Methodenartikel

Methoden en Tips voor intraveneuze toediening van Adeno-associated Virus voor ratten en evaluatie van het centrale zenuwstelsel transductie

11.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55994

⸱

25 augustus 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Toxicology, and Neuroscience, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Molecular & Integrative Physiology, University of Kansas Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Methoden voor een grootschalige centrale zenuwstelsel gene levering in de rat vallen. In dit voorbeeld is het doel om na te bootsen van een ziekte die het hele ruggenmerg aantast. De wijdverbreide transductie kan worden gebruikt voor een therapeutische eiwitten naar het CNS van een eenmalige, perifere administratie.

Samenvatting

Adeno-associated virus (AAV) vectoren zijn een belangrijk reagens in de neurowetenschappen voor geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR), optogenetics, cre-lox doelgerichtheid, enz. Het doel van dit manuscript is om te helpen de onderzoeker probeert genenoverdracht expansieve centrale zenuwstelsel (CNS) in de rat via staart veneuze injectie van AAV. Schaal expressie is relevant voor voorwaarden met wijdverspreide pathologie, en het model van een rat is belangrijk vanwege de grotere omvang en fysiologische overeenkomsten voor de mens ten opzichte van muizen. In dit voorbeeld toepassing, wordt een grootschalige neuronale transductie gebruikt om na te bootsen van een neurodegeneratieve ziekte die het hele ruggenmerg, Amyotrofische laterale sclerose (ALS treft). De efficiënte grootschalige CNS transductie kan ook worden gebruikt voor therapeutische eiwitten factoren in pre-klinische studies. Na een interval na injectie expressie van enkele weken, worden de effecten van de transductie geëvalueerd. Voor een groen fluorescente proteïne (GFP) controle vector, is de hoeveelheid GFP in het cerebellum snel en betrouwbaar geschat door een basic imaging-programma. Voor motor ziekte fenotypen die worden veroorzaakt door het ALS gerelateerde eiwit transactive reactie DNA-bindende eiwit van 43 kDa (TDP-43), worden de tekorten gescoord door ontsnappen reflex en rotarod. Naast ziekte modellering en gentherapie zijn er diverse potentiële toepassingen voor de grootschalige gentargeting hier beschreven. Het uitgebreide gebruik van deze methode zal de steun in de hypothese testen in de neurowetenschappen en neurogenetica bespoedigen.

Inleiding

Recombinante adeno-associated virus (AAV) vectoren zijn onmisbare tools voor CNS onderzoek omdat ze zo efficiënt voor het transducing van neuronen in vivo. AAV vectoren zijn zeer veelzijdig voor het bestuderen van verschillende transgenen en eiwit isoforms, verschillende weefsels, andere host-soorten en andere wijzen van toediening. Bijvoorbeeld, kan AAV worden toegediend aan muizen door een randapparaat, relatief niet-invasieve, intraveneuze injectie transduce neuronen in het centraal zenuwstelsel als eerste beschreven in Foust et al. en Duque et al. (Zie JOVE papieren door Gombash et al. (2014)). 1 , 2 , 3 deze gen levering benadering wordt gebruikt bij ratten efficiënt uitspreken ofwel groen fluorescente proteïne (GFP) of de ALS gerelateerde eiwitten, transactive reactie DNA-bindende eiwit van 43 kDa (TDP-43) in het VNV. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 werkt bij ratten is belangrijk omdat de rat fysiologische en metabolische parameters dichter bij de mensen in vergelijking met muizen zijn en er gedrags- en toxicologische testen zijn speciaal ontworpen voor ratten zijn. Bovendien, steeds meer transgene rat lijnen beschikbaar dat kan worden gebruikt in de AAV gene transfer studies.

Methoden zijn gedetailleerd op expansieve CNS genoverdracht in de rat, en snelle, betrouwbare kwantificering van de resultaten. Grootschalige CNS transductie wordt gebruikt om na te bootsen de symptomatology van ALS bij ratten met het uitspreken van TDP-43 in het ruggenmerg. De methode is staart ader injecties van de TDP-43 vector naar jonge volwassen ratten zoals gebruikt in Jackson et al. 6 , 8 , 9 na enkele weken, TDP-43-geïnduceerde motor tekorten worden gescoord op twee manieren: reflex en rotarod zoals gebruikt in Dayton et al. en Jackson et al. ontsnappen 5 , 6 , 7 , 9 voor het besturingselement GFP vector, in post-mortem analyse, fluorescerende inzake het cerebellum wordt berekend als een index van de transductie efficiëntie zoals gebruikt in Jackson et al. 6 , 8 de analyse van cerebellum heeft bewezen een snelle en betrouwbare index de mate van CNS transductie na levering van de perifere gen en dient te gelden tot een verscheidenheid van benaderingen probeert randapparaat-naar-centrale genenoverdracht.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

