Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Chondrogenische Pelletvorming van Koord Bloed afgeleide geïnduceerde Pluripotente Stamcellen

10.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55988

⸱

19 juni 2017

 ,  , 
1CiSTEM Laboratory, Convergent Research Consortium for Immunologic Disease, Division of Rheumatology, Seoul St. Mary's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 2Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine, Seoul St. Mary's Hospital, Institute of Medical Science, College of Medicine, The Catholic University of Korea

In dit artikel

Samenvatting

Hier stellen wij een protocol voor chondrogenische differentiatie voor van bloedbloedmononucleaire cellen afgeleide door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Samenvatting

Menselijke kraakbeen ontbreekt aan het vermogen zich te herstellen. De degeneratie van kraakbeen wordt dus niet behandeld door curatieve maar door conservatieve behandelingen. Momenteel worden inspanningen gedaan om beschadigd kraakbeen te regenereer met ex vivo geëxpandeerde chondrocyten of beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen (BMSC's). De beperkte levensvatbaarheid en instabiliteit van deze cellen beperken echter hun toepassing bij kraakbeenherstructurering. Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) hebben wetenschappelijke aandacht ontvangen als een nieuw alternatief voor regeneratieve toepassingen. Met onbeperkte zelfvernieuwingsvermogen en multipotency, zijn hiPSCs gemarkeerd als een nieuwe vervangende celbron voor kraakbeenherstel. Het verkrijgen van een hoge hoeveelheid chondrogeenpellets van hoge kwaliteit is echter een belangrijke uitdaging voor hun klinische toepassing. In deze studie hebben we embryoïde lichaams- (EB) -uitgevoerde uitgroeicellen gebruikt voor chondrogeen differentiatie. Succesvolle chondrogenese werd bevestigd door PCR anD vlekken met alcia blauw, toluidine blauw en antilichamen tegen respectievelijk collageen typen I en II (respectievelijk COL1A1 en COL2A1). Wij bieden een gedetailleerde methode voor de differentiatie van bloedmononucleaire cel afgeleide iPSCs (CBMC-hiPSCs) in chondrogeenpellets.

Inleiding

Het gebruik van hiPSC's vertegenwoordigt een nieuwe strategie voor drugscreening en mechanistische studies van diverse ziekten. Uit een regeneratief perspectief zijn hiPSCs ook een potentiële bron voor de vervanging van beschadigde weefsels die beperkte geneeskracht hebben, zoals articulair kraakbeen 1 , 2 .

De regeneratie van inheemse gewrichtskraakbeen is al enkele decennia een uitdaging geweest. Articulair kraakbeen is een zacht, wit weefsel dat het einde van de botten bekleedt, beschermt tegen wrijving. Het heeft echter beperkte regeneratieve capaciteit bij beschadiging, waardoor zelfherstel bijna onmogelijk is. Daarom is onderzoek gericht op kraakbeenregeneratie al enkele decennia doorlopend.

Vroeger werd in vitro differentiatie in de chondrogeen lijn meestal uitgevoerd met BMSC's of natieve chondrocyten die uit het kniegewricht 3 werden geïsoleerd. Wegens tO hun chondrogeenpotentieel, BMSC's en natieve chondrocyten hebben talrijke verdiensten die hun gebruik bij chondrogenese ondersteunen. Door hun beperkte expansie en instabiele fenotype worden deze cellen echter geconfronteerd met verschillende beperkingen bij de reconstructie van articulaire kraakbeenafwijkingen. Onder de in vitro- kweekomstandigheden hebben deze cellen de neiging om hun eigen karakteristieken na 3-4 passages te verliezen, wat uiteindelijk hun differentieringsvermogen beïnvloedt 4 . Ook bij nierlijke chondrocyten is extra schade aan het kniegewricht onvermijdelijk bij het verkrijgen van deze cellen.

