera-setup van de gedragskamer verhoogt de experimentele doorvoer. Deze methode is bijzonder nuttig voor het uitvoeren van gedragsschermen van genetische mutanten en nieuwe chemische verbindingen. Deze methode is echter niet geschikt voor het bestuderen van stimulusgradiëntnavigatie door de nabijheid van de controle- en experimentele oplossingsgebieden. Het mag ook niet worden gebruikt als er slechts een kleine populatie wormen beschikbaar is. Hoewel geschikt voor het analyseren van reacties alleen op oplosbare verbindingen in zijn huidige vorm, kan deze methode gemakkelijk worden aangepast om multimodale sensorische interactie en optogenetische studies op te nemen. Deze methode kan ook worden aangepast om de chemosensorische reacties van andere nematodespecies te analyseren.

Inleiding

Voedingsdieren moeten ingangen van meerdere sensorische modaliteiten integreren en passende gedragsstrategieën selecteren om hun omgeving succesvol te kunnen navigeren. Het begrijpen hoe externe sensorische ingangen worden ontvangen en omgezet in neurale informatie om de actieselectie te begeleiden is een centraal doel op het gebied van neurobiologie. De genetische traceerbare nematode, C. elegans , is een aantrekkelijk modelorganisme om de neurale mechanismen van de sensorische biologie en multimodale integratie te bestuderen. Hoewel C. elegans slechts 302 neuronen heeft, kan het detecteren en discrimineren tussen een breed scala aan milieu-stimuli waaronder oplosbare verbindingen, vluchtige geurstoffen en omgevingstemperatuur ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7} . DeNematode C. elegans vertrouwt zwaar op zijn chemosensorische apparaat om voedselbronnen te lokaliseren en zich te waarschuwen voor mogelijke bedreigingen. Zo hebben gedragstesten die zijn ontworpen om de responsen van wildtype en mutant C. elegans naar chemische stimuli te screenen, een cruciale rol spelen in het dissecteren van de genetische, cellulaire en neurale mechanismen die onderliggend zijn aan C. elegans 's opvallende sensorische mogelijkheden.

Om het antwoord op oplosbare verbindingen te analyseren zijn drie typen analyses beschreven - de druppeltest, de chemotaxis-analyse en de retentie-analyse. In de valtest wordt een kleine druppel van de verbinding geplaatst op de staart van een bewegende worm en de beslissing van de worm om achteruit of vooruit wanneer de vloeistof bereikt het voorste sensorische inrichting gescoord ^4. De druppeltest vereist weinig experimentele voorbereiding en is handig als de monstergrootte van wormen klein is, zoals bij laserworms. Echter, als slechts één wormKan tegelijkertijd worden geanalyseerd en de experimentator moet gedurende de gehele duur van de test aanwezig zijn, de druppeltest kan tijdrovend zijn. De druppeltest is ook kwetsbaar voor variaties in druppelafgifte tussen elke worm in een monster, die de algemene resultaten van de test kan beïnvloeden. Een andere beperking van de dalingstest is dat het alleen kan worden gebruikt om de reactie van de worm op aversieve verbindingen te analyseren, aangezien het niet mogelijk is om een ​​aantrekkelijk of neutraal effect van de verbinding te onderscheiden van de voorwaartse beweging van de worm.

De chemotaxisassay voor oplosbare verbindingen omvat in het algemeen een agarplaat in vier kwadranten, waarbij de experimentele oplossing in de agar van twee tegenover elkaar gelegen kwadranten gemengd wordt en de controleoplossing gemengd in de andere twee kwadranten ^{8 , 9} . Bij het begin van de test wordt een druppel bufferwormen geplaatst in het midden van de plaat en het aantal wormen in Elk kwadrant wordt op verschillende tijdstippen gescoord. De chemotaxis-analyse levert een grotere statistische kracht in vergelijking met de dalingstest, aangezien grote hoeveelheden wormen in elke test worden getest. Eén beperking van deze methode is echter dat de bereiding van de chemotaxis assay platen grote hoeveelheden van de experimentele verbinding vereist. Dit maakt het moeilijk om grootschalige gedragsschermen te voeren als een ingewikkeld zuiveringsproces met beperkte opbrengsten nodig is om de verbinding van belang te verkrijgen, zoals bij de ascaroside-signaleringsmoleculen ¹⁰ . Daarnaast is de manuele tellen van wormen in de test gevoelig voor fouten en de storing van de platen tijdens het tellen kan de resultaten beïnvloeden.

In tegenstelling tot de twee bovengenoemde methoden gebruikt de retentie-analyse machinevisie, die de fout tijdens het scoreproces minimaliseert en de interferentie van de experimentator vermindert tijdens de analyse > 11. Geautomatiseerde analyse van video-opnames van wormgedrag kan ook mogelijk subtiele gedragsdynamiek onthullen die gemist wordt wanneer het scoren alleen op een paar discrete tijdspunten wordt uitgevoerd. In de retentietest worden twee oplossingsvlekken aan de tegenover elkaar gelegen kanten van een kleine cirkelvormige bacteriële voedingspatch toegevoegd, gevolgd door de plaatsing van een klein aantal wormen in het midden van de voedingspatch. Het gedrag van de wormen wordt dan opgenomen, geanalyseerd en een voorkeursindexwaarde wordt berekend op basis van het totale aantal wormpixels in elk oplossingsgebied. Hoewel de aanwezigheid van een aantrekkelijke voedingspatch minder maal populaties van wormen in elke test kan gebruiken, is eerder aangetoond dat het voedsel vermijdingsgedrag is opgelost aan oplosbare afstotende stoffen ¹² . Bovendien tonen worms een fotofobische reactie op kortlichtlicht en het gebruik van microscooplichtbronnen die wit licht uitstoten in het gedragsopnameprogramma kan gedrag beïnvloedenS = "xref"> 13.

Het doel van de methode die in dit artikel wordt besproken is het opnemen en analyseren van C. elegans ' voorkeur voor oplosbare verbindingen door gebruik te maken van een populatie gebaseerde assay. Hiertoe integreert en verbetert de huidige werkwijze aspecten uit alle drie de eerder besproken methodes. Het maakt het mogelijk om grote populaties worms te testen en vereist slechts kleine hoeveelheden van de experimentele oplossing die bij elke test moet worden gebruikt. Daarnaast wordt de test uitgevoerd in een op maat gemaakte ingesloten gedragskamer met infrarood LED-achtergrondverlichting om de effecten van het korte golflicht op gedrag te minimaliseren. Elke kamer kan ook uitgerust worden met meerdere microscoopcamera's, waardoor de experimentele doorvoer wordt vergroot zonder de bankruimte in gevaar te brengen. Ten slotte geeft videoanalysesoftware de voorkeurindexwaarde voor elke video en een bijbehorende wormbezettingsgrafiek om de gedragsgedrag van de populatie over de tijd te visualiseren. De kameropstelling en aSsay protocol kan verder worden aangepast om multimodale gedragsreacties te bestuderen, zoals het effect van geurstoffen of temperatuur op chemosensorische gedragingen.

In dit artikel wordt de constructie van de gedragskamer en het testprotocol beschreven. Het toont ook het nut van deze methode aan bij het analyseren van de respons van wild-type wormen en chemosensorische defecte mutanten aan de bekende oplosbare afstotende, koperionen ⁴ . Ten slotte wordt het videoanalyseproces met behulp van de meegeleverde software gedetailleerd beschreven.

Protocol

1. Gedragskamervergadering

OPMERKING: De gedragskamer bestaat uit een ongeveer kubusvormig frame van geëxtrudeerde aluminium staafjes, bedekt met ondoorzichtige stoffen deksels, met een heldere acrylbodem en cameraondersteuning. Gewrichten tussen de geëxtrudeerde aluminium staafjes die de gedragskamer vormen, zijn allemaal loodrecht en zijn beveiligd met behulp van "L" -vormige hoekbeugels (1 inch breed met 1 inch benen) die een hoekbeugelbeen aan elke balk bevestigen met schroeven en schuif T-nuts. Elk gewricht is beveiligd met een of twee hoekbeugels zoals hieronder beschreven. De stofafdekkingen over de kamer zijn aan de aluminium raamstaven bevestigd met dezelfde schroeven en schuif T-moeren maar door middel van grommets in de hoeken van de stof. Schroeven zijn goed ingebracht in de tegenover elkaar liggende zijde van de T-moeren, niet in de zijde met de uitsteeksel. Draai de T-moer in het kanaal wanneer u een schroef / T-moerbevestigingsapparaat aan een aluminium staaf bevestigtOp het juiste gezicht van de staaf met het hoofd van de schroef die uit de sleuf steekt.

