3D Microtissues voor injecteerbare regeneratieve therapie en High-throughput Drug Screening

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de fabricage van elastische 3D macroporeuze microcryogels door de integratie van microfabrication met cryogelation-technologie. Bij het laden met cellen, worden 3D-microtissues gegenereerd, die kan gemakkelijk ingespoten in vivo om regeneratieve therapie of geassembleerd tot arrays voor in vitro high-throughput drug screening.

Samenvatting

Wij hebben om een upgrade celkweek met traditionele 2D naar 3D-celkweek, microfabrication geïntegreerd met cryogelation-technologie voor de productie van macroporeuze microscale cryogels (microcryogels), die kunnen worden geladen met allerlei celtypes te vormen van de 3D microtissues. Hierin presenteren wij het protocol om veelzijdige 3D microtissues en hun toepassingen in regeneratieve therapie en drug screening. Grootte en vorm-controleerbare microcryogels kan worden vervaardigd op een matrix-chip, die kan worden geoogst uit-chip als individuele cel-geladen dragers voor injecteerbare regeneratieve therapie of verder worden gemonteerd op de chip in 3D microtissue arrays voor high-throughput drug screening. Vanwege de hoge elastische aard van deze microscale cryogels vertonen de 3D microtissues grote injectiecapaciteit voor minimaal invasieve celtherapie door cellen te beschermen tegen mechanische schuintrekken kracht tijdens de injectie. Dit zorgt voor verbeterde cel overleven en therapeutisch effect in de muismodel van het ledemaat ischemie. Ondertussen, vergadering van 3D microtissue arrays in een standaardindeling van 384-multi-goed vergemakkelijkt het gebruik van gemeenschappelijke laboratoriumfaciliteiten en apparatuur, waardoor hoge gegevensdoorvoer drug screening op dit veelzijdige 3D cel cultuur platform.

Inleiding

Traditionele celkweek op platte tweedimensionale (2D) oppervlakken, zoals een schotel van cultuur of multi goed platen, kan nauwelijks cel dicht bij hun eigen bestuurlijk gedrag uitlokken. Nauwkeurige recapitulatie van inheemse cellulaire microenvironments, die bestaan uit verschillende celtypes, extracellulaire matrices en bioactieve oplosbare factoren in driedimensionale (3D) platforms^{1,2,3 ,4}, is van essentieel belang voor de bouw van biomimicking weefsels in vitro voor toepassingen in de tissue engineering, regeneratieve geneeskunde, fundamentele biologie onderzoek en drug discovery^{5,6,7 ,8,9}.

In plaats van 2D celcultuur, 3D-celkweek wordt veel gebruikt om vooraf biomimetische micro-architectuur en functionele kenmerken van cellen gekweekt in vitro. Een populaire 3D cel cultuur methode is om de samengevoegde cellen in spheroïden^7,8,9,10. Cellulaire spheroïden kunnen worden geïnjecteerd om gewonde weefsels met verbeterde cellulaire retentie en de overleving in vergelijking met de injectie van verspreide cellen. Echter, niet-uniforme sferoïde maten en onvermijdelijk mechanische schade opgelegd cellen vloeistof schuintrekken gewapenderhand tijdens injectie leiden tot slechte cel therapeutische effecten^11,12,13. Evenzo heeft de inherent niet-uniformiteit tijdens samenvoeging van spheroïden hun vertaling naar 3D cel-gebaseerde high-throughput drug screening uitdagende¹⁰gemaakt.