In tegenstelling tot BMSC's of natieve chondrocyten kunnen hiPSCs onbepaald in vitro uitbreiden. Met de juiste cultuuromstandigheden hebben hiPSCs een groot potentieel als vervangende bron voor chondrogeen differentiatie. Het is echter uitdagend om de intrinsieke eigenschappen van hiPSCs 5 te wijzigen . Bovendien duurt het een aantal ingewikkelde in vitro stePs om het lot van hiPSCs naar een specifiek celtype te leiden. Ondanks deze complicaties, wordt het gebruik van hiPSCs nog steeds aanbevolen door hun hoge zelfvernieuwingsvermogen en hun capaciteit om te onderscheiden in gerichte cellen, waaronder chondrocyten 6 .

Chondrogene differentiatie wordt gewoonlijk gedaan met driedimensionale cultuursystemen, zoals de pelletkweek- of micromassa-cultuur, met behulp van MSC-achtige stamcellen. Als u hiPSC's gebruikt, verschilt het protocol voor het genereren van MSC-achtige stamcellen van de bestaande protocollen. Sommige groepen gebruiken een monolaagse cultuur van hiPSCs om het fenotype direct in MSC-achtige cellen 7 om te zetten . Echter, de meeste studies gebruiken EB's om opgroei cellen te genereren die lijken op MSCs 8 , 9 , 10 , 11 .

Verschillende soorten groeifactoren worden gebruikt om chondroge te veroorzakenNesis. Gewoonlijk worden BMP- en TGFβ-familieproteïnen, alleen of in combinatie gebruikt. Differentiatie is ook geïnduceerd met andere factoren, zoals GDF5, FGF2 en IGF1 12 , 13 , 14 , 15 . TGFβ1 is aangetoond dat chondrogenese op een dosisafhankelijke manier in MSCs 16 wordt gestimuleerd. In vergelijking met het andere isotype, TGFβ3 induceert TGFβ1 chondrogenese door de pre-kraakbeen mesenchymale cel condensatie te verhogen. TGFβ3 induceert chondrogenese door de mesenchymale cel proliferatie 17 aanzienlijk te verhogen. TGFβ3 wordt echter vaker gebruikt door onderzoekers dan TGFβ1 7 , 10 , 18 , 19 . BMP2 versterkt de expressie van genen gerelateerd aan de chondrogeen matrixcomponenten in het menselijkArticulaire chondrocyten onder in vitro condities 20 . BMP2 verhoogt de expressie van genen die kritiek zijn op kraakbeenvorming in MSC's in combinatie met TGFβ-eiwitten 21 . Het is ook aangetoond dat BMP2 het effect van TGFβ3 synergistisch verbetert via de Smad- en MAPK-pathways 22 .

In deze studie werden CBMC-hiPSC's geaggregeerd in EB's met behulp van EB-medium in een Petri-schotel met lage gehechtheid. Uitgroei cellen werden geïnduceerd door de EB's aan een gelatine gecoate schotel te bevestigen. Chondrogene differentiatie met behulp van uitgroeicellen werd uitgevoerd door pelletkweek. Behandeling met zowel BMP2 als TGFβ3 heeft de cellen succesvol gecondenseerd en geïnduceerde extracellulaire matrix (ECM) eiwit accumulatie voor chondrogeen pelletvorming. Deze studie suggereert een simpele, maar efficiënte chondrogene differentiatieprotocol met behulp van CBMC-hiPSCs.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol is goedgekeurd door het institutionele review board van de Katholieke Universiteit van Korea (KC12TISI0861). CBMC's die worden gebruikt voor herprogrammering, werden direct verkregen uit de Cord Blood Bank van het Seoel St. Mary's Hospital.