1. Maak stofafdekkingen op.
   1. Gebruik een schaar om vijf stukken van de ondoorzichtige polyesterstof te knippen om de bovenste en vier zijden van de kamer te bedekken.
      1. Knip een vierkant 14 x 14 inch ² velstof voor de bovenkant van de kamer. Knip vier rechthoekige 11 x 14 inch ² laken stof aan de zijkanten van de kamer.
   2. Installeer grommets aan de hoeken van de laken.
      1. Merk een referentielijn van 0,5 inch van elke rand van alle vijf polyestervezels met behulp van een potlood en rechte kant.
      2. Voor de vier rechthoekige vellen, gebruik grommetang om grommets centraal te plaatsen waar de potloodlijnen op elke hoek kruisen (dat wil zeggen 4 grommets per vel).
      3. Voor het vierkante vel steek u twee grommets langs elke rand in met elke grommet die op de potloodlijn staat en 1,5 cm van het einde van elk van deDe vier potloodlijnen (dat is 8 grommets totaal, twee bij elke hoek).
   3. Steek een schroef in elk grommetje en steek de T-moer los aan elkaar vast.
2. Maak de camera beugelstaafjes.
   1. Gebruik een bandzaag of gelijkwaardig om een ​​2 inch lange aluminium extrusiebalk voor elke camera te snijden, zodat het snijvlak van de staaf loodrecht op de lengte van de staaf is om de montage te vergemakkelijken.
   2. Gebruik een boorpers met een diameter van 0,25 inch diameter om een ​​gat te boren door middel van de middelste bussen van elke camera mount bar, 0,75 inch van het ene uiteinde, zodat het gat loodrecht op de bovenste en onderste gezichten is en door de middelste lijn van de balk gaat . Optioneel, boor het gat met een handheld elektrische boormachine met een 0,25 inch boor, maar zorg ervoor dat het gat loodrecht staat op de boven- en onderkant van de balk.
3. Maak alle hoekbeugels voorbereid.
   1. Steek een schroef door het gat inElk hoekbeugelbeen, steek de schroef van de binnenkant van de hoek. Draai een T-moer los op elke schroef.
4. Bereid het camera mount assembly ( Figuur 1B , laag 2).
   OPMERKING: De camera mount assembly is een "H" -vormig samenstel dat de drie camera holsters ondersteunt.
   1. Bevestig de camerabeugelbouten aan de middenbalk van de camera mount.
      1. Leg de drie camera mount bars uit die in stap 1.2 zijn vervaardigd met de geboorde gaten verticaal georiënteerd. Schuif twee hoekbeugels aan de zijkanten van elke bevestigingsbalk aan het uiteinde verste van het geboorde gat.
      2. Plaats de hoekbeugels met de beugelboten aan het uiteinde van de balk en draai de schroeven vast om ze vast te zetten. Dit vormt een "T" vorm met het geboord gat onderin de "T".
      3. Leg een 1 voet aluminium extrusie op het werkoppervlak. Zet de T-moeren van een camera-montagebalk losMbly (van de vorige stap) aan de ene kant van de 1 voet staaf. Zet de montagebalk langs de lengte van de 1 voet staaf en draai de schroeven vast om ze vast te zetten. Schuif de andere twee montagestaven aan de andere kant van de 1 voetbalk.
      4. Plaats de twee balkjes evenwijdig van het midden van de 1 voet staaf, met hun binnenste hoekbeugels ongeveer 2,5 inch uit elkaar. Schuif de hoekbeugels aan de zijkanten van de 1 voet staaf, twee aan elk uiteinde van de balk. Plaats de hoekbeugels met de beugelbeugels aan de uiteinden van de staaf en draai de schroeven vast om ze vast te zetten.
   2. Bevestig de eindbalken aan de middelste balk.
      1. Schuif twee 1-voet aluminium extrusies op de T-moeren aan elk uiteinde van de assemblage van de vorige stap die een "H" vorm vormt. Zet elke eindbalk op de middelste staaf en bevestig de vier schroeven aan.
      2. Schuif vier hoekbeugels op de bovenkant van de twee eindbalken die in de vorige stap zijn toegevoegd, een aan elk uiteindeVan elke bar. Plaats de hoekbeugels met de beugelbeugels aan de uiteinden van de staafjes en draai de schroeven vast om ze vast te zetten.
   3. Bevestig de camera stands en holsters aan de camera mount assembly.
      1. Voor elk van de drie microscopecamera stands moet u de camera holster verwijderen door de duimschroef los te maken en de staafstang uit te schuiven.
      2. Plaats voor elke camera bevestigingsbalk (nu vastgezet aan de middelste staaf van de "H") een wasser op een ronde schroef, steek de schroef door het geboorde gat in de camera bevestigingsbalk en plaats nog een wasmachine over de schroef . Grijp het getopte gat van de camerahouder naar beneden op de schroef, vast vast tegen de camera bevestigingsbalk.
      3. Herhaal stap 14.3.2 voor de overige twee camera mount bars.
      4. Zet een camera holster op elke camera staander met de brede opening gericht naar de camera mount bar en schroef. Zet de holster tijdelijk op de camera stand rOd met de duimschroef van de holster.
         OPMERKING: De uiteindelijke bedrijfspositie wordt in sectie 2 ingesteld.
5. Monteer het gedragskamerframe ( figuur 1A ).
   OPMERKING: Voor het gemak van de constructie, monteer het frame ondersteboven, beginnend met de "bovenkant" van het frame van de kamer op het werkoppervlak ( figuur 1B , laag 1) en werk naar boven naar de "voeten" van het frame ( figuur 1B , laag 3).
   1. Monteer de bovenste laag van de gedragskamer aan vier vier-voet geëxtrudeerde aluminium staafjes aan het vierkante polyestervel ( figuur 1B , laag 1).
      1. Schuif een staaf op de twee T-moeren langs elke rand van het weefsel, waarbij de balk langs de weefbreedte centreert. Draai de bevestigingsmiddelen vast om het stoffenblad aan elke balk te bevestigen.
      2. Spreid het vierkante polyesterblad op het werkvlak wiDe vier bijgeleverde aluminium staafjes bovenaan. Plak acht hoekbeugels op de bovenvlakken van de vier aluminium staafjes, één aan elk uiteinde van elke staaf. Plaats de hoekbeugels op de staafjes met de verticale benen van de haakjes aan de uiteinden van de staafjes. Bevestig door de schroeven in de T-moeren vast te zetten.
   2. Op zijn beurt bij elke hoek staan ​​een extra 1 voet aluminium extrusie rechtop, waarbij de extrusie over de T-moeren op de twee hoekbeugelboten glijdt.
   3. Bevestig de rechtop staaf aan de horizontale staafjes door de bevestigingsmiddelen aan te sluiten, zodat u de twee aangrenzende horizontale staafjes aansluit.
      OPMERKING: Bij voltooiing zullen de acht extrusies (vier horizontale en vier verticale) een vierkantige ring op de tafel vormen met vier posten die naar boven steken ( figuur 1B , laag 1).
   4. Schuif de losse T-moeren van het "H" -formige camera-montagesamenstel van sectie 1.4 naar beneden in de staanders van het frame van de vorige stap. Laat de "H & #34; Glijd helemaal naar beneden om op de hoekbeugels op elke hoek van het frame te rusten. Bevestig de camera mount assemblage op zijn plaats door de vier hoekbeugelschroeven vast te draaien.
   5. Monteer de onderste laag van de kamer met behulp van de laatste vier 1 voet geëxtrudeerde aluminium staafjes ( Figuur 1B , laag 3).
      1. Schuif een hoekbeugel aan elk uiteinde van elke 1 voet staaf, plaats de hoekbeugels met de beugelbenen in de uiteinden van de balk en draai de schroeven vast om ze vast te zetten.
      2. Schuif de staafjes tussen het frame rechtop met de losse T-moeren in de staande kanalen. Plaats de staafjes zodat de bovenste randen van hun hoekbeugels 1 cm onder het open uiteinde van de staanders zijn en vastzetten door de hoekbeugelschroeven aan te draaien.
6. Schuif de T-moeren van de vier rechthoekige polyestervellen naar beneden in de kanalen op de staande extrusiebanden om de zijden van de kam te bedekkenR en draai de bevestigingsmiddelen vast om ze vast te zetten.
7. Selecteer een zijde om een ​​deur te krijgen om de binnenkant van de kamer te openen en verwijder de twee schroeven en T-moeren in de onderste laag van de kamer.
   OPMERKING: Wanneer het frame rechtop draait, hangt de bodem van dit deksel los onderaan en kan worden opgeheven om toegang te krijgen tot het interieur van de kamer.
8. Plaats een plastic kap op het bovenste uiteinde van elk hoekelement om als voeten voor het ingevulde frame te dienen. Draai het frame rechts omhoog. Plaats twee paneelhouders per zijde in de basislaag van het frame en draai ze om ze vast te zetten ( Figuur 1B , laag 3). Plaats een 12 x 12 inch ² stuk helder acryl bovenop de paneelhouders om een ​​podium te geven voor testplaten ( figuur 1B , laag 3).