Een andere methode voor 3D-celkweek wordt bereikt met de hulp van biomaterialen, meestal ingekapseld in de cellen in waterige hydrogels of poreuze steigers. Het zorgt voor meer flexibiliteit bij de bouw van 3D platforms. Voor therapie, zijn cellen ingekapseld in bulk steigers meestal geleverd aan dierlijke lichaam via chirurgische implantatie, die is invasieve en traumatisch, vandaar zijn brede vertaling naar bed te beperken. Aan de andere kant, inschakelen waterige hydrogels minimaal invasieve therapie door het injecteren van cellen gesuspendeerd in hydrogel voorloper oplossing waardoor in situ gelering via thermo-, chemische of enzymatische crosslinking¹¹-dierlijke organen. Echter als cellen worden terwijl de hydrogel voorlopers nog in een waterige staat zijn afgeleverd, worden ze ook blootgesteld aan mechanische schuintrekken tijdens de injectie. Niet alleen dus, kan chemische of enzymatische crosslinking tijdens in situ gelering hydrogel ook schade aan cellen binnen opleggen. Voor drug screening problemen biomaterial-bijgewoonde celculturen met uniformiteit, de controleerbaarheid en de doorvoer. Met behulp van hydrogels, zijn cellen meestal betrokken tijdens gelering, waarmee het proces invloed kan zijn op levensvatbaarheid van de cellen en functie. Gelering tijdens cel zaaien belemmert ook gebruik door de meeste high-throughput apparatuur, aangezien de hydrogel worden gehouden op het ijs moeten kan om te voorkomen dat gelering voor cel zaaien, en de hydrogel misschien verstrekking tips, die zijn meestal erg dun om ervoor te zorgen nauwkeurigheid voor jam High-throughput screening. Pre-gevormde steigers kon potentieel scheiden biomaterial fabricage procedures van de cultuur van de cel, maar de meeste steiger gebaseerde producten zijn beschikbaar als stortgoederen met relatief lagere doorvoer¹⁴.

Om sommige van de tekortkomingen van de huidige 3D kweekmethoden te overwinnen, hebben wij een microfabrication-cryogelation, geïntegreerde technologie om een off-the-shelf en gebruiksvriendelijke microcryogel matrix chip¹⁵ontwikkeld. In dit protocol, is gelatine geselecteerd om te illustreren de microcryogel fabricage techniek zoals het is biocompatibel, afbreekbaar, rendabel, en geen verdere wijziging vereist voor bevestiging van de cel is. Andere polymeren van natuurlijke of synthetische bronnen kunnen ook worden gebruikt voor de fabricage, afhankelijk van de toepassing. Via deze technologie, kunnen wij fabriceren verkleinde en zeer elastische microcryogels met regelbare grootte, vorm en indeling. Wanneer geladen met allerlei celtypes, kon 3D microtissues worden gevormd voor diverse toepassingen. Deze unieke functies inschakelen gewenste injectiecapaciteit, cel bescherming en het behoud van de plaats-geleide na injectie in vivo voor verbeterde therapeutische effecten. Niet alleen dus, kan de microcryogels verder worden verwerkt tot 3D microtissue arrays die compatibel met de gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur en -instrumenten zijn te realiseren van hoge-doorvoer celkweek voor veelzijdige drug screening en andere cellulaire assays. Hierin leggen we de productie-procédé van microcryogels en de nabehandeling als individuele 3D microtissues of 3D microtissue arrays voor twee belangrijke toepassingen, celtherapie en drug screening, respectievelijk^10,15 .

Protocol

dierproeven gevolgd strikt protocol goedgekeurd door de ethische commissie van dier op het Center of Biomedical Analysis, Tsinghua Universiteit. Onder goedkeuring van de ethische Commissie, menselijk vetweefsel is verkregen uit het departement van plastische chirurgie van Peking Unie ziekenhuis met geïnformeerde toestemming van de patiënten.