1. Chondrogeen Differentiatie van iPSCs

  1. CBMC-iPSC generatie
    1. Genereer CBMC-hiPSCs met behulp van het protocol dat is weergegeven in ons vorige werk 23 .
    2. Verzamel de bloedcellen in een 15 ml conische buis en tel ze met een hemocytometer.
    3. Bereid 3 x 10 5 cellen en centrifugeer ze gedurende 5 minuten bij 515 xg en RT. Verwijder de supernatant door zuigkracht en resuspendeer de cellen in 0,5 ml bloedcelmedium.
    4. Breng de cellen naar een putje van een niet-gecoate 24-putjesplaat en voeg het Sendai-virusmengsel toe volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
    5. Centrifugeer de plaat gedurende 30 minuten bij 1.150 xg en 30 ° C.
    6. achteruitCentrifugeren, incubeer de cellen gedurende een nacht (O / N) bij 37 ° C in 5% CO2.
    7. De volgende dag, overdragen de getransduceerde cellen naar een matrix beklede put. Centrifugeer de plaat bij 1,150 xg gedurende 30 minuten bij 30 ° C.
    8. Na centrifugeren, verwijder de supernatant, voeg 1 ml iPSC medium toe en houd de cellen O / N bij 37 ° C in 5% CO 2 .
    9. Houd de bijgeleverde cellen bij 37 ° C en 5% CO2 vast. Verander het medium dagelijks, vervang het met vers iPSC-medium.
      OPMERKING: Kolonies verschijnen op dag 14-21 na transductie.
  2. EB generatie
    1. Houd de hiPSCs bij 37 ° C en 5% CO 2 . Verander het medium dagelijks, vervang het met verse Essential 8 (E8) medium.
    2. Bereid 2 x 10 6 hiPSC's in een vitronectine gecoate, 100 mm schaal in E8 medium.
    3. Verwijder het E8-medium uit de kweekschotel en wassen met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    4. Voeg 1 toeMl 1 mM ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 gedurende 2 minuten.
    5. Oog de cellen met 3 ml E8-medium en breng ze over naar een nieuwe 15-ml conische buis. Centrifugeer de cellen bij 250 xg bij kamertemperatuur (RT) gedurende 2 minuten.
    6. Aspirateer de supernatant zonder de celpellet te storen en de cellen opnieuw te suspenderen in 5 ml E8-medium.
    7. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en berei 2 x 10 6 cellen voor elke 100 mm Petri schotel. Resuspendeer de bereide cellen in een 10 ml mengsel van E8 en EB medium (1: 1) met 10 μM rho geassocieerde kinase (ROCK) inhibitor.
    8. Incubeer de cellen O / N voor aggregatie bij 37 ° C en 5% CO2.
    9. Op de volgende dag, geoogst de geaggregeerde EB's door pipettering. Centrifugeer de cellen bij 250 xg gedurende 1 minuut. Verwijder de supernatant en resuspendeer de EB's in 10 ml vers E8 medium.
    10. Vergroot de gegenereerde EB's gedurende 5 dagen, met dagelijkse veranderingen met fresH E8 medium. Voor verdere rijping, verander het kweekmedium naar E7 medium. Houd de EB's bij 37 ° C en 5% CO 2 gedurende nog eens 5 dagen, en voer dagelijkse medium veranderingen uit met vers E7 medium.
      OPMERKING: E7 medium is E8 medium zonder FGF2.
  3. Uitgroei celinductie van EB's
    1. Voeg 6 ml 1% gelatine toe aan een 100 mm schaal en incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 gedurende 30 minuten.
    2. Verwijder de gelatine en droog de schotel volledig gedurende 2-3 uur voor gebruik.
    3. Breng de EB's over naar een 50 ml conische buis. Laat de EB's losmaken op de bodem van de conische buis. Verwijder de supernatant zonder de EB's te storen.
    4. Resuspendeer de EB's in 10 ml medium van Dulbecco's Modified Eagle (DMEM) met 20% foetaal runder serum (FBS). Breng de EB's naar de gelatine gecoate, 100 mm schotel. Voeg 10 μM ROCK remmer toe.
    5. Incubeer en onderhou de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 7 dagen. Thema veranderenDium elke andere dag zonder toevoeging van ROCK-remmer.
  4. Chondrogeen pelletvorming
    1. Aspiratie van het kweekmedium uit de schotel en wassen de cellen drie keer met PBS.
    2. Breng 1 ml 1 mM EDTA aan en incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 gedurende 2 minuten.
    3. Oog de cellen met 5 ml DMEM met 20% FBS en verplaats ze naar een nieuwe 15-ml conische buis.
    4. Centrifugeer de cellen gedurende 2 minuten bij 250 xg en RT. Gooi de supernatant weg en verwijder de pellet in 10 ml DMEM met 20% FBS.
    5. Filter en wis de celklompen met behulp van een 40 μm celfilter en oog de enkele cellen op. Tel de enkele cellen met behulp van een hemocytometer.
    6. Centrifugeer de cellen gedurende 2 minuten bij 250 xg en RT. Verwijder de supernatant en zaad 3 x 10 5 cellen per pellet in een 15 ml conische buis met 300 μl chondrogeen differentiatie medium (CDM).
    7. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij pelletvorming680 xg en RT.
      OPMERKING: De pellets worden gehandhaafd in 15 ml conische buizen tijdens de differentiatie van de chondrogeenpellets.
    8. Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 ° C en 5% CO2.
    9. Verander de CDM om de 2-3 dagen. Binnen 3 dagen zullen pellets versteekte, bolvormige morfologieën vertoonden. Houd de pellets gedurende 21 dagen bij 37 ° C en 5% CO 2 .