2. Plaatsing van de camera en het stadium van de sjabloon

1. Download en installeer de software voor de opname van de microscoop camera video op de computerVan de website van de fabrikant.
2. Zet een microscoop camera in elk van de drie camera holsters met de camera optics naar beneden gericht naar het acryl stadium en achtergrondverlichting. Sluit de camera's aan op de USB-poorten van de computer. Plaats het infrarood LED-achtergrondverlichtingspaneel onder het frame, onder het podium centreren. Steek het verlichtingspaneel in om aan te zetten.
3. Print de meegeleverde oplossing-plaatsings- en plaat-alignment sjablonen op transparantievellen (zie Aanvullend bestand ).
   OPMERKING: Op de oplossing-plaatsing sjabloon is de cirkel van de plaat omtrek 3,8 cm in diameter en het inwendige gebied van belangcirkel is 0,9 cm in diameter.
4. Knip langs de gridlijnen om rechthoekige transparantie stukken te krijgen die de cirkelvormige sjablonen bevatten.
5. Start de video-acquisitie software en klik op de genummerde miniaturen boven in het venster om de feeds van de camera's te bekijken.
6. Pas de uitlijning en vergroting van de microscoop camera aan.
   1. Plaats een plaat-alignment template onder een microscope camera lens ( Figuur 2B ).
   2. Wijzig de werkafstand door de camerahulster verticaal op de camera staander te schuiven en de vergroting van de camera aan te passen door de vergrotingsschakelaar van de camera te draaien totdat de nummermarkeringen van de sjabloon duidelijk zichtbaar zijn aan de randen van het beeldveld van de camera.
   3. Tape de plaat-alignment template aan het acryl stadium.
   4. Plaats een monsterplaat worms op de plaat-alignment template onder de microscoop camera en verfijn de vergroting en werkafstand tot een scherp beeld van de wormen is behaald terwijl de nummermarkeringen in het zichtveld nog steeds worden behouden.
   5. Herhaal stappen 2.6.1-2.6.4 voor de andere twee microscoopcamera's.

3. Nematodegroei en synchronisatie

1. Vier dagen voor de experimenten, zaad vierentwintig 60 mmNematode Growth Media (NGM) agarplaten met 50 μl OP50 Escherichia coli in Luria-Bertani (LB) bouillon (zie sectie 5 voor recept).
   OPMERKING: Elke 60 mm-plaat zorgt voor voldoende worms voor één meetplaat. Het verwerven van zes replicaten per behandeling of genotype wordt aanbevolen.
2. Laat de zaadplaten rechtop met deksels drogen, overnacht bij kamertemperatuur.
3. De volgende dag, vervoeren vijftien goed gevoedene grave hermaphrodites op elke gepoederde plaat en laat wormen eieren voor zes uur leggen. Dit geeft> 360 eieren per bord.
4. Na 6 uur verwijder worms uit zaadplaten en laat de nakomelingen gedurende drie dagen groeien bij volwassenen bij 20 ° C.

