Evaluatie van ruimtelijke geheugenvermindering in een muismodel van traumatische hersenletsel met behulp van een radiaal waterdierdool

Summary

Hier presenteren we een protocol voor een muisspecifieke test van cognitie die geen zwem nodig heeft. Deze test kan gebruikt worden om succesvol gecontroleerde corticale impact-geïnduceerde traumatische hersenletselmuizen te onderscheiden van sham-controles.

Abstract

Ondanks de recente toename van het gebruik van muismodellen in wetenschappelijk onderzoek, blijven de onderzoekers cognitieve taken die oorspronkelijk werden ontworpen en gevalideerd voor het gebruik van ratten, gebruiken. De röntgenproef van het radiale waterloop (RWT) van ruimtelijk geheugen (speciaal ontworpen voor muizen die geen zwemmen vereist) is eerder aangetoond om succesvol te onderscheiden tussen gecontroleerde corticale impact geïnduceerde TBI muizen en sham controles. Hier wordt een gedetailleerd protocol voor deze taak gepresenteerd. Het RWT-doolhof onderscheidt zich van de natuurlijke neiging van muizen om open gebieden te voorkomen ten behoeve van de kanten van een apparaat (thigmotaxis). De muren van het doolhof zijn bekleed met negen ontsnappingsgaten geplaatst boven de vloer van het apparaat, en muizen worden getraind om visuele aanwijzingen te gebruiken om het ontsnappingsgat dat uit het doolhof leidt te lokaliseren. Het doolhof is gevuld met een centimeter koud water, voldoende om te ontsnappen, maar niet diep genoeg om de muis te zwemmen. De acquisitieperiode duurt slechts vier trainingenDagen met een test van geheugenretentie op dag vijf en een langdurige geheugentest op dag 12. De resultaten die hier worden gerapporteerd suggereren dat het RWT labyrint een haalbaar alternatief is voor rat-valideerde, zwemgebaseerde cognitieve tests in de beoordeling van ruimtelijk Geheugentekorten in muismodellen van TBI.

Introduction

Geheugeneffecten behoren tot de meest voorkomende symptomen die door patiënten zijn gemeld bij traumatische hersenletsel (TBI) ^{1 , 2} . Een nauwkeurige identificatie en beoordeling van analoge geheugendefecten in diermodellen van TBI zijn daarom van essentieel belang voor ons begrip van deze voorwaarde en het beheer daarvan. Hier presenteren wij een protocol voor het testen van ruimtelijk geheugen in een muismodel van TBI met behulp van een Radial Water Tread (RWT) labyrint. Dit toestel werd eerder getoond om cognitieve tekorten in muismodellen van gecontroleerde corticale impact (CCI) geïnduceerde TBI ^{3 te beoordelen} en is een mogelijk alternatief voor rat-validated, zwemgebaseerde testen van cognitie.

De groeiende diversiteit en beschikbaarheid van transgene muismodellen heeft geleid tot een recente toename van het gebruik van muizen boven ratten in wetenschappelijk onderzoek ⁴ . Ondanks deze verschuiving blijven onderzoekers vertrouwen op gedrag aEn cognitieve taken die oorspronkelijk werden ontworpen en gevalideerd voor ratgebruik. De meest voorkomende testen die momenteel worden gebruikt om cognitie in muizen te beoordelen, het Morris Water Maze (MWM) en het circulaire doolhof Barnes, werden speciaal ontworpen om te profiteren van instinct gedrag in ratten ^{5 , 6} . Gezien de genetische, neuroethologische en cognitieve verschillen die tussen deze twee soorten ^{4 bestaan} , is het niet verrassend dat muizen consequent onderpresteren op deze taken ^{7 , 8} .

Soortafhankelijke verschillen in testvermogen zijn vooral van toepassing op zwemgebaseerde cognitieve tests, zoals de MWM. Terwijl zowel ratten als muizen zware zwemmers zijn, hebben onderzoekers verschillende muisstammen geïdentificeerd die opmerkelijk slecht presteren op zwemgebonden cognitieve taken ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13} . Zelfs bij wilde dieren, ratten meestal beter dan muizen ^{7 , 8} . Terwijl dit zou kunnen worden geïnterpreteerd als een soortspecifiek verschil in ruimtelijk geheugen, bleken analoge follow-up testen met behulp van een droogland doolhof geen speciesafhankelijke verschillen in cognitieve prestaties ⁸ . Een aantal factoren die niet verband houden met cognitie, kunnen rekening houden met deze bevinding, met inbegrip van soortenafhankelijke verschillen in zwemvermogen of zoekstrategie. Faktoranalyse van muisspecifieke zoekstrategieën in de MWM laat zien dat noncognitieve factoren (in het bijzonder thigomotaxis en passiviteit [ dwz drijvende]) een belangrijker rol in MWM-prestaties kunnen spelen dan ruimtelijk leren ¹⁴ .