2. Chondrogeen Pellet Karakterisering Door Staining

  1. Chondrogeen embedding
    1. Voor het inbedden, bereiden en smelten paraffine bij 58 ° C.
    2. Bevestig de pellets in 1 ml 4% paraformaldehyde gedurende 2 uur bij RT in een 1,5 ml buis.
      Voorzichtigheid: paraformaldehyde is zeer giftig. Vermijd contact met de ogen, de huid of de slijmvliezen. Vermijd blootstelling en vermijd inademing tijdens het bereiden.
    3. Plaats een laag gaas op de cassette en zet de vaste pellets over met een pipet. Bedek de pellet door te vouwenE gaas en sluit de cassette deksel.
    4. Begin dehydrering in 100 ml 70% ethanol (EtOH) tweemaal, 10 minuten elk. De pellets uitdrogen door opeenvolgende 10 minuten wassen in 80% en 95% EtOH.
    5. Breng de pellets over 10 minuten naar 100% EtOH. Herhaal driemaal met verse EtOH.
    6. Voor "clearing", wissel de oplossing voor een 100 ml, 1: 1 mengsel van EtOH en xyleen, gevolgd door een 1: 2 mengsel van EtOH en xyleen gedurende 10 minuten elk. Verwijder de resterende EtOH door de pellets tweemaal in 100% xyleen, 10 minuten elk, te incuberen.
    7. Voor paraffine-infiltratie, incubateer de pellets in opeenvolgende xyleen- en paraffine mengsels. Voer het volledige paraffine-infiltratieproces bij 58 ° C uit. Incubeer de pellets in 100 ml van een 2: 1 mengsel van xyleen en paraffine gedurende 30 minuten.
    8. Vervang de oplossing voor 100 ml van een 1: 1 mengsel van xyleen en paraffine en incubeer gedurende 30 minuten.
    9. Vervang de oplossing voor 100 ml van een 1: 2 mengsel van xyleen en paraffine en incubeer voor 30 min.
    10. Voor de laatste infiltratie, breng de pellets over naar het eerste bad van 100% paraffine en incubeer gedurende 2 uur.
    11. Breng de pellets over naar het tweede bad van 100% paraffine en incubeer O / N bij 58 ° C.
    12. Vervolg de volgende dag de pellets voorzichtig door middel van een pincet. Voeg paraffine toe aan de mal uit de paraffine dispenser. Stabiliseer de paraffine gedurende 30 min bij 4 ° C.
    13. Snijd de secties op 7 μm en plaats de secties op de glijbaan. Laat de glijbanen overnacht drogen en sla de glijbanen op RT totdat ze klaar zijn voor gebruik.
  2. Slide voorbereiding
    1. Deparaffinize de glijbanen door ze gedurende 5 minuten per 100 ml 100%, 90%, 80% en 70% EtOH achtereenvolgens te bewegen.
    2. Plaats de glijbanen in een glazen pot en spoel met kraanwater gedurende 5 minuten.
  3. Alcian blauw kleuring
    1. Incubeer de dia's in 50 ml 1% alcianblauwe oplossing gedurende 30 minuten.
      NIETE: Alcian blauw wordt verdund in 3% azijnzuuroplossing. Pas de pH op 2,5 met azijnzuur aan.
    2. Plaats de glijbanen in een glazen pot en spoel met kraanwater gedurende 2 minuten.
    3. Spoel de glijbanen in gedeïoniseerd water (DW) en tegenstain met nucleaire snel rode oplossing gedurende 2 minuten.
    4. Plaats de glijbanen in een glazen pot en spoel met kraanwater gedurende 1 minuut.
    5. 2.3.5) Ga verder met dehydratie en bevestig de glijbanen in stap 2.6.
  4. Toluidine blue staining