4. Chemosensory Preference Assay

1. Bereid de dag voor het experiment 35 mm NGM agar assay platen.
   1. Bereid 250 ml NGM agar (zie rubriek 5 voor recept).
   2. Regel achtentwintig lege 35 mm platen in stapels van vijf of minder op een vlakke suce. Vul elke analyseplaat met 5 ml NGM agar. Laat de testplaten rechtop drogen met deksels aan, overnacht bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Bereid als één vuistregel een extra testplaat voor elke behandeling of genotype uit om te worden getoetst in geval van onvolkomenheden.
2. Op de dag van het experiment zet u de achtergrondverlichting aan, start de computer op en start de videoclipsoftware van de microscoop camera.
3. Sluit een microscoopcamera aan op de computer en pas de instellingen van de video opnemen aan.
   1. Klik op de genummerde camera thumbnail boven in het softwarevenster om de live feed van de camera te bekijken.
   2. Trek het menu 'Videoformaat' in de linkerbovenhoek van de camera-invoer en selecteer 'MJPG 1280 x 1024'. Trek het menu 'Map' naast het 'Video Format' menu en selecteer een map waarin de videobestanden moeten worden opgeslagen.
   3. Klik op het pictogram 'Automatisch belicht' in de rechterbovenhoek vanDe camera voert de auto-belichting uit en zet deze uit. Klik op het pictogram 'LED' direct rechts van het pictogram 'Automatisch belicht' om de LED's van de ingebouwde microscoop camera uit te schakelen. Klik op het bijbehorende 'Instellingen' icoon: Selecteer 'Monochroom', maximaliseer 'Contrast' en pas 'Helderheid' aan totdat worms verschillend verschijnen van de achtergrond.
4. Kalibratie video's ophalen.
   1. Richt een oplossing-plaatsingsjabloon op de bovenkant van een plattegrond-alignment template ( figuur 2A ). Klik op het opname icoon 'Time-Lapsed Video' aan de linkerkant van de camera feed en voer '5' s in voor de duur en '1' s voor interval om een ​​5-seconde video op 1 frame / s op te nemen. Klik op 'Start' om video-opname te starten.
5. Herhaal de stappen in 4.3 en 4.4 voor de andere twee microscoop camera's.
6. Verwijder de oplossing-plaatsingsjabloon uit de kamer.
7. Was wurmen drie keer met wasbuffer om voedsel te verwijderen.
   1. Gebruik een 5 ml glaspipet om 1,2 ml NGM-buffer toe te voegen aan een bord gesynchroniseerde wormen en roer de plaat zachtjes om de wormen in de buffer te verplaatsen. Pipet de buffer uit de plaat en verdeel wormen in buffer in een schone microcentrifugebuis.
      OPMERKING: Worms zijn gevoelig voor afwijkingen van hun culturele agarzoutconcentratie ¹⁴ . Om de veranderingen in agarzoutconcentratie na de wormplacement te minimaliseren, wordt NGM-buffer voor het wasproces aanbevolen (zie rubriek 5 voor recept). Gebruik geen plastic pipetten om worms van platen te verwijderen, aangezien worms aan de zijkanten blijven vallen. Bereid een equivalent aantal buizen voor als het aantal meetplaten dat tegelijkertijd moet worden uitgevoerd.
   2. Laat de drie buizen gedurende 1-2 minuten staan ​​om wurmen op de bodem te kunnen vestigen. Gebruik een plastic pipet tip om zoveel mogelijk wasbuffer uit de buizen te verwijderen zonder de pellet aggregaat te storenEd worms onderaan de buizen. Vul de buizen met 1 ml schone NGM buffer elk.
   3. Herhaal stap 4.7.2 een keer.
8. Voeg 10 mM _CuCl2 en M13 bufferoplossingen platen (zie hoofdstuk 5 voor recepten) testen.
   1. Tape een oplossing-plaatsingsjabloon bovenop het stadium van de dissectiemicroscoop.
   2. Plaats een strip dubbelzijdig tape aan weerszijden van een plaat-alignment template. Zorg ervoor dat de band overlapt met de cirkel van de omtrek van de plaat, maar sluit de opnamezone van belang niet in het midden van de sjabloon.
   3. Richt de omtrek van de analyseplaat met de cirkel op de plaatuitlijning sjabloon en druk eraf totdat de sjabloon aan de onderkant van de plaat kleeft. Zet de markeringsnummermarkeringen van de analyseplaat sjabloon af met de oplossingsplatformsjabloonmarkers op de dissectiemicroscoop.
   4. Gebruik een P2 pipet en plastic tip om 1 μL van de M13 buffer te plaatsen in quadranten 1 en 4 ( Figuur 2A). Gebruik een nieuwe tip om 1 μL van 10 mM CuCl _2- oplossing elk in kwadranten 2 en 3 te plaatsen ( Figuur 2A ).
   5. Herhaal stappen 4.8.2-4.8.4 voor de overige twee analyseplaatjes.
9. Zodra de oplossing druppelt volledig in de agar geabsorbeerd, gebruik dan een glaspasteurpipet om gewassen wormen van elke microcentrifugebuis over te dragen naar de bijbehorende testplaat.
10. Plaats een druppel worms elk op het gebied boven en onder het rond behandelde gebied. Vouw een weefsel vier keer op en gebruik de stomprand om overtollige wasbuffer op alle assayplaten op te nemen.
11. Regel de drie assayplaten direct onder de microscoopcamera's in de gedragskamer door de nummers op de sjabloonhoeken af ​​te stemmen. Wacht 2-3 minuten om de wormen toe te laten op de assayplaten.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de deurklep van het gedragskamer gesloten is voordat u de video-opname start in de volgende stap.
12. Klik op het opname icoon 'Time-Lapsed Video' aan de linkerkant van de camera feed en voer '10' min voor duur en '1' s in voor interval om een ​​10 minuten video op 1 frame per seconde op te nemen. Klik op 'Start' om video-opname te starten. Nadat de video's zijn opgenomen en opgeslagen, verwijder u de analyseplaatjes uit de kamer.
13. Herhaal stappen 4.7-4.12 voor de volgende ronde assayplaten. Verkrijg minstens zes replicaten of twee rondes opname voor elke behandeling of genotype.