alle procedures gevolgd de passende NIH-richtsnoeren. Alle procedures gevolgd de dierlijke protocollen die werden goedgekeurd door het Animal Care en gebruik Comité bij LSU Health Sciences Center in Shreveport. Vrouwelijke Sprague-Dawley ratten op 6 weken leeftijd werden gebruikt voor deze procedure.

1. bepalen van de doses/volumes van vector nodig

  1. wegen de ratten worden geïnjecteerd en het bepalen van de hoeveelheid virale vector nodig voor elk dier op basis van de titer (concentratie) van het vector-preparaat. Vector doses die succesvol voor efficiënte expressie in de rat CNS eerder geweest gebruiken (Zie Jackson et al.. 6).
    Opmerking: voor AAV9 TDP-43 of AAV9 GFP, een typische dosering ligt tussen de 3 x 10 13 - 1 x 10 14 vector genomen/kg. De jonge volwassen ratten op 6 weken leeftijd wegen ongeveer 150 g.
  2. Equivalente doses per kg bij alle dieren voor systematische vergelijkingen maken Zorg ervoor dat het volume niet hoger is dan standaard geadviseerd injectie volumes (250-500 µL voor een rat 250 g). Een typische geïnjecteerde volume is 200 µl aan een jonge volwassen rat.

2. Voorbereiden werkstation

  1. verzamelen alle vereiste benodigdheden: één paraffine film square (ongeveer 5 x 5 cm) per dier, een alcohol voorbereiding pad per dier, gaas pads (2-3 per dier), Pipetteer tips en een micropipet.
  2. Prepareer het werkoppervlak door het reinigen van het oppervlak met 70% ethanol. Leg een verwarming pad naar beneden met de temperatuur ingesteld op laag (~ 37 ° C). Plaats een bankje pad op de top van de verwarming pad.
  3. Bereiden de gas-anesthesie (Isofluraan). Zorg voor voldoende zuurstof en gas-anesthesie voor de procedure. Schoon het inductie kamer en anesthesie masker met 70% ethanol en het masker van de verdoving plaats op de Bank pad.

3. Voorbereiden van de vector

  1. de vector op kamertemperatuur ontdooien en een steriele microcentrifuge buis voor elk dier een label.
  2. Pipetteer het volume van AAV bepaald in stap 1.1 in de passende buis en breng het volume tot het gewenste geïnjecteerde volume (hier, 200 µl) met lactated Ringer ' s oplossing of zoutoplossing.
  3. Pulse vortex het monster voor 1-2 s en vervolgens pulse centrifuge voor 5 s om het monster naar de onderkant van de buis.
  4. Pipetteer het totale geïnjecteerde volume voor de rat uit de buis en op het plein van paraffine film.
  5. Plaats een naald 30 meter op een spuit van 1 mL.
  6. Plaats de naald met de schuine kant naar beneden in de vector op de paraffine-film. Terugtrekken op de plunjer van de injectiespuit totdat alle het virus in de naald en spuit is. Wees voorzichtig om te voorkomen dat tekenen van luchtbellen in de naald, die makkelijker met de praktijk.

4. Voorbereiden van de rat

  1. zet de zuurstof tot 1 L/min en de narcose Isofluraan ingesteld op 5%. Zorgen dat de narcose gas naar de vergaderzaal inductie stroomt door het controleren van alle aansluitende slangen en afsluiter oriëntaties.
  2. Plaats van de rat in de anesthesie inductie gaskamer ongeveer 3 minuten, totdat de rat niet reageert.
  3. Zorgen voor voldoende diepte van verdoving door het knijpen van de teen. Moet er geen beweging in de voet of been na de teen snuifje.
  4. De narcose Isofluraan verlagen tot 2% voor onderhoud van anesthesie en de afsluiter zodanig aanpassen dat de narcose loopt er door de verdoving masker.
  5. Plaats van de rat ' s neus in het masker van de anesthesie en de rat zodanig aanpassen dat het is liggend op zijn kant.
  6. Identificeren de laterale staart ader.
    Opmerking: De laterale staart aders liggen op ongeveer 10 en 2 o ' klok met de dorsale bovenkant van de staart als 12 o ' klok. Met de rat liggend op zijn kant, de laterale staart ader moet worden geconfronteerd met omhoog
  7. Veeg het gebied van de injectie met de alcohol voorbereiding zeem. De injectieplaats is tweederde van de lengte van de staart.

5. Injecteer de vector

  1. stevig vasthouden de staart licht boven de injectie gebied met één vinger direct boven de laterale staart ader; dit zal de ader te verwijden.
  2. Met de schuine kant naar boven, het uitlijnen van de naald met de zichtbare staart ader in dezelfde richting.
  3. Doorboren de huid over de staart ader terwijl het grote verzorgen om te voorkomen dat de andere kant de staart en op te drukken op de staart ader.
  4. Release druk van de ader van de staart te voorzien in normale bloedstroom.
  5. Verplaatsen de naald in de ader. Om ervoor te zorgen dat de naald de staart ader heeft doorboord, trek terug iets op de plunjer. Als de naald in de ader is, zal er bloed vloeien in de naald.
    1. Verplaatsen de naald zo nodig. Vervolgens om te stabiliseren de naald, plaatst u de hand boven de injectieplaats te onder de injectieplaats en houd het uiteinde van de spuit tegen de staart.
  6. De vector langzaam injecteren in de staart (ongeveer 20 µL/s).
    Opmerking: De ader kan verliezen kleur als de vector-flows erdoorheen. Tekenen dat de oplossing werd geïnjecteerd buiten de ader omvatten blebbing, blancheren of de huid weerstand bij het injecteren van de vector. Met praktijk kan de extra vasculaire blootstelling worden geminimaliseerd.
  7. Nadat de vector is toegediend, verwijdert u de naald uit de rat en drukt u op een pad van gaas tegen de injectieplaats te stammen het bloeden voor 30-60 s.

6. Sanering

  1. uitschakelen de Isofluraan narcose en zuurstof. De rat volgen totdat het herwint bewustzijn, en vervolgens terug te sturen naar zijn kooi.
  2. Plaatst zorgvuldig alle naalden in de container slijpsel. Beschikken over alle andere disposable materialen die mogelijk zijn verontreinigd met AAV in een passende biohazard container. Reinig de stations werken met 70% ethanol.

7. Evalueren van stuk ontsnappen reflex

Opmerking: stuk tekorten ontstaat doorgaans 2-6 weken na de TDP-43 genenoverdracht, afhankelijk van de dosis vector.

  1. Op een vlakke ondergrond duidelijke van puin, met twee vingers grijpen de rat ' s staart ongeveer 2 cm van het lichaam. Til de rat voorzichtig totdat de voorpoten hangen tijdens het bekijken van de ventrale onderzijde van de rat.
    1. Uitvoeren de procedure wekelijks in de experimentele tijd-loop na genenoverdracht (bijvoorbeeld tot 12 weken na genenoverdracht).
      Opmerking: Ook scoren voorpoot tekorten op deze manier, maar stuk tekorten hebben meer kans op het optreden in dit model, afhankelijk van de dosis van de vector gebruikt.
  2. Observeren van de hindlimbs voor 10 s. notitie als één of beide hindlimbs richting de middellijn tijdens de 10 balde s.
  3. Herhaal deze test voor een totaal van drie keer met 30 s tussen proeven. Als één of beide hindlimbs zijn gebalde voor elk van de drie proeven, vertoont de rat motor dysfunctie. Opnemen van de gegevens (handmatig in notities) als beide unilaterale of bilaterale stuk tekort aanwezig als er overeenstemming over alle drie proeven balde.