Hier demonstreert we het gebruik van een cognitieve test die ontworpen is om te kapitaliseren op de inStinctueel gedrag van muizen, en die geen zwem nodig heeft, om ruimtelijke geheugenvermindering in een muismodel van CCI geïnduceerde TBI te meten. Terwijl het RWT labyrint ( Figuur 1 A-B ) werd opgevat als een nieuwe hybride van het MWM en Barnes circulaire doolhof, werd het specifiek ontworpen om het thigmotactische gedrag instinctueel te gebruiken voor muizen ^{15 , 16} . Het apparaat bestaat uit een 32 mm diameter gegalvaniseerde stalen buis waarin negen evenwijdig verdeelde uitgangsgaten verveeld zijn. De gaten zijn 2-1 / 4 centimeter boven de vloer van de badkuip en zijn afmeting om in de algemeen beschikbare 1-1 / 2 inch ABS DWV SPG x SJ-trapadapters te passen. Acht van de uitgangen zijn van buiten afgedekt en verblind tot een diepte van 1 inch met rubberen stopjes. De negende is verbonden door een 90 ° acrylonitril-butadieenstyreen (ABS) -leugel tot een ondoorzichtige plastic doos, waaruit de muis makkelijk verwijderd kan worden na het testen. In de loop van eenKorte verwervingsperiode, de muis is getraind om de unieke visuele signalen te gebruiken die het labyrint voegen om deze ontsnappingsdoos te vinden. Tijdens het testen wordt het doolhof gevuld met een duim koud water (12-14 ° C), voldoende genoeg om ontsnappen te bevorderen, maar niet zo diep dat de muis moet zwemmen.

Het RWT-labyrint is een goedkoop alternatief voor lage kosten, met weinig onderhoud voor de MWM, en is succesvol gebruikt in 15-jarige en transgene muizen ^{15 , 17 , 18 , 19} en CCI-geïnduceerde muismodellen van TBI ³ . Het hier beschreven protocol staat voor een eenvoudige en effectieve methode voor het meten van ruimtelijke geheugenstoornis die geen training voor voorwonden vereist, en kan gemakkelijk worden aangepast aan de specifieke behoeften van een onderzoekslaboratorium.

Protocol

Alle procedures en dierhantering zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor dierenwelzijn die door de National Institutes of Health en door de Universiteit van Washington Animal Care and Use Committee zijn uitgegeven.

1. Chirurgie

1. Verdoof de muis bij 5% isofluraan in een inductiebox tot bewusteloos. Bevestig de verdoving door een vermindering van de ademhalingssnelheid en de afwezigheid van een terugtrekkingsreflex als gevolg van de teenspanning.
2. Onderhoud van anesthesie via neuskegel bij 2-2,5% gedurende de operatie. Bewaar de ademhaling tijdens de operatie om ervoor te zorgen dat de muis onbewust blijft.
3. Plaats de muis op een verwarmingspaneel en plaats de muis in het stereotactische apparaat met behulp van oorbouten, zodat de kop veilig en plat is.
4. Verwijder haar uit de hoofdhuid met behulp van haarverwijderingsroom. Spoel de hoofdhuid grondig af met zoutoplossing.
5. Maak de chirurgische plaats schoon met een alternerende jodium en 70% ethanolwas.
6. AdministeRa subcutane injectie van Lidocaïne en Bupivacaine (1 mg / kg) bij de hoofdhuid.
7. Met een chirurgische schaar, maak een longitudinale middenlijn incisie en trek de huid terug om de schedel te onthullen.
8. Met een 5 mm trefijnzaag preform een ​​craniotomie over de linker frontoparietale cortex met middelpunt op 2,5 mm achter bregma en 2,5 mm links van de middenlijn. Verwijder de cirkel van het been zorgvuldig om de hersenen bloot te leggen.
9. Stel de slaginrichting in op een snelheid van 6 m / s en 200 ms verblijftijd.
10. Plaats het schakelapparaat totdat de 3 mm convexe stootpunt het oppervlak van de hersenen licht aanraakt, 2,5 mm achter de bregma en 2,55 mm links van de middenlijn. Trek de slagpunt terug, en verlaag met 1 mm (slagdiepte). Als u klaar bent, brand het apparaat en genereer de gewenste impact.
11. Bedek de craniotomie met een steriele polypropyleenschijf die met derma is gecementeerd met weefselkleefmiddel en sutureer de incisie gesloten.
12. Verwijder de muis van verdoving, en geef IP-injectie van BuprEnormphine (0,5 mg / kg).
13. Laat de muis in een schone kooi verhogen, verwarmd door een verwarmingskussen. De muis moet worden gecontroleerd op tekenen van pijn of nood in de komende 24 uur.
    OPMERKING: Sham controles moeten dezelfde behandeling krijgen als hierboven, met stappen 1.8-1.9 weggelaten.