1. fabricage van 3D Microcryogels

1. ontwerp en de fabricage van microstencil matrix chips
   1. gebruik een commerciële software ontwerp matrices van bepaalde geometrieën, zoals cirkels, ellipsen, driehoeken of klaverblaadjes ¹⁴, afhankelijk van de latere toepassing.
      Opmerking: Verwijzen naar hoofdstuk 2 van het protocol voor regeneratieve geneeskunde en punt 3 van protocol voor drug screening voor ontwerpdetails.
   2. Het ontwerp in de laser gravure software begeleidende de laser gravure machine importeren. Met behulp van de laser-instellingen overeenkomstig de aanbevelingen van de fabriek voor de laser gravure machine, het geïmporteerde ontwerp op Poly (methymethacrylate) (PMMA) laser-graveren bladen.
   3. Was de microstencil matrix chips met gedeïoniseerd water schoon puin van de lasergravure. Droog de microstencil array chips op 60 ° C. te slaan in een verzegelde zak op kamertemperatuur maandenlang.
2. Fabricage van microcryogel matrix chips
   1. 4 plaats microstencil array chips op de monster-lade en invoegen in het plasma reiniger. Sluit de deur van de schoner en zet de vacuümpomp gedurende 2 minuten, dan zet het maximumvermogen RF (18 W) voor de behandeling van de microstencil matrix chips in het plasma reiniger gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur te verhogen hydrophilicity.
   2. Toevoegen 0.06 g gelatine op 1 mL gedeïoniseerd water om te vormen van 6% (wt/vol) gelatine voorloper oplossing (genoeg om 5 fiches). Bij 60 ° C in een waterbad te ontbinden voldoende warm. Incubeer op ijs voor 5 min.
   3. Toevoegen 3 µL van Glutaaraldehyde in de gelatine voorloper oplossing om een eindconcentratie van 0,3%. Meng.
   Pipetteer 200 µL voorloper oplossing met Glutaaraldehyde op de hogere oppervlakte van de microstencil matrix chip
   4. .
      Opmerking: 200 µL is voldoende voor een 75 mm × 25 mm chip ongeacht ontwerp. Verhoging van het bedrag proportioneel wanneer oppervlakte van chip wordt verhoogd.
   5. Handmatig de oplossing gelijkmatig verdelen over de chip door schrapen terug en weer met een gebogen glazen staaf 2 tot 3 keer.
      Opmerking: Elk micro-putje op de microstencil-chip kan gevuld worden met voorloper oplossing hun hydrofiele karakter na plasma behandeling.
   6. Plaatst u onmiddellijk de voorloper oplossing-gevulde matrix fiche in een vriezer van-20 ° C voor 16 h voor cryogelation.
   7. Aanpassen de lyophilizer tot-40 ° C gedurende 30 minuten plaatst u de matrix chips na cryogelation in de lyophilizer en de matrix-chips voor 2 h in vacuüm lyophilize.
      Opmerking: Gelatine microcryogels met onderling verbonden macroporiën worden gevormd omdat ijs gevormd tijdens cryogelation sublimes in de lyophilizer.
   8. Gaat u verder met deel 2 voor behandeling van kritische ledemaat ischemie (CLI) en hoofdstuk 3 voor high-throughput drug screening.