    1. Incubeer glijbanen in 50 ml toluidine blauwe oplossing gedurende 4 minuten.
    2. Plaats de glijbanen in een glazen pot en spoel met kraanwater gedurende 5 minuten.
    3. Ga verder met dehydratie en monteer de dia's in stap 2.6.
  5. Immunohistochemische kleuring
    1. Incubeer de dia's in 3% H202 gedurende 15 minuten voor endogene peroxidase-blokkering.
    2. Breng 200 μL primair antilichaam (anti-COL1A1 en -COL2A1) op 1: 100 verdund in tris-buGefrituurde zoutoplossing (TBS) die 1% boviene serumalbumine (BSA) en 5% normaal geiten serum (NGS) op de glijbanen bevat en incubatie O / N bij 4 ° C.
    3. De volgende dag plaatst u de glijbanen in een glazen pot en wast u deze met 50 ml TBS, die 0,1% polysorbaat 20 (TBST) drie keer per 5 minuten bevatten.
    4. Breng 200 μl secundair antilichaam (geit anti-konijn IgG-antilichaam, verdund 1: 200 in TBS bevattende 1% BSA en 5% NGS) aan de glijbanen toe en incubeer bij 40 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Plaats de glijbanen in een glazen pot en was ze drie keer met 50 ml, 5 min elk.
    6. Voor signaalversterking, gebruik HRP-conjugaat streptavidine oplossing op de glijbanen en incubeer gedurende 10 minuten.
    7. Plaats de glijbanen in een glazen pot en was ze drie keer met 50 ml, 5 min elk.
    8. Meng de DAB-peroxidase substraatoplossing, breng 200 μL oplossing aan elke dia, en incubeer gedurende 1 minuut.
    9. Plaats de glijbanen in een glazen pot en spoel met kraanwater gedurende 5 minuten.
    10. tegenkleuringMet Mayer's hematoxyline gedurende 1 minuut.
    11. Was de glijbanen met DW.
    12. Ga verder met dehydratie en monteer de dia's in stap 2.6.
  6. Uitdroging en montage
    1. Ontduik de glijbanen door ze achtereenvolgens te bewegen door 100 ml 70%, 80%, 90% en 100% EtOH, 30 s elk.
    2. Dip de dia's in twee veranderingen van xyleen gedurende 1 min elk.
    3. Voeg 50 μL montageoplossing toe aan de deklagen en plaats de glijbanen bovenop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In deze studie hebben we chondrogeenpellets van CBMC-hiPSCs gegenereerd door uitgroei cellen van EB's te induceren. Chondrogene differentiatie werd geïnduceerd door middel van CBMC-hiPSC's met bevestigde hoge pluripotentie 11 . Een eenvoudige regeling van ons protocol is weergegeven in figuur 1A . Vóór differentiatie werden iPSC kolonies uitgebreid ( Figuur 1B ). De uitgebreide iPSCs werden sameng...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol heeft succesvolle hiPSC's van CBMC's gegenereerd. We herprogrammeerde CBMC's aan hiPSCs met behulp van een Sendai virale vector die Yamanaka-factoren 24 bevat . Drie gevallen werden gebruikt in differentiatie, en alle experimenten hebben succesvol chondrogeenpellets op basis van dit protocol gegenereerd. Talrijke studies hebben protocols voor de differentiatie van hiPSCs gemeld in chondrocyten 25 , 26 ,...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van het Koreaanse Gezondheidszorg Technology R & D project, ministerie van Volksgezondheid, Welzijn & Gezin, Republiek Korea (HI16C2177).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Kunststofwaren