2. Radial Water Tread Maze Construction

1. Boor 9 uitlaatgaten, groot genoeg om 1-1 / 2 inch ABS DWV SPG x SJ-trapadapters op te nemen, met gelijke intervallen rond de omtrek van een 32 inch diameter gegalvaniseerde stalen buis. Midden deze afvoergaten ongeveer 2-1 / 4 inch boven de vloer van het bad.
2. Monteer een 1-1 / 2 inch ABS DWV SPG x SJ-stopadapter in elk van de uitgangsgaten en beveilig met de meegeleverde ringmoeren.
3. Met rubberen stoppen gaat het hoofd uit acht van de negen uit de buitenkant van het apparaat. De laatste, onafgebroken afslag zal dienen als de ontsnappingsroute. Het maakt niet uit welke uitgang is aangewezen als de ontsnappingsroute.
4. Bevestig een 90 ° ABSElleboog naar het buitenkant van de overgebleven afslag. De 90 ° bocht dient te voorkomen dat proefpersonen visueel de juiste ontsnappingsroute vanuit het doolhof bepalen.
5. Construeer de ontsnappingsbox uit een ondoorzichtige doos die in staat is om te saniteren en ongeveer 30 cm x 15 cm x 15 cm groot. Knip een gat aan de zijkant van de doos, direct boven de vloer, groot genoeg om een ​​90 ° ABS-elleboog te halen.
6. Bevestig de ontsnappingsdoos aan het uiteinde van de 90 ° ABS-elleboog.
7. Verhoog de ontsnappingsbox (minder dan 1 inch) iets boven het oppervlak van de vloer. Dit zorgt voor voldoende ruimte voor een elektrische verwarmingspaneel of andere verwarmingsbron, die onder de ontsnappingsdoos geplaatst moet worden.
8. Print en laminaat minstens 5 unieke, visuele cues. Gebruik eenvoudige, hoge contrastbeelden die gemakkelijk uit het apparaat kunnen worden onderscheiden. Zwart-witte clipartvormen (driehoek, vierkant, cirkel) worden aanbevolen.
9. Gebruik magneten, plak de visuele leidingen aan de binnenmuren van deinrichting. Cues moeten ongeveer gelijk zijn aan de afstand tussen de omtrek van het apparaat.

3. Radial Water Tread Maze Protocol

OPMERKING: Het testen van het waterdool moet pas beginnen nadat de chirurgische plaats is genezen (ongeveer een week na de operatie).