5. Reagensbereiding

1. Bereid NGM agar en buffer.
   1. Voeg in een 1 L glazen fles 1,5 g natriumchloride, 8,5 g agar en 1,25 g pepton toe. Voeg 500 ml gedistilleerd water en een roerbalk toe aan de fles. Autoclaaffles met inhoud.
   2. Plaats de fles op een roerplaat en schakel de roerfunctie in.
   3. Voeg in volgorde met behulp van steriele techniek: 0,5 ml van 5 mg / ml cholesterol, 0,5 ml 1 M calciumChloride, 0,5 ml 1 M magnesiumsulfaat en 12,5 ml 1 M kaliumfosfaat.
   4. Herhaal stappen 5.1.1 tot 5.1.2 om NGM-buffer te maken, maar laat de agar en pepton in stap 5.1.1 achter.
2. Bereid LB bouillon op.
   1. Voeg in een 1 liter glazen fles 5 g trypton, 2,5 g gist extract, 2,5 g natriumchloride, 500 ml gedestilleerd water en 0,5 ml 1 N natriumhydroxide toe. Autoclaaffles met inhoud.
3. Bereid M13 buffer.
   1. Voeg in een 1 L glazen fles 1,817 g Tris, 2.922 g natriumchloride, 0,373 g kaliumchloride en 500 ml gedistilleerd water toe. Autoclaaf de fles met de inhoud.
4. Bereid de oplossing van koperchloride (CuCl ₂ ) op.
   1. Weeg 0.134 g CuCl _{2 af} . Opgeloste toevoegen aan 10 ml M13 buffer in een 15 ml plastic buis 100 mM _CuCl2 voorraadoplossing te maken. Draai de plastic buis om, totdat alle opgeloste stoffen disso hebbenlved.
   2. Met een spuit en 0,2 urn membraanfilter te filteren zuiveren 100 mM _CuCl2 oplossing in een schone 15 ml plastic buis.
   3. 10 mM _{CuCl2-oplossing,} voeg 900 ul van M13 buffer en 100 uL 100 mM _CuCl2 stockoplossing aan een microcentrifugebuis. Omkeer de microcentrifugebuis om goed te mengen.

6. Video analyse

1. Download Python 3 (https://www.python.org/downloads/) en de OpenCV software bibliotheek (http://opencv.org/downloads.html).
2. Download de drie Python scripts voor analyse (https://github.com/WormLabCaltech/ResidentWorm).
   OPMERKING: Zorg ervoor dat alle videobestanden die u wilt gebruiken, in mp4-formaat zijn voordat u verder gaat.
3. Om de functie en parameterbeschrijvingen weer te geven, typ 'help (enter function name)' in de console en druk op enter. Typ bijvoorbeeld 'help (kalibratie)' en druk op enter.
4. Voer de kalibratiefunctie uitMet invoerparameters om de videogebieden van belang (ROI) te definiëren.
   1. Voer de bestandsnaam in van de kalibreringsvideo die is opgenomen in sectie 4 voor de variabele 'mp4filename'. Inclusief aanhalingstekens bij het invoeren van de bestandsnaam.
   2. Begin met de waarden 600 en 360 voor de variabelen 'Q * x' en 'Q * y'. * Voer kwadrantgetallen 1 tot 4 in. Begin met de waarde 310 voor de 'rad'-variabele. Pas de variabele waarden aan tot de ROI-maskers in lijn zijn met de kwadrant-contouren op de sjabloon.
   3. Noteer het totale aantal pixels in elke ROI die bij de uitvoering van deze functie in de console wordt afgedrukt. Voer deze waarde in voor de parameter 'ROI_size' in de preference_index functie.
5. Voer de threshold_constant-functie uit om de juiste drempelconstante te bepalen. Pas de 'constante' waarde aan tot de worms (wit) duidelijk zichtbaar zijn en er is minimale zout-en-pepergeluid op de achtergrond (zwart).
6. Voer de preference_index-functie uit om een ​​csv-datasheet, de voorkeursindex van de video en de bijbehorende wormbezettingsplot te genereren.
   1. Gebruik de 'Q * x', 'Q * Y', 'rad', 'ROI_size' en 'constante' waarden die worden bepaald uit stappen 6.4 en 6.5 als invoerparameters voor de preference_index functie.
      OPMERKING: Voor elke video-frame telt de functie preference_index het aantal wormpixels in elke ROI en berekent het percentage wormpixels uit het totale aantal ROI-pixels. De functie genereert vervolgens een voorkeursindexwaarde voor elk videoram met behulp van de formule:
      
      OPMERKING: Nadat het programma alle frames in de video heeft geanalyseerd, wordt voor de video een gemiddelde voorkeursindexwaarde gegenereerd. Een worm bezetting plot met de voorkeursindex van de video gedrukt bovenaan, evenals een csv datasheet metWorm pixel, percentage worm bezettingswaarden en de voorkeur index voor elk video frame zal worden opgeslagen in de aangewezen map zodra het programma is voltooid.

Resultaten

Figuur 3A toont de voorkeursindexwaarden die zijn verkregen voor verschillende genotype- en behandelingsparingen. Een voorkeursindexwaarde van 1 duidt op een sterke aantrekkingskracht op de oplossing die in de experimentele ROI wordt geplaatst terwijl een voorkeursindexwaarde van -1 een sterke afstoting aangeeft. Een voorkeursindex van 0,02 werd verkregen wanneer de M13 bufferoplossing in zowel de controle- als de experimentele ROI's werd geplaatst, waaruit blijkt dat er geen ruimtelijke voorspanning ten opzichte van ROI is. N2 worms vermeden de koperionen sterk vermeden, wat resulteerde in een voorkeurindex van -0,67, wat de vorige bevindingen bevestigt dat koperionen sterk afstotend zijn ( Supplementary Movie 1 ) ⁴ . Osm-3 mutanten, die een goede vorming van de distale segmenten van sensorische cilia ontbrak, vertoonde een significant verminderd vermijden van koperionen (PI = -0,19) ¹⁵ . Ocr-2 mutanten, welke zijn de Fectief in veel ASH-gemedieerde nociceptieve reacties, waaronder kopervermijding, vertoont ook aanzienlijk verminderde vermijding en zelfs een zachte aantrekkingskracht op koperionen (PI = 0,19) ( Aanvullende Film 2 ) ¹⁶ .

Figuur 3B toont representatieve wormbezettingsgraden, die de dichtheid van wormen in de controle versus de experimentele ROI's in de tijd in elke video aanduiden. Hoe donkerder de kleur van het plotgebied, hoe groter het aantal wormpixels in de ROI. De bezettingsgrafiek voor N2-wormen die behandeld zijn met de M13-bufferregeling, laat zien dat het aantal wormen in beide ROI's gelijk blijft tijdens de test. Echter, de bezettingsgrafiek voor N2-wormen die met koperionen behandeld zijn, duiden erop dat de wormen de experimentele ROI sterk en consistent doorlopen tijdens de test.

Gimg "src =" / files / ftp_upload / 55963 / 55963fig1.jpg "/>
Figuur 1: Foto en schematische representatie van gedragskamerontwerp. ( A ) Vooraanzicht van de gedragskamerinstelling (links) en bijbehorende schematische weergave van kamerkader (rechts). Opaque polyester lakens omsluiten de kamer op alle gezichten, behalve de onderkant, waardoor licht door het infrarood backlight paneel mogelijk maakt. De cijfers 1, 2 en 3 komen overeen met de extrusie lagen in (B). ( B ) Schematisch van bovenaanzicht van extrusielagen die het gedragskamerframe omvatten. Dit omvat de bovenste laag (1), de montagelaag (2) van de middencamera mount en de onderste laaglaag (3). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Oplossings-plaatsing en Plate-alignment Templates. ( A ) De oplossing-plaatsingsjabloon heeft vier kwadranten en nummeruitlijningstekeners. De besturingsoplossing wordt in de linkerboven- en rechterkwadranten geplaatst, terwijl de experimentele oplossing in de linkerbovenhoek en rechtsboven wordt geplaatst. ( B ) De plaatuitlijningsjabloon heeft alleen nummeruitlijningstekeners om de worms in het zichtveld te beperken tijdens video-opname en analyse. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Voorbeeldgegevens verzameld met behulp van deze analyse. ( A ) Preference Index (PI) waarden voor wildtype N2 en mutant C. elegans m> in reactie op M13 buffer en 10 mM _CuCl2. N2 worms lieten geen voorkeur zien tussen controle en experimentele ROI's wanneer de M13 controle oplossing in beide ROI's werd geplaatst, maar de experimentele ROI sterk vermeden toen koper ionen daarin werden geplaatst (respectievelijk PI = 0,02 en -0,67). Osm-3 (p802) mutanten en ocr-2 (ak47) mutanten toonden significant verminderd vermijden van koperionen ten opzichte van N2 (PI = -0,1 en 0,2 respectievelijk). N = 6 analyses voor elke genotypebehandeling pairing,> 360 worms per assay, error bars geven ± 1 SEM, *** p <0.001, eenrichtings ANOVA gevolgd door post-hoc Tukey Honestly Significant Difference (HSD) test. ( B ) Representatieve wormbezettingsplaatsen voor N2-wormen met M13-buffer in zowel ROIs (bovenste) als N2-wormen met M13-buffer in de controle ROI en koperionen in de experimentele ROI (bodem). De kleurenschaal onder elke bezettingsgrafiek vertegenwoordigt het aantal wormpixels.Pload / 55963 / 55963fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

Aanvullende film 1: Gedragsreactie van N2-wormen tot 10 mM koperchloride. Worms worden aangetrokken tot de controle kwadranten met M13 buffer (linksboven en rechtsonder), maar vermijd de quadranten die koper ionen bevatten opgelost in M13 buffer (rechtsboven en linksonder). De video werd opgenomen op 1 frame per seconde en speelde 15x op. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende film 2: Gedragsreactie van ocr-2 (ak47) wormen tot 10 mM koperchlooride. Worms lopen in ongeveer de gelijke mate rond in zowel de controlequadranten met M13 buffer (linksboven en rechtsonder) en het kwadrantS die koper ionen bevatten, opgelost in M13 buffer (rechtsboven en linksonder) gedurende de opnameduur. De mutanten tonen een lichte voorkeur voor de kwadranten die koperionen bevatten bij het begin van de opname. De video werd opgenomen op 1 frame per seconde en speelde 15x op. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand: Solution-placement en Plate-alignment Templates. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Een kritische stap in het protocol is ervoor te zorgen dat de analyseplaatjes een consistente droogheidsniveau hebben over verschillende experimentele dagen. Verschillende droogniveaus zullen resulteren in verschillende diffusiehoeveelheden van de oplossing in de agar en bijgevolg variaties in gedragsuitkomst. Aldus dienen analyseplaatjes altijd vóór de experimenten vers worden op de middag. Het aantal geteste testen per test moet ook gereguleerd worden om de vergelijkingen tussen behandelingen te vergemakkelijken. Ter referentie legt een wild-type worm 4-10 eieren / u gemiddeld> 360 worms per assay als het bovenstaande wormsynchronisatieprotocol gevolgd is ¹⁷ . Als bepaalde mutantstammen slecht ei-leggen, kies dan meer volwassen volwassen wormen voor het ei-leggen om het doelnummer van de nakomelingen te bereiken. Een andere belangrijke stap in het protocol is om worms voorzichtig te behandelen tijdens het wasproces en de wormplaatsing. Worms zijn gevoelig voor mechanische stimuli, die dergelijke stressresponsen opwekken S omkering en ei-liggende remming ¹⁸ . Bovendien moet erop worden gezorgd om de ROI nauwkeurig vast te stellen en de optimale drempelconstante waarde voor specifieke lichtomstandigheden te bepalen voordat u verder gaat met de videoanalyse. Het wordt ook aangeraden de kalibratie- en drempelprocessen te herhalen als er een langere periode is verstreken sinds het laatste experiment is uitgevoerd.

Een beperking van deze methode is dat het niet geschikt is voor het analyseren van kleine wormbevolkingen. Als echter de juiste controles ter bepaling van de invloed van de aanwezigheid van voedsel op het zintuiglijke gedrag worden uitgevoerd, dan is het ook mogelijk om met deze instelling gebruik te maken van voedsel om de ruimtelijke verkennende locatie van de worm te beperken, zoals in de retentie-analyse. Bovendien is deze methode niet bedoeld voor het bestuderen van stimulusgradiëntnavigatie door de nabijheid en kleine hoeveelheden van de gebruikte controle- en experimentele oplossing druppels.

E_content "> In de toekomst kan programmeringssoftware die multi-worm tracking en single-worm feature extractie mogelijk in dit systeem ^{19 , 20} integreren. Het opnemen van subtiele gedragsparameters van singlewormgedrag zoals omkeringssnelheden en amplitude van lichaamsbochten zullen zorgen voor Een meer gedetailleerde foto van het chemosensorische gedrag van een individuele worm in de context van een populatie gebaseerde test. De test kan ook worden aangepast om de habituatie te bestuderen door de gaten door de ROI te boren met behulp van spuitnaaldjes met de juiste gaugeformaat en het vullen van de gaten met ingeblazen agar Met de experimentele verbinding of controle buffer. Dit zorgt voor een consistente oppervlakconcentratie van de verbinding gedurende een langere periode van opnametijd zoals nodig is tijdens de wabituation studies. Een andere potentiële toepassing van deze methode is het uitvoeren van vergelijkende gedragsstudies over verschillende nematodespesies. Daarnaast is de gedragskamerKan op meerdere manieren worden aangepast om gedragsreacties op multimodale stimuli te bestuderen. Voor optogenetische toepassingen kunnen hoge intensiteit LED-arrays naast de camera-mount worden bevestigd om selectieve neuronen van belang te activeren tijdens de test. Verwarmingselementen, koelsystemen en temperatuursensoren kunnen ook worden toegevoegd aan de installatie om de effecten van temperatuur op sensorisch gedrag te bestuderen. Bovendien kunnen geurafleveringssystemen in de kamer geïnstalleerd worden om interacties tussen geur- en chemosensoriële modaliteiten te onderzoeken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Aluminium T-sleuven framingprofielen	McMaster-Carr	47065T101	Enkel profiel, 1" maat, massief
Haakjes	McMaster-Carr	47065T236	1" lang voor 1" hoge enkele profielextrusies
Compacte eindvoedingsbevestigingen	McMaster-Carr	47065T139	1" (enkel), pak van 4
Twist-in massieve paneelhouders	McMaster-Carr	47065T251	Voor 1" hoge extrusie
Kunststof eindkappen	McMaster-Carr	47065T91	Voor 1" hoge extrusie
Optisch helder gegoten acrylplaat	McMaster-Carr	8560K211	3/16" dik, 12" x 12"
Vinyl-gecoat polyesterweefsel	McMaster-Carr	88505K57	0.027" dik, 61" breedte, zwart
Messing rondsels	McMaster-Carr	9604K22	Handelsmaat 0, 0.545" buitendiameter
Stalen schijven	McMaster-Carr	90107A029	1/4" schroefmaat
Schroeven met afgeronde kop	McMaster-Carr	90272A546	1/4" - 20 draadmaat, 1 - 1/2" lang
Standaard werkende achtergrondverlichting	Smart Vision Lights	Zie lokale leverancier	8" x 8", infrarood 850 nm
IVP-C1 variabele regelpot	Smart Vision Lights	Zie lokale leverancier
T1 voeding	Smart Vision Lights	Zie lokale leverancier
Dino lite Pro AM4113T	Dino-Lite Digital Microscope	Zie lokale leverancier
MS09B microscoopstandaard	Dino-Lite Digital Microscope	Zie lokale leverancier