2. Oogsten van individuele Microcryogels voor de injecteerbare vorm 3D Microtissues voor behandeling van CLI

1. opruiming individuele microcryogels
   1. ontwerp arrays (75 mm × 25 mm) van 600 cirkels, elk met een diameter van 400 µm, in commerciële software voor de bouw van de injecteerbare 3D microtissue. PMMA 300 µm dikte gebruiken voor de fabricage van microstencil matrix chip als omschreven in punt 1.1.
   2. Fabriceren microcryogel matrix chips zoals in punt 1.2.
   3. Fabriceren een PDMS Ejector Pin-matrix met hetzelfde ontwerp als in stap 2.1.1 door standaard zachte lithografie ^{16 , 17}.
   4. Bedekken de microcryogel matrix chip op de top van de PDMS Ejector Pin matrix, uitlijnen elk microcryogel met een ejector pin op de array. Druk op de microcryogel matrix chip naar de ejector pin array te duwen van de microcryogels uit de microwells met de uitstekende pinnen op het PDMS ejector pin array te oogsten van individuele microcryogels.
   5. En oogst van de microcryogel in het water te verzamelen met behulp van zeven van de cel. Gebruik een zeef voor het verzamelen van microcryogels van een chip (d.w.z., 600 microcryogels).
   6. Wassen microcryogels met 0,1 M NaBH ₄ op het ijs gedurende 20 minuten om alle residuen van uncross-gekoppelde aldehyde quench. Gebruik 5 mL 0,1 M NaBH ₄ per spaander. NaBH ₄ te negeren en wassen met 5 mL gedeïoniseerd water gedurende 15 minuten staan 3 tot 5 keer, telkens.
   7. Verwijderen van water uit de cel zeef en microcryogels verzamelen in één cluster per cel zeef en plaats een cluster in een 35-mm petrischaal met behulp van een gebogen pincetten. Voeg 50-70 µL gedeïoniseerd water om elk cluster en betrekking hebben op het deksel van de petrischaal. Tik zachtjes op de petrischaal op het tafelblad te nivelleren van alle microcryogels, zodat geen microcryogels liggen bovenop een andere microcryogel om te vormen van een monolayer van microcryogels op het oppervlak van de petrischaal.
   De geoogste microcryogels bij-20 ° C gedurende 4 tot en met 16 h bevriezen
   8. voordat lyofilisering hen voor 2 h (zie stap 1.2.7). Microcryogels in een vacuüm bij kamertemperatuur bewaren tot verdere gebruik.
2. Karakterisering van microcryogels
   1. de poriën van de microcryogels door het scannen van elektronen microscoop (SEM) imaging evalueren.
      1. Immobilize de geoogste en gelyofiliseerd microcryogels op een monsterhouder door dubbele-side plakband en vacht met goud met een sputter coater voor 90 s, voor beeldvorming door SEM ¹¹. Evalueren en analyseren van de verdeling van de diameter van de poriën in de microcryogel uit zeven verschillende SEM beelden met behulp van de software van de analyse van de afbeelding.
   2. Een cluster van 600 gelyofiliseerd microcryogels wegen in een petrischaal 35-mm voor het gewicht van de gelatine van de gedroogde microcryogels (GMs). 60 µL gedeïoniseerd water toevoegen aan het cluster van gelyofiliseerd microcryogels en wacht 30 s voor microcryogels volledig water absorberen en zwellen. Weeg de gezwollen microcryogels.
      1. Bepalen het evenwicht zwelling ratio en porositeit van microcryogels, als de verhouding van het gewicht van gezwollen microcryogels gedroogde gelatine microcryogels en de verhouding van gewicht gehouden water in microcryogels met die van gehydrateerde microcryogels, respectievelijk ¹³.