100 mm DishTPP93100
6-well PlateTPP92006
50 mL Cornical TubeSPL50050
15 mL Cornical TubeSPL50015
10 mL Disposable PipetteFalcon7551
5 mL Disposable PipetteFalcon7543
12-well PlateTPP92012
NaamBedrijfCatalogusnummerBeschrijving
E8 Medium Materialen
DMEM/F12, HEPESLife Technologies11330-057E8 Medium (500 mL)
Sodium BicarbonateLife Technologies25080-094E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL)
Sodium SeleniteSigma AldrichS5261E8 Medium  (Conc.: 14 ng/mL)
Human TransfferinSigma AldrichT3705E8 Medium (Conc.: 10.7 μg/mL)
Basic FGF2Peprotech100-18BE8 Medium  (Conc.: 100 ng/mL)
Human InsulinLife Technologies12585-014E8 Medium (Conc.: 20 μg/mL)
Human TGFβ1Peprotech100-21E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL)
Ascorbic AcidSigma AldrichA8960E8 Medium  (Conc.: 64 μg/mL)
DPBSLife Technologies14190-144
VitronectinLife TechnologiesA14700
ROCK InhibitorSigma AldrichY0503
NaamBedrijfCatalogusnummerBeschrijving
Controlemateriaal van de kwaliteit
18 mm DekglasSuperiorHSU-0111580
4% ParaformaldyhydeTech & InnovationBPP-9004
Triton X-100BIOSESANG9002-93-1
Bovine Serum AlbuminVector LabSP-5050
Anti-SSEA4 AntibodyMilliporeMAB4304
Anti-Oct4 AntibodySanta CruzSC9081
Anti-TRA-1-60 AntibodyMilliporeMAB4360
Anti-Sox2 AntibodyBiolegend630801
Anti-TRA-1-81 AntibodyMilliporeMAB4381
Anti-Klf4 AntibodyAbcamab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibodyMolecular ProbeA11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibodyMolecular ProbeA11037
DAPIMolecular ProbeD1306
Prolong gold antifade reagentInvitrogenP36934
4% ParaformaldyhydeTech & InnovationBPP-9004
Tween 20BIOSESANGT1027
Bovine Serum AlbuminVector LabSP-5050
Anti-Collagen II antibodyabcam ab347121:100
Alcian blueSigma AldrichA3157-10G
Fast Green FCFSigma AldrichF7252-25G
Safranin OSigma Aldrich090m0039v
Nuclear fast redAmericanmastertechSTNFR100 
xyleneDuksan115 
EthanolDuksan64-17-5
Mayer's hematoxyline-oplossingwako pure chemical industriesLAK7534
DAPVECTOR LABORATORIESSK-4100
Glasplaat, GecoatHyun Il Lab-MateHMA-S9914
TrizolInvitrogen15596-018
ChloroformSigma Aldrich366919
IsoprypylalcoholMillipore109634
EthanolDuksan64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kitThermo ScientficK1622
NaamBedrijfCatalogusnummerBeschrijving
Chondrogenic Differentiatiematerialen
DMEMLife Technologies11885Chondrogeen media component (500 mL)
Penicilin StreptomycinLife TechnologiesP4333Chondrogeen media component (Conc.: 1%)
Ascorbic AcidSigma AldrichA8960Chondrogeen media component (Conc.: 64 μg/mL) 
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Life Technologies11140-050Chondrogeen media component (Conc.: 100 mM)
rhBMP-2R&D355-BM-050Chondrogeen media component (Conc.:100 ng/ml)
Recombinant Hman TGF-beta3R&D243-B3-002Chondrogeen media component (Conc.:10 ng/ml)
KnockOut Serum ReplacementLife Technologies10828-028Chondrogeen media component (Conc.: 1%)
ITS+ PremixBD354352Chondrogeen media component (Conc.: 1%)
Dexamethasone-Water Soluble Sigma AldrichD2915-100MGChondrogeen

Referenties

  1. van Osch, G. J., et al. Cartilage repair: past and future--lessons for regenerative medicine. J Cell Mol Med. 13 (5), 792-810 (2009).
  2. Ahmed, T. A., Hincke, M. T. Strategies for articular cartilage lesion repair and functional restoration. Tissue Eng Part B Rev. 16 (3), 305-329 (2010).
  3. Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
  4. Solchaga, L. A., Penick, K., Goldberg, V. M., Caplan, A. I., Welter, J. F. Fibroblast growth factor-2 enhances proliferation and delays loss of chondrogenic potential in human adult bone-marrow-derived mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A. 16 (3), 1009-1019 (2010).
  5. Guzzo, R. M., Drissi, H. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Chondrocytes. Methods Mol Biol. 1340, 79-95 (2015).
  6. Drissi, H., Gibson, J. D., Guzzo, R. M., Xu, R. H. Derivation and Chondrogenic Commitment of Human Embryonic Stem Cell-Derived Mesenchymal Progenitors. Methods Mol Biol. 1340, 65-78 (2015).
  7. Nejadnik, H., et al. Improved approach for chondrogenic differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 11 (2), 242-253 (2015).
  8. Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
  9. Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
  10. Ko, J. Y., Kim, K. I., Park, S., Im, G. I. In vitro chondrogenesis and in vivo repair of osteochondral defect with human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (11), 3571-3581 (2014).
  11. Nam, Y., Rim, Y. A., Jung, S. M., Ju, J. H. Cord blood cell-derived iPSCs as a new candidate for chondrogenic differentiation and cartilage regeneration. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 16(2017).
  12. Hotten, G. C., et al. Recombinant human growth/differentiation factor 5 stimulates mesenchyme aggregation and chondrogenesis responsible for the skeletal development of limbs. Growth Factors. 13 (1-2), 65-74 (1996).
  13. Murphy, M. K., Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. TGF-beta1, GDF-5, and BMP-2 stimulation induces chondrogenesis in expanded human articular chondrocytes and marrow-derived stromal cells. Stem Cells. 33 (3), 762-773 (2015).
  14. Shintani, N., Siebenrock, K. A., Hunziker, E. B. TGF-ss1 enhances the BMP-2-induced chondrogenesis of bovine synovial explants and arrests downstream differentiation at an early stage of hypertrophy. PLoS One. 8 (1), e53086(2013).
  15. Fukumoto, T., et al. Combined effects of insulin-like growth factor-1 and transforming growth factor-beta1 on periosteal mesenchymal cells during chondrogenesis in vitro. Osteoarthritis Cartilage. 11 (1), 55-64 (2003).
  16. Worster, A. A., Nixon, A. J., Brower-Toland, B. D., Williams, J. Effect of transforming growth factor beta1 on chondrogenic differentiation of cultured equine mesenchymal stem cells. Am J Vet Res. 61 (9), 1003-1010 (2000).
  17. Knippenberg, M., et al. Differential effects of bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor-beta1 on gene expression of collagen-modifying enzymes in human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A. 15 (8), 2213-2225 (2009).
  18. Jang, Y., et al. Centrifugal gravity-induced BMP4 induces chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells via SOX9 upregulation. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 184(2016).
  19. Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Res Ther. 6, 144(2015).
  20. Tao, H., et al. Biological evaluation of human degenerated nucleus pulposus cells in functionalized self-assembling peptide nanofiber hydrogel scaffold. Tissue Eng Part A. 20 (11-12), 1621-1631 (2014).
  21. Sekiya, I., Larson, B. L., Vuoristo, J. T., Reger, R. L., Prockop, D. J. Comparison of effect of BMP-2, -4, and -6 on in vitro cartilage formation of human adult stem cells from bone marrow stroma. Cell Tissue Res. 320 (2), 269-276 (2005).
  22. Shen, B., Wei, A., Tao, H., Diwan, A. D., Ma, D. D. BMP-2 enhances TGF-beta3-mediated chondrogenic differentiation of human bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells in alginate bead culture. Tissue Eng Part A. 15 (6), 1311-1320 (2009).
  23. Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J Vis Exp. (118), (2016).
  24. Kim, Y., et al. The Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Blood Cells: An Efficient Protocol Using Serial Plating of Reprogrammed Cells by Centrifugation. Stem Cells Int. 2016, 1329459(2016).
  25. Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
  26. Toh, W. S., et al. Differentiation and enrichment of expandable chondrogenic cells from human embryonic stem cells in vitro. J Cell Mol Med. 13 (9B), 3570-3590 (2009).
  27. Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. Derivation of chondrogenically-committed cells from human embryonic cells for cartilage tissue regeneration. PLoS One. 3 (6), e2498(2008).
  28. Nakagawa, T., Lee, S. Y., Reddi, A. H. Induction of chondrogenesis from human embryonic stem cells without embryoid body formation by bone morphogenetic protein 7 and transforming growth factor beta1. Arthritis Rheum. 60 (12), 3686-3692 (2009).
  29. Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
  30. Rim, Y. A., Park, N., Nam, Y., Ju, J. H. Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients. J Vis Exp. (116), (2016).
  31. Pfaff, N., et al. Efficient hematopoietic redifferentiation of induced pluripotent stem cells derived from primitive murine bone marrow cells. Stem Cells Dev. 21 (5), 689-701 (2012).
  32. Xu, H., et al. Highly efficient derivation of ventricular cardiomyocytes from induced pluripotent stem cells with a distinct epigenetic signature. Cell Res. 22 (1), 142-154 (2012).
  33. Lee, S. B., et al. Contribution of hepatic lineage stage-specific donor memory to the differential potential of induced mouse pluripotent stem cells. Stem Cells. 30 (5), 997-1007 (2012).
  34. Hu, S., et al. Effects of cellular origin on differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells. JCI Insight. 1 (8), 1-12 (2016).
  35. Vonk, L. A., de Windt, T. S., Slaper-Cortenbach, I. C., Saris, D. B. Autologous, allogeneic, induced pluripotent stem cell or a combination stem cell therapy? Where are we headed in cartilage repair and why: a concise review. Stem Cell Res Ther. 6 (94), 1-11 (2015).
  36. Gomez-Leduc, T., et al. Chondrogenic commitment of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in collagen matrices for cartilage engineering. Sci Rep. 6, 32786(2016).
  37. Mareschi, K., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells: bone marrow versus umbilical cord blood. Haematologica. 86 (10), 1099-1100 (2001).
  38. Wexler, S. A., et al. Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal 'stem' cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not. Br J Haematol. 121 (2), 368-374 (2003).
  39. Zhang, X., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood: reevaluation of critical factors for successful isolation and high ability to proliferate and differentiate to chondrocytes as compared to mesenchymal stem cells from bone marrow and adipose tissue. J Cell Biochem. 112 (4), 1206-1218 (2011).
  40. Wagner, W., et al. Replicative senescence of mesenchymal stem cells: a continuous and organized process. PLoS One. 3 (5), e2213(2008).
  41. Tarte, K., et al. Clinical-grade production of human mesenchymal stromal cells: occurrence of aneuploidy without transformation. Blood. 115 (8), 1549-1553 (2010).
  42. Chen, W. C., et al. Prediction of poor survival by cyclooxygenase-2 in patients with T4 nasopharyngeal cancer treated by radiation therapy: clinical and in vitro studies. Head Neck. 27 (6), 503-512 (2005).
  43. Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

iPSCs uit navelstrengbloeddifferentiatie tot embryonale lichamenchondrogeen differentiatiemediumAlcian Blue-kleuringToluidine Blue-kleuringcollageen type IIreal-time PCRparaffine-inbeddingtellen met hemocytometer
Chondrogenische Pelletvorming van Koord Bloed afgeleide geïnduceerde Pluripotente Stamcellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.