De precieze lokalisatie van Golgi bewoners is van essentieel belang voor het begrijpen van de cellulaire functies van het Golgi. Conventionele optische microscopie is echter niet in staat om op te lossen van de sub-Golgi-structuur. Hier beschrijven we het protocol voor een conventionele microscopie gebaseerd super resolutie methode kwantitatief bepalen de sub-Golgi-lokalisatie van een eiwit.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kwantitatieve lokalisatie van een Golgi-eiwit door Imaging Center van fluorescentie massa
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het Golgi-complex bestaat uit serieel gestapelde membraan-cisternae die verder kunnen worden onderverdeeld in sub-Golgi-regio's, met inbegrip van het GOS-Golgi, mediaal-Golgi, trans-Golgi en trans-Golgi-netwerk. Cellulaire functies van het Golgi worden bepaald door de karakteristieke verdeling van de resident eiwitten. De ruimtelijke resolutie van de lichte microscopie van conventionele is te laag om sub-Golgi structuur of cisternae te lossen. De elektronenmicroscopie immuno-goud is dus een methode van keuze te lokaliseren een eiwit op de sub-Golgi-niveau. Echter, de techniek en het instrument zijn dan het vermogen van de meeste cel biologie labs. We beschrijven hier onze onlangs ontwikkelde super resolutie methode genaamd Golgi eiwit lokalisatie door imaging centra van massa (GLIM) systematisch en kwantitatief lokaliseren een Golgi-eiwit. GLIM is gebaseerd op standaard fluorescentie labeling protocollen en conventionele breed-gebied of confocal microscopen. Het gaat om de kalibratie van chromatische-shift aberratie van de microscopische systeem, de Beeldacquisitie en de analyse na overname. De sub-Golgi-lokalisatie van een test-eiwit is kwantitatief uitgedrukt als het quotiënt van de lokalisatie. Er zijn vier belangrijkste voordelen van GLIM; het is snel, op basis van conventionele methoden en instrumenten, het resultaat localisatie is kwantitatieve en het biedt ~ 30 nm praktische resolutie langs de Golgi-as. Hier beschrijven we de gedetailleerd protocol van GLIM te lokaliseren een test Golgi eiwit.
Inleiding
Het Golgi-complex speelt een essentiële rol in secretoire/endocytotische handel van eiwitten en lipiden (hierna cargos) in zoogdiercellen1,2,3. In het Golgi, zijn cargos niet alleen gