Een rekenkundige methode om te kwantificeren vliegen circadiane activiteit

Summary

Een methode om te kwantificeren van de belangrijkste tijdelijke functies gezien in vliegen circadiane ritmes van locomotor wordt gepresenteerd. De kwantificering wordt bereikt door het aanbrengen van vliegen activiteit met de golfvorm van een meerdere parametrische model. De model-parameters beschrijven de vorm en de grootte van de ochtend en avond toppen van dagelijkse activiteit.

Abstract

In de meeste dieren en planten, circadiane klokken orkestreren van gedrags- en moleculaire processen en synchroniseer deze aan de dagelijkse licht-donker cyclus. Fundamentele mechanismen die ten grondslag liggen aan dit temporele controle zijn wijd bestudeerd met behulp van de fruitvlieg Drosophila melanogaster als een modelorganisme. De klok wordt in vliegen, meestal bestudeerd door het analyseren van meerdaagse locomotor opname. Een dergelijke opname toont een complexe bimodaal patroon met twee toppen van activiteit: een ochtend peak dat gebeurt rond dageraad en een hoogtepunt van de avond dat gebeurt rond de schemering. Deze twee pieken vormen samen een golfvorm die is heel anders dan sinusvormige trillingen waargenomen in klok genen, suggereren dat mechanismen naast de klok diepgaande gevolgen hebben bij het opstellen van de waargenomen patronen in de gedrags-gegevens. Hier geven we instructies over het gebruik van een onlangs ontwikkelde computationele methode die wiskundig temporele patronen vliegen activiteit beschrijft. De methode past activiteitsgegevens met de golfvorm van een model dat bestaat uit vier exponentiële termen en negen onafhankelijke parameters die de vorm en de grootte van de ochtend en avond toppen van activiteit volledig te beschrijven. De uitgepakte parameters kunnen helpen verhelderen van de kinetische mechanismen van substraten die ten grondslag liggen aan de vaak waargenomen bimodaal activiteit patronen in vliegen locomotor ritmes.

Introduction

De circadiane klok is een endogene biochemische oscillator met een periode van ongeveer 24 uur en is bijna alomtegenwoordig in dieren en planten van^1,2. De klok helpt synchroniseren de interne processen en het gedrag aan de externe licht-donker cyclus van een organisme. De genetische structuur van de circadiane klok grote schaal is onderzocht sinds de jaren 1960 met de fruitvlieg, D. melanogaster. In dit insect, de kern van de circadiane klok bestaat uit vier eiwitten: periode, TIMELESS, klok en cyclus. Deze componenten van de kern samen met andere moleculen vormen een feedback-lus die bijna sinusvormige trillingen van klok genen^{3,4 produceert}. De circadiane klok in vliegen is wijd bestudeerd met behulp van meerdaagse locomotor opnames waar vliegen activiteit wordt gedetecteerd met een enkele infraroodstraal overschrijding van het midden van een individuele buis⁵. Een typische vlieg opname heeft een complexe bimodaal patroon met twee goed te onderscheiden pieken: morgen piek (M), die begint aan het einde van de nacht en heeft een maximale wanneer verlichting inschakelen; en avond piek (E) die begint aan het einde van de dag en heeft een maximale wanneer verlichting^{6 uitschakelt}. Interessant is dat is de vorm van dergelijke gedrags opname heel anders dan de eenvoudige sinusvormige trillingen waargenomen op moleculair niveau, hetgeen wijst op de actie van aanvullende regelingen bij te dragen tot de waargenomen temporele patronen. Om deze verborgen mechanismen beter te begrijpen, hebben we een computationele hulpprogramma waarmee een kwantitatieve beschrijving van de temporele patronen.

In ons werk, zijn motorische ritmes gedefinieerd in termen van een golfvorm die vliegen activiteit patroon bootst. Aangezien eenvoudige sinus golven kan niet worden gebruikt voor het model van de waargenomen ritmische veranderingen in activiteit, testten we verschillende signaal vormen selecteren de eenvoudigste die de meest opvallende kenmerken gezien in de opnames vangt. Fruitvlieg circadiane gedrag wordt bepaald door de activiteit van de neuronen van de klok die vaak exponentiële patronen van activering en deactivering^{7 hebben}. De exponentiële dynamiek en visuele analyse van de gegevens ingegeven laten bouwen van een model met exponentiële termen dat bestaat uit vier exponenten met negen onafhankelijke parameters en vertonen de vliegen activiteit patroon⁸. Naast het motorische gegevens analyseren we ook haar macht spectrum. Typische vlieg activiteit spectrum toont meerdere pieken bij harmonischen T₀/2, T₀/3, enz, naast de verwachte fundamentele piek op de circadiane periode T₀. Volgens de stelling van Fourier produceert alleen een zuivere sinus golf een één piek in vermogen spectra, terwijl de meer complexe golfvormen weergeven meerdere spectrale pieken op de harmonischen van de primaire periode (Figuur 1). Daarom, gezien de niet-sinusvormige temporele patroon in vliegen activiteit⁸, een multi piek macht spectrum van de gegevens is wiskundig verwacht en impliceert niet noodzakelijk de aanwezigheid van meerdere periodes van trilling. Nog belangrijker is, toont de macht spectrum van de voorgestelde model golfvorm ook pieken op alle harmonischen van de primaire periode, vergelijkbaar met de vlieg locomotor opnames, dus het onderstrepen van de high-fidelity waarmee onze model vliegen gegevens zowel in tijd als in frequentie beschrijft.

Bij resoluties van de tijd van een paar minuten of minder, vliegen activiteit weergegeven gegevens lawaaierige, waardoor het moeilijk te parameters rechtstreeks extraheren uit de ruwe gegevens. Weggooien van gegevens langer tijdsintervallen geluidsniveau kan verminderen, maar kan veranderen de gegevens op een manier die kan invloed hebben op de schatten van parameters van het model. Daarom krijgen we de parameters van macht spectra van de opnamen, gebruik een analytische expressie voor de spectra van de verwachte vermogen berekend op basis van de Fourier-transformatie van het model functie⁸ (zie extra bestand 1 verwijzing⁸). Deze benadering van het verkrijgen van de parameters van de macht-spectra levert nauwkeurige parameterwaarden zonder enige extra manipulaties, zoals weggooien of filteren, van de ruwe activiteitsgegevens. Wiskundige details van het model en de toepassingen met wild-type en mutant gegevens zijn beschreven in verwijzing⁸. Het protocol gepresenteerd hier richt zich op de stapsgewijze instructies voor het gebruiken van de computationele tool.

Protocol

1. meten van vliegen voortbewegen met behulp van Drosophila activiteit Monitor (DAM)

Opmerking: voor meer details, zie referentie ⁵.

1. Voorbereiden individuele vlieg buizen met voedsel aan de ene kant en katoen anderzijds. Het einde met voedsel moet worden afgesloten om te voorkomen dat het voedsel uitdrogen.
   1. 5-6 g van vliegen voedsel in een 50 mL-bekerglas plaatsen Het voedsel in kleine stukjes gesneden zodat is het gemakkelijker om te smelten it.
   2. Sluit 32 afzonderlijke glazen buizen met een elastiekje.
   3. Smelten van het voedsel in het bekerglas door verhitting in de magnetron voor 10-15 s. Stop de magnetron elke 5 s en zorgvuldig schudden het bekerglas om ervoor te zorgen dat gelijke smelten van voedsel.
   4. Terwijl het eten is nog steeds vloeibaar, zetten de bereid afzonderlijke buisjes in het bekerglas met voedsel. De buizen omhoog en omlaag zodat zij even gevuld.
   5. Toestaan het voedsel afkoelen en stollen voor ongeveer 1 h.
   6. Nadat het voedsel solide is, verwijdert u de buizen met het voedsel uit het bekerglas.
   7. Zegel het einde met het voedsel met behulp van wax. Eerst zorgvuldig schoon een buis met behulp van een papieren handdoek, druk vervolgens op de buis tegen de wax. Visueel controleren de kwaliteit van de zegel, en herhaal indien nodig de verzegeling opnieuw.
   8. Sluit het andere uiteinde van de buis met katoen, katoen zal toestaan lucht te gaan door middel van vergrendelde houden een vlieg in de buis.
2. Plaatst u een enkel vlieg in elke afzonderlijke buis en plaatsen van de buizen in de DAM.
3. Plaats monitoren in een incubator die constante temperatuur en vochtigheid onderhoudt. Op basis van het experiment, de juiste licht/donker-voorwaarden als volgt instellen.
   1. Voor licht/donker experimenten de vliegen in licht/donker cyclus voor het hele experiment houden. Gebruik niet de eerste dag van de metingen in de analyse.
   2. Voor constante duisternis experimenten, ten eerste houden de vliegen voor twee dagen in licht/donker voorwaarden meevoeren en synchronisatie van de klokken en vervolgens overschakelt naar constante duisternis. Gebruik niet de metingen vanaf de eerste dag van de constante duisternis in de analyse.
4. Ten minste vier dagen van gegevens die kunnen worden gebruikt bij de analyse verzamelen.
   Opmerking: Het DAM-systeem zal de uitgang van een enkel bestand met een opname van de motoriek van alle vliegen in het weergavepaneel.

2. Data-analyse

1. Split de monitor output bestand in meerdere bestanden van enkele vliegen activiteit; elk bestand moet één kolom ' .txt ' bestand met een meting van de individuele fly locomotion.
Run
2. ' ModelFitPS3.m ' functie in een opdrachtvenster Matlab met de volgende invoerparameters:
   1. voor samplingrate, stelt u het gegevens bemonstering tijdsinterval in seconden. Bijvoorbeeld, als activiteit elke minuut gemeten werd, voer 60 als de samplingrate.
   2. Voor bin_interval, stelt het tijdsinterval in minuten waarop gegevens zullen worden weggegooid voor betere visualisatie; het aanbevolen bin-interval is 20-30 min.
   3. Voor trend, Voer " 1 " als uit de gegevens basislijn trend blijkt en " 0 " anders; gegevens met trend eerst door de montage van een tweede orde polynoom en vervolgens af te trekken van het van de gegevens zal worden detrended.
3. In het pop-up venster Selecteer een bestand van één vliegen activiteit.
   Opmerking: Het eerste perceel is gegevens macht spectrum, en niet de plot van bekende activiteit. Uit de uitgezette macht spectrum, bepalen de primaire periode T ₀: ofwel klik met de linker muisknop op de circadiane peak, of met de rechter muisknop op de tweede harmonische piek (rond T ₀ / 2).
4. Op het perceel geopende gegevens controleren als de ochtend en avond pieken goed worden gevisualiseerd. Als dat niet het geval is, wijzig de waarde bin_interval door rechts te klikken ergens op de grafiek en het invoeren van de nieuwe waarde van het bin_interval in het dialoogvenster. Het programma zal het vernieuwen van de gegevens met de nieuwe waarde van het interval. Accepteer de bin_interval waarde, klik met de linkermuisknop overal op de grafiek.
5. Het programma zal vernieuwen van de gegevens weer en Toon van de eerste vijf dagen van activiteit. Op dit perceel, klik op de eerste M piek die zal worden gebruikt in de analyse (soms is het noodzakelijk om een of twee dagen overslaan).
   Opmerking: Het programma zal opnieuw tekenen van de grafiek vanaf de geplukte ochtend piek. De blauwe en rode lijnen zal tonen de benaderende positie van de piek van de E en de volgende dag M piek, respectievelijk, op basis van de periode bepaald in stap 2.4.
6. Op dezelfde grafiek, gegevens voor een voorlopige pasvorm van de gegevens met het model te kiezen: Klik op de volgende punten (in dit bestel; er rekening mee dat de klik-locatie wordt aangegeven met een rode ster aan de onderkant): (i) Top van M piek; (ii) ultimo het hoogtepunt M; (iii) de start van de E-piek; (iv) de top van de piek E; (v) einde van de E-piek; (vi) de top van de piek van de M voor de volgende dag.
7. Er rekening mee dat het programma nu de macht spectrum presenteert.
   Opmerking: De x-as wordt nu gegeven in frequentie.
   1. In het geopende venster met de macht spectrum, kies punten die zullen worden gebruikt voor het aanbrengen van de analytische expressie voor het model macht spectrum. De periode die zijn aangetroffen in stap 2.4 is gemarkeerd met een rode lijn. Te halen montage punten, eerst ongeveer bepalen de primaire periode, vergelijkbaar met stap 2.4. Vervolgens met behulp van de schuifregelaar, fine-tunen de primaire periode waarde zodat de montage punten (weergegeven met rode cirkels, zal verschijnen nadat u de schuifregelaar verplaatst) zijn gesloten voor piekwaarden.
8. Na de visuele piek selectie, klikt u op " accepteren " en het programma zal geselecteerde punten met de analytische expressie voor het berekenen van de parameters van het model passen.
9. Merk op dat de parameters en de spectrale fit fout worden opgeslagen in het bestand " model_fit_parameters.txtŔ het programma bespaart bovendien 2 cijfers met vlagen van de motorische gegevens en haar macht spectrum.

Results

De methode die hier gepresenteerd kunt kwantificering van de belangrijkste kenmerken in vliegen motoriek patroon. De kwantificering wordt bereikt door het aanbrengen van de activiteitsgegevens met een model dat uit vier exponentiële termen bestaat:

Het model heeft negen onafhankelijke parameters die acti...

Discussion

Dit werk bevat instructies voor het gebruik van een computationele hulpprogramma waarmee een kwantitatieve beschrijving van vliegen motoriek patroon. De tool past motoriek gegevens met een wiskundig model bestaande uit vier exponentiële termen die de vorm en grootte van de pieken M en E samen te beschrijven. De laatste waarden voor de parameters van het model worden verkregen van de montage van de spectra van de macht van de gegevens, waar het gebruik van de ruwe gegevens artefactual effecten die gegevens weggooien of fi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Activity Monitor	TriKinetics	DAM2, DAM5	Meet het vliegen van locootion met behulp van een enkele infraroodstraal
MatLab	Mathworks		Computeromgeving en programmeertaal, MatLab moet Optimalisatie en Symbolic Math toolboxes bevatten
Drosophila melanogaster		per[S], per[L], iso31(wild type)	Onze analyse kan worden uitgevoerd met vliegmutanten van elke circadiane periode