   3. Maatregel injectiecapaciteit van microcryogels met behulp van een programmeerbare-spuitpomp geïntegreerd met een digitale force gauge ¹⁴.
      1. Vlek 600 stukken van microcryogels door Trypan blauwe en schorten in 600 µL 15% gelatine oplossing om homogene verdeling te bereiken. Laden 1 mL microcryogel suspensie in 1 mL spuit. Injecteer het mengsel door een 27-gauge naald gekoppeld aan de 1 mL spuit met behulp van een programmeerbare-spuitpomp op debiet van 1 mL/min.
      2. Monitor real-time injectie geweld door digital force gauge testen en uitzetten van de kracht-tijd-curve. Na injectie, observeren de integriteit van microcryogels onder een microscoop.
         Opmerking: GMs geschorst in 15% (wt/vol) gelatine oplossing kunnen worden soepel geïnjecteerd en intact gebleven na injectie.
   4. Karakteriseren de afbreekbaarheid van microcryogels.
      1. Eerste, het gewicht van één cluster van 600 gelyofiliseerd microcryogels in een petrischaal 35-mm als het droge gewicht meten. Dan, dompel 600 gelyofiliseerd microcryogels in 2 mL 0,025% (vol/vol) trypsine/EDTA.
      2. Collect microcryogels uit de oplossing met behulp van een cel zeef op verschillende tijdstippen (dat wil zeggen, 10, 20, 30, 40, 50, 60 en 70 min). Wick weg overtollige oplossing met een tissue. Het gewicht van de microcryogels op verschillende tijdstippen te meten en berekenen van de graad van aantasting, als de verhouding van het gewicht van de microcryogel op een bepaald punt van de tijd aan die van de microcryogel op moment nul.
3. Autoloading van cellen in microcryogels aan vorm 3D microtissues
   1. microcryogels uit stap 2.1.8 door ethyleen oxide sterilisatie systeem met 12 h gas blootstelling gevolgd door 12 h ontgassing onder vac steriliserenuum.
   2. Kies menselijke adipeus afkomstige mesenchymale stromale cellen (hMSCs) voor behandeling van muis ischemische stuk. Isoleren cellen door na procedures zoals eerder gemeld ¹⁸.
   3. HMSCs van de cultuur in de groei medium met 2% foetale runderserum (FBS) 10 ng/mL epidermale groeifactor (EGF), 10 ng/mL bloedplaatjes afkomstige groei factor bb (PDGF-bb), 1 X insuline transferrine selenium (ITS), 10 ^-8 M dexamethason, 10 ^-4 M ascorbinezuur 2-fosfaat, 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine in DMEM/F12. Passage van de cellen in de verhouding 1:3 wanneer confluent. Cellen van passage 3 tot en met 5 in de volgende experimenten gebruiken.
   4. HMSCs met trypsine oogsten en kwantificeren van het nummer van de cel met behulp van een Fuchs-Rosenthal tellen kamer en resuspendeer met een dichtheid van 8 x 10 ⁶ cellen/mL in hMSCs groeimedium.
   5. Pipetteer 60 µL hMSCs vering op de enkelgelaagde van 600 microcryogels met diameter van 400 µm in een 35-mm schotel van punt 2.1. Cellen worden automatisch opgenomen in de poreuze micro-structuren van de microcryogels.
   6. Behouden in een bevochtigde kamer en Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur om cellen te koppelen. Na 2 uur incubatie, voeg toe 2 mL gestolde voedingsbodem. Wijzig het medium om de 2 dagen. Cultuur hMSCs-geladen microcryogels voor 2 dagen om te vormen van de 3D microtissues.
   7. Na 2 dagen kweken, Pipetteer 100 hMSCs-geladen microcryogels per putje op een 96-wells-plaat, voeg 120 µL van resazurin werkende oplossing bereid volgens de fabrikant ' s instructie in elk putje. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C.
      1. Analyse fluorescentie van resazurin gemetaboliseerd door levensvatbare cellen in een microplate-lezer met een licht golflengte van excitatie van 560 nm en uitstoot licht golflengte van 590 nm. Een standaard curve van celaantal vs. fluorescentie met behulp van hMSCs om te interpoleren celaantal van intensiteit van de fluorescentie voor toekomstige experiment volgens de kit protocol ¹³.
   8. Beoordelen van aantal hMSCs in microcryogels vanaf dag 0 op dag 4 gebruik van resazurin zoals beschreven in stap 2.3.7 vanaf dag 0 op dag 4.
   9. Cellen in microcryogels met 1:500 verdunning van calceïne AM en verdunning van de 1:250 van Propidium jodide (bekend als live/dead kleuring) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) vlekken en observeren onder fluorescentie Microscoop of confocal fluorescentie Microscoop.
4. Injectie van 3D microtissues in vivo voor behandeling van CLI in muismodel
   1. stellen kritische stuk ischemie van vrouwelijke BALB/c naakt muizen als gerapporteerde ^{11 , 19} tot het vaststellen van het therapeutische effect van 3D microtissue gebaseerde therapie.
   2. De microtissues van stap 2.3.6 met behulp van een 5 mL-pipet in een cel zeef overboeken en filteren weg het kweekmedium.
   3. De hMSCs-geladen 3D microtissues in 15% gelatine oplossing, bij een dichtheid van 100 microcryogels per 100 µL oplossing resuspendeer.
   4. Voor de operatie, chirurgische instrumenten door autoclaaf steriliseren en chirurgie uit te voeren in een dierlijke operatiekamer in een dier faciliteit Center.
   5. Plaatst u de muisaanwijzer in de anesthesie inductie cupje met 1-3% Isofluraan in 100% zuurstof op een debiet van 1 L/min. toepassen erytromycine op de ogen van de muis om te voorkomen dat het drogen. Door een 1 cm-durende huid incisie, afbinden de femorale slagader en zijn takken met 5-10 zijde hechtingen en accijnzen ¹⁹.
   6. Inject indocyanine groen (ICG) (0,1 mL van 100 µg/mL) via de staart veneuze injectie bloed informatiestromen. Uitvoeren van ICG fluorescentie beeldvorming met behulp van een fluorescentie imaging systeem (hier, zelfgemaakte systeem) in de reflectiecoëfficiënt geometrie ¹¹.
   7. Microtissues intramuscularly injecteren in drie locaties van de spier gracilis rond de insnijding van de slagader met behulp van een injectiespuit 1 mL met een naald 23-gauge.
   8. Na de operatie, houd de muis warm met een verwarmde zeem in de kooi van herstel. Injecteren subcutaan meloxicam om te verlichten van de pijn en volgen voortdurend totdat wakker.
   9. Na 28 dagen, controleren de therapeutische werking van 3D microtissue-behandelde ledematen door fluorescentie imaging ¹¹.
      Opmerking: Injecteren subcutaan meloxicam voor het verlichten van de pijn toen de muis spontane ledemaat amputatie toonde.
   10. Euthanaseren muizen met kooldioxide na voltooiing van de experimenten.
       Opmerking: Hier, euthanasie met kooldioxide werd uitgevoerd volgens een strikt protocol goedgekeurd door de ethische commissie van dier op het Center of Biomedical Analysis, Tsinghua Universiteit.