1. Voorbereiden voor het testen.
   1. Laat muizen toe gedurende tenminste 30 minuten aan de testkamer te acclimatiseren alvorens te testen.
   2. Sanitiseer het apparaat met behulp van een 70% ethanolspray.
   3. Vul het apparaat met ongeveer 1 inch koud water (12-14 ° C).
   4. Plaats een elektrische verwarmingskussen of andere verwarmingsbron, direct onder de ontsnappingsdoos. Houd de ontsnappingsbox donker en warm gedurende de duur van het testen.
   5. Plaats een heldere lichtbron over het apparaat.
      OPMERKING: als u een lamp gebruikt die zichtbaar is voor onderzoeksdieren van het apparaat zelf, moet u ervoor zorgen dat de lamp in dezelfde poort wordt geplaatstElke dag. De lamp zelf kan een andere visuele cue voor de muizen vertegenwoordigen om te gebruiken om de ontsnappingsdoos te lokaliseren, en het kan daadwerkelijk drastisch worden verplaatst.
2. Protocol toetsen
   1. Verwijder de muis van de kooi voorzichtig door de staart en plaats in het midden van het apparaat.
   2. Zodra het dier in het apparaat zit, begin het timing.
   3. Zodra het dier de juiste uitgang heeft gevonden en het ontsnappingsvak heeft gevonden / ingevoerd, stop dan timing en record het aantal seconden dat nodig is om het juiste pad te vinden.
   4. Als het dier probeert te klimmen in een eindgat en niet na 10 s spontaan het labyrint herstelt, leidt het dier met het hand naar het midden van het doolhof.
   5. Als het dier niet binnen 3 minuten (180 s) het juiste pad naar de ontsnappingsbox vindt, scoor het proces als een fout en record als 180 s. Leid het dier voorzichtig naar het juiste pad met de hand.
   6. Laat deMuis om in de ontsnappingsbox te blijven voor een 1 minuten, tussen-proef rust.
   7. Zodra de 1 min rust is geslaagd, verwijder het dier uit de ontsnappingsbox en keer terug naar zijn huiskooi.
   8. Maak de ontsnappingsbox grondig schoon en verlaat met een 70% ethanolspray om te voorkomen dat de muis olfactorische leidingen gebruikt om de juiste ontsnappingsroute te vinden. Deze stap moet maximaal enkele seconden duren.
   9. Ga de muis terug naar het doolhof voor de volgende proef.
   10. Herhaal stappen 3.2.1-3.2.9 totdat de muis in totaal drie proeven heeft afgerond, en hetzij drie keer naar de ontsnappingsbox is geleid of geleverd.
   11. Na de laatste 1 minuten rust, ga de muis terug naar zijn huiskooi.
   12. Drain en vervang het water in het apparaat tussen dieren om de consistente temperatuur tijdens het testen te waarborgen.
   13. Herhaal stappen 3.2.1-3.2.12 voor elke muis die moet worden getest.
   14. Herhaal de voorbereidende stappen op de volgende dag 3.2.1-3.2.5. Wees voorzichtig om ervoor te zorgen dat visuele aanwijzingen blijvenIn consistente posities tussen testdagen.
   15. Test dieren met behulp van het bovenstaande dagelijkse testprotocol voor drie proeven per dag voor vier dagen (trainingsperiode), met een laatste drie-proeftest voor geheugenbehoud op de vijfde dag. Een zesde trial trial (Long Term Memory Retention) kan op dag twaalf worden gegeven.
   16. Voer geen tests uit tussen testdagen vijf en twaalf.
3. Analyse
   1. Als een muis het doolhof niet binnen 180 seconden voltooit in een periode van twee dagen ( dwz een totaal van 6 opeenvolgende tests, die allemaal op 180 s zijn behaald), beschouw de muis onvoldoende door de testomstandigheden gemotiveerd en verwijder ze uit de analyse.
   2. Bereken de gemiddelde latentie om het doolhof voor elk onderwerp te voltooien door de datum te testen door hun drie dagelijkse proeven te berekenen voor die dag.
   3. Verkrijg groepsverschillen in geheugenretentie met behulp van standaard t-tests om groepen te vergelijken bij de vijfde-dag test en de langetermijn geheugen testdatum. Als mEr worden ertsen vergeleken met twee groepen, één-weg-ANOVA gevolgd door een passende post-hoc analyse (zoals Tukey's test) om op te volgen welke significantie verkregen moet in plaats daarvan worden gebruikt.
   4. Verkrijg groepsverschillen in de acquisitieperiode (dagen 1-4) via herhaalde meetanalyse van variantie.

Results

De RWT labyrint ( Figuur 1 ) werd gebruikt om schade-afhankelijke ruimtelijke geheugen tekorten te onderzoeken in muizen die willekeurig toegewezen waren om een ​​gecontroleerde corticale impact geïnduceerde TBI of sham operatie te ontvangen. Het letsel werd gegenereerd met behulp van een magnetisch aangedreven corticale impact met een 3 mm convexe punt en de volgende schadeparameters: 6 m / s slagsnelheid, 1 mm diepte penetratie en 200 ms contacttijd. ...

Discussion

Het hier gepresenteerde RWT labyrintprotocol onderscheidt zich succesvol tussen CCI-geïnduceerde TBI muizen en sham controls, en vertegenwoordigt een haalbaar, muis-centraal alternatief voor het MWM en Barnes circulaire labyrint. Terwijl de hier beschreven resultaten alleen spreken over het gebruik van het RWT-labyrint in een TBI-muismodel, is dit apparaat succesvol gebruikt in oudere en transgene modellen, waarbij stress-geïnduceerde noncompliance als gevolg van zwemgebaseerde tests gemaakt met behulp van de MWM onpr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 Gal. Hot Dipped Steel Round Tub	Home Depot	Internet #206638142	Benodigd: 1
1-1/2 in. ABS DWV SPG x SJ Trap Adapter	Home Depot	Internet #100344703, Store SKU #188956	Benodigd: 9
1-3/4 in. x 1-7/16 in. Black Rubber Stopper	Home Depot	Internet #100114974 Store SKU #755844	Benodigd: 8
1-1/2 in. ABS DWV 90 Degree Hub x Hub Elbow	Home Depot	Internet #100346663 Store SKU #188603	Benodigd: 1
HDX 10 Gal. Storage Tote	Home Depot	Internet #202523587 Store SKU #258804 Store SO SKU #258804	Benodigd: 1
Impact One Stereotaxic Impactor for CCI	Leica Biosystems	39463920	Benodigd: 1
Vernier Stereotaxic w/ Manual Fine Drive Stereotaxic Instrument for Small Animals	Leica Biosystems	39463001	Benodigd: 1