8. Evalueren van motor functie op de rotarod

  1. op te zetten van de rotarod, plaatst u het pad van een bankje onder de rotarod en versnelling ingesteld op 4-40 omwentelingen per minuut (rpm) meer dan 2 min (het tarief stijgt met ~0.3 rpm/s). Voor een cursus-12 weken tijd, draaien de onderwerpen op 2, 4, 8 en 12 weken na gene transfer.
  2. Toestaan de rat om te acclimatiseren in de test kamer voor 20 min.
  3. Te trainen de rat te gebruiken de rotarod voor de eerste keer, eerst beginnen met de rotarod op een ingestelde snelheid van 4 rpm, dan plaatst u de rat op de rotarod. Toestaan dat de rat te lopen voor een volledige omwenteling van 4 toeren per minuut, dan start de versnelling en laat de rat te lopen op de rotarod tot het eraf valt. Opleiding totdat de rat wandelt consequent voor ten minste 40 s. Een gezonde, jonge volwassen ratten zullen op deze manier gemakkelijk worden getraind.
    1. In het geval van een rat met een merkbaar motor bijzondere waardevermindering, die kan voorkomen dat de rat bereiken een basislijn latency te vallen van 40 s, bieden de rat 3-5 opleiding pogingen voordat u begint met het scoren van rotarod.
  4. Om te beginnen met het testen van de rotarod, de rat plaats op de rotarod en start de versnelling van de rotarod. Opmerking de tijd waartegen de rat van de rotarod valt; Dit is de latentie te vallen. Als de rat op de rotarod na 120 blijft s, cap de sessie op dit punt, de rat uit de rotarod verwijderen en het opnemen van een daling van de latentie van 120 s.
  5. Herhalen de test twee keer voor een totaal van drie proeven. Ruimte om te minimaliseren van het effect van vermoeidheid, de proeven ten minste 5 min uit elkaar. Het gemiddelde van de scores van de drie proeven. Een onberispelijke volwassen ratten heeft meestal een gemiddelde latentie te vallen van > 40 s.
  6. De rat plaats terug in de kooi en reinig de rotarod en de omliggende gebieden met 70% ethanol.

9. Kwantificering van GFP expressie in het cerebellum

  1. Anesthetize van de ratten en perfuse met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en dan 4% paraformaldehyde. Ontleden van de hersenen en het ruggenmerg en geniet van de weefsels in het fixeer 's nachts en verplaats deze naar een 30% sacharoseoplossing. Na evenwichtsinstelling, gesneden 50 μm coronale secties op een glijdende microtoom met het bevriezen van fase 4 , 5 , 6.
  2. Kies 3-6 gedeelten van het cerebellum die gelijkmatig zijn verdeeld in de vermis, de centrale kwab van het cerebellum. Fluorescently label het GFP te maximaliseren van het signaal. Gebruik van het primaire antilichaam voor GFP op 1:500 en gebruiken de Alexa-488 geconjugeerd secundair antilichaam bij een verdunning 1:300 4 , 5 , 6.
    Opmerking: Zie referenties 4 , 5 , 6 voor meer informatie over de bemonstering, segmenteren, en procedures kleuring.
  3. Photomicrograph elke sectie in de gedefinieerde regio van belang met een lage vergroting lens met behulp van een microscoop. Gebruik een 2,5 X doelstelling (N.A. 0.12) en filter ingesteld 10, 450-490/515-565 excitatie/emissie). Houden van de camera-instellingen (blootstelling tijden, bijvoorbeeld 2 s) hetzelfde in verschillende steekproeven te analyseren. Opslaan als een. TIF-bestand.
  4. Openen de gekleurd in de algemeen beschikbare programma van het beeld van de Scion; twee vensters zal openen. Sluit het venster aangegeven als " geïndexeerde kleur ".
  5. Kiezen " opties ", dan " dichtheid SliceŔ een waaier van tinten wordt aangegeven in het rood in het venster Look-Up Table (LUT). In het venster, gebruik de cursor om het invullen de specifieke GFP etikettering alleen en stoppen wanneer de niet-specifieke achtergrond begint in de afbeelding worden opgepikt.
    Opmerking: Dit zal benadrukken de fluorescerende gebied op de gekleurd worden gekwantificeerd. De instellingen moeten worden geoptimaliseerd voor het specifiek vangen alle zichtbaar fluorescerende cellen. Praktijk, deze methode kan juist wijzen op de specifieke fluorescentie.
  6. Voor fluorescerende oppervlakte te meten, eerst zorgen dat de metingen, verricht in de juiste eenheden (pixels). Om dit te doen, klikt u op " analyseren ", dan " instellen ScaleŔ de vierde regel moet zeggen " eenheden ". De drop-down lijst, kies pixels om te meten in pixels, klik op " OK ". De analyse opties om te schakelen " omvatten interieur gaten " om de opname van het gehele lichaam van de cel in de analyse.
  7. Voor het meten van het fluorescerende gebied, klik op " analyseren " en klik vervolgens op " maatregel ". Deze waarde, klik op " analyseren " klik vervolgens op " Toon ResultsŔ Er verschijnt een resultatenvenster. De fluorescerende gebied meting zal worden onder de kop met het label " gebied ".
  8. Om te zorgen voor standaardisatie in de metingen, Wijzig niet de gemarkeerde waarden in het venster LUT.
  9. Zodra alle metingen zijn opgenomen, de gemiddelden voor elk dier (van 3-6 afdelingen per dier). Gebruik een geschikte statistische proef om te vergelijken van de getransduceerde gebieden tussen de groepen. 6

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

TDP-43 geïnduceerde motor waardeverminderingen moeten ontstaan binnen 2-6 weken afhankelijk van de dosis van de AAV TDP-43 gebruikt (Figuur 1). Mislukte staart ader injecties zal leiden tot gedeeltelijke of geen waardeverminderingen; de AAV moet bereiken de bloedbaan te produceren het effect. Een succesvolle injectie van AAV GFP zal resulteren in GFP expressie in de hersenen en het ruggenmerg in een vector-dosis-afhankelijke wijze. Bij het gebruik van de ster...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een verscheidenheid van levering routes zijn getest voor AAV vectoren: intra-parenchymal, intra-cerebroventricular, intra-thecal, intraveneuze intranasale, intra musculaire, enz. Elke route wellicht specifieke voordelen evenals nadelen. Staart ader toediening AAV aan volwassen ratten is een betrouwbare methode voor het bereiken van overeenstemming transductie van het centraal zenuwstelsel. De perifere injectie methode vermijdt de invoering van een canule injectie in de CNS weefsels en kan daarom minimaal invasieve. De ef...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door de ALS Association, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx en een charitatieve donatie voor ALS onderzoek van Thomas Lawson, waarvoor wij dankbaar zijn. Wij danken Elysse boomgaard en Donna Burney voor advies en training. JAS werd gesteund door de Stichting gelogen en National Institutes of Health verlenen GM103418.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
SchaalPelouzeSP5
Nalgene emmerThermo Scientific120140004000 mL
MicrocentrifugebuisjeUSA Scientific1615-5500
Lactated Ringer's oplossingBaxter Healthcare0338-0114-04
Mini vortexerFisher Scientific128101
CentrifugeEppendorf22624415
LaboratoriumfilmBemisPM996
1-mL injectiespuitBD309626Komt met een 25g naald bevestigd.
Vervang door 27-30g naald voor injectie
30g naaldBD305106
IsofluraanPiramal Healthcare66794-013-25Isofluraan USP 250 mL
AnesthesiemaskerKopf Instruments906
GaasHenry Schein100-25242" x 2" (5cm x 5cm)
Pipet tipsUSA Scientific1111-0816
MicropipetGilson4642080
Gasanesthesie verdamperSurgiVet4214322Classic T3
Gasanesthesie ontvangerSurgiVet32373B10Enviro-PURE
VerwarmingskussenSears17280
Werkblad kussenVWR56617-006
RotarodPanlab/Harvard Apparatus76-07724 ratten/ 4 muizen
70% EthanolDecon Laboratories, Inc.2401140 proof
70% IsopropanolVWR89108-160
Scion ImageScion Corporation
GFP Tag Polyklonaal AntilichaamInvitrogenA11122Primair Antilichaam - 1:500 verdunning
AlexaFluor 488InvitrogenA11070Secundair Antilichaam - 1:300 verdunning
Axioskop 40 microscoopZeiss

Referenties

  1. Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
  2. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
  3. Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037(2014).
  4. Wang, D., et al. Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed. Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).
  5. Dayton, R., et al. Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis. Mol. Ther. 21 (7), 1324-1334 (2013).
  6. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036(2015).
  7. Jackson, K., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
  8. Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B. Front. Mol. Neurosci. 9, 116(2016).
  9. Jackson, K., et al. Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats. BMC Neuroscience. 17 (1), 69(2016).
  10. Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
  11. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. Gene vector "magic bullet": targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter. Expert Opin Ther Targets. 20 (10), 1153-1154 (2016).
  12. van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. Gas embolism: pathophysiology and treatment. Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23 (5), 237-246 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Rattenmodelstaartvene injectiegentransferGFP expressiebeeldanalyseScion beeldprogrammameting van fluorescentieoppervlak

Gerelateerde artikelen