3. Vergadering van de Microtissue matrix Chip voor High-throughput Drug Screening

1. assemblage van microcryogel matrix op de chip celkweek
   1. wijzigen het ontwerp in sectie 1.1 volgens conventionele multi goed plaat afmetingen, dat wil zeggen, voor 384-multi-goed formaat, het ontwerpen van een array van 16 × 24 wells (rij per kolom), elk 2 mm diameter en 4.5 mm afstand van de centrum-naar-midden.
   2. Laser graveren op een 500 µm dik PMMA plaat zoals beschreven in sectie 1.1.
   3. Fabricate microcryogels zoals wordt beschreven in punt 1.2 die de 384-multi-well matrix chip verkregen stap 3.1.2. Deze microcryogel-bevattende array wordt aangewezen als de chip van de matrix microcryogel.
   4. De microcryogel matrix chip wassen met 50 mL 0,1 M NaBH ₄ om alle resterende aldehyde quench uncross-gekoppeld, vervolgens herhaaldelijk spoelen met 50 mL gedeïoniseerd water voor 3 keer, 2 h telkens.
   5. Negeren van het water, de microcryogel matrix chip bij-20 ° C gedurende 4 tot en met 16 h bevriezen voordat lyofilisering volgens stap 1.2.7.
   6. Wijzigen de 384-multi-goed ontwerp van de matrix in stap 3.1.1 bevat 16 × 24 wells, elk 3 mm diameter en 4.5 mm afstand van de centrum-naar-midden.
   7. Verwijderen van één kant van de steun van een blad van ultradunne (10 µm) biocompatibel dubbelzijdige plakband en plak deze aan één kant van een stuk van 3 mm dik-PMMA blad. Laser graveren het ontwerp uit stap 3.1.4 op deze 3-mm dik PMMA vel overeenkomstig punt 1.1. Deze array wordt aangewezen als de matrix reservoir.
   8. Uitlijnen de matrix microcryogel chip met de reservoir matrix chip en houden elkaar strak te monteren van de 3D microcryogel matrix chip voor op de chip celkweek. Steriliseren door ultraviolette straling voor 1 h.
   9. Store 3D microcryogel matrix chips in vacuüm bij kamertemperatuur voor verdere experimenten.
2. Drug screening op 3D microtissue arrays
   1. een natte doos met 25 mL steriele-geïoniseerd water om te dienen als een kamer vochtigheid voor cultuur van de cel opvullen. Pre warmte in een bevochtigde 5% CO ₂ incubator tot 37 ° C.
   2. Oogst niet-kleincellige longkanker kankercellen (NCI-H460) en hepatocellulaire carcinoom cellen (HepG2) uit de weefselkweek platen volgens standaard protocol en resuspendeer in voedingsbodems met een definitieve dichtheid van 1,0 x 10 ⁶ cellen/mL. Meng.
      Opmerking: RPM1640 met 10% FBS, 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine wordt gebruikt voor NCI-H460. DMEM met 10% FBS, 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine gebruiken voor HepG2.
   3. Verwijder de kamer vochtigheid van incubator. Pincet kunt door zorgvuldig plaats de geassembleerde 3D microcryogel matrix chip uit stap 3.1.9 in de kamer vochtigheid. Voorzichtigheid niet te nat de microcryogels met water in de kamer nemen.
   4. De celsuspensie Meng grondig, dan aliquoot 3 µL celsuspensie direct op de microcryogel in elk putje.
      Opmerking: Het uiteinde van de pipet moet licht het oppervlak van de microcryogel raken voordat het verdrijven van de celsuspensie. Cellen zijn in de microcryogel door opslorping auto-geladen. Doen niet het zaad van cellen in het perifere putjes.
   5. Voeg toe 10 μL van media aan elk putje nadat cellen worden overgeënt in microcryogel met behulp van meerkanaals precisiepipet, zoals een vloeibare handler van 96-kanaal. Medium wordt ook toegevoegd aan de perifere putjes.
      Opmerking: Gebruik RPM1640 media met 10% FBS, 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycin voor H460 cellen. DMEM media gebruiken met 10% FBS, 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine voor HepaG2 cellen.
   6. Cultuur de cel-geladen microcryogel array chip in de zaal van de vochtigheid gedurende 24 uur in een bevochtigde 5% CO ₂ incubator bij 37 ° C aan formulier 3D microtissue array.
   7. Los Doxorubicine en IMMLG-8439 ⁹ in dimethylsulfoxide (DMSO) om te vormen van een stamoplossing van 10 mM. Verdun drugs met gestolde voedingsbodem te vormen van een gradiënt van de concentratie 10-fold verdunning van 2 nM tot 200 µM.
   8. Voeg toe 10 µL van drug oplossingen in elk goed. 0,1% DMSO (verdund op medium) als het besturingselement gebruiken. Incubeer de drug geladen 3D microtissue array in een bevochtigde 5% CO ₂ incubator bij 37 ° C voor 24 h.
   9. Toevoegen 4 µL van stockoplossing van het resazurin aan elk putje. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 h. plaats de 3D microtissue matrix in de microplate-lezer en detecteren van fluorescentie van resazurin gemetaboliseerd door levensvatbare cellen bij een licht golflengte van excitatie van 560 nm en uitstoot licht golflengte van 590 nm.
   10. Aftrekken het signaal van de basislijn resazurin van alle putjes vóór verdere verwerking van de gegevens. Berekenen van de cel levensvatbaarheid Fractie van elk putje door te delen zijn fluorescentie-signaal door het signaal van de gemiddelde fluorescentie van de controleputjes.
   11. Plot de dosis-responscurve in plotting software met de cel levensvatbaarheid breuk als de y-as en de base 10 logaritme van de concentratie van het geneesmiddel als de x-as. Interpoleren van de concentratie van 50% remming (IC50) voor de cel levensvatbaarheid Fractie van 0,5.

Resultaten

Fabricage en karakterisering van microcryogels voor de vorming van de 3D microtissue.

Volgens dit protocol, microcryogels werden vervaardigd vorm de 3D microtissues en individuele microcryogels of microcryogel arrays en werden toegepast op de regeneratieve therapie en drug screening, respectievelijk (Figuur 1). Microstencil matrix chips vervaardigd uit PMMA waren toegepast als micro...

Discussie

Regeneratieve geneeskunde en in vitro modellen voor drug screening zijn twee belangrijke toepassingen voor weefsel engineering^5,6,7,8,9. Terwijl deze twee toepassingen enorm verschillende behoeften hebben, ligt een gemeenschappelijke grond tussen hen in de noodzaak van een meer biomimetische culturing voorwaarde te verbeteren cel functies

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Gelatin	sigma	G7041	Alle andere reagentia zijn gekocht van Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), tenzij anders aangegeven.
Glutaraldehyde	J&K	902042	Gebruikt als verbindingsmiddel bij de bereiding van materiaal.
Glazen deksel (24 x 50 mm)	CITOGLASS, China	10212450C	Om de precursor-oplossing op microstencils-array-chips te schrapen.
Natrium borohydride, NaBH4	Beijing Chemical Works	116-8	Om overgebleven glutaraldehyde weg te spoelen na gelering.
Vacuumpot	asperts, China	VC8130	Om microgels onder vacuüm te bewaren.
Polymethylmethacrylaat (PMMA) platen	Sunjin Electronics Co., Ltd, China		Gewone PMMA platen.
Rayjet lasersysteem	Rayjet, Australië	Rayjet 50 C30	Om PMMA platen te graveren om putjes te vormen.
Plasma Cleaner	Mycro Technologies, VS	PDC-32G	Om PMMA hydrofiel te maken.
Lyofilisaat	Boyikang, China	SC21CL	Om materialen te lyofiliseren.
Trypan Blue-oplossing (0,4%)	Zhongkekeao, China	DA0065	Om microgels te kleuren.
Doxorubicinehydrochloride	ENERGY CHEMICAL, China	A01E0801360010	Om de resistentie van cellen tegen geneesmiddelen in 2D of 3D microgel te testen.
Live/dead assay	Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan)	CS01-10	Om levende en dode cellen te onderscheiden.
Cell Titer-Blue	Promega (Wisconsin, VS).	G8080	Om de levensvatbaarheid van cellen te testen.
Celfilter	BD Biosciences, VS	352360	Om microgels te verzamelen.
D-Luciferine	SYNCHEM (Duitsland)	s039	Om cellen te traceren.
Scanning elektronenmicroscoop	FEI, VS	Quanta 200	Om de morfologie van microgels te karakteriseren.
Mechanische testmachine	Bose, VS	3230	Om mechanische eigenschappen te meten.
Programmeerbare spuitpomp	World Precision Instruments, VS	ALADINI 1000	Om injecteerbaarheid te testen.
Digitale krachtmeter	HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China	H-50	Om injecteerbaarheid te testen.
Ethyleenoxide sterilisatiesysteem	Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC	AN74i	Om microgels te steriliseren met ethyleenoxidegas.
Microplaatlezer	Molecular Devices, VS	M5	Om de fluorescentie-intensiteit in micro-array te meten.
Confocale microscoop	Nikon, Japan	A1Rsi	Om celverdeling in 3D te observeren.
Xenogen  Lumina II beeldvormingssysteem	Caliper Life Sciences, VS	IVIS	Om cellen in dieren te volgen.
Vloeibare werkstatie	Apricot design, VS	S-pipette	Om medium of celsuspensie met hoge doorvoer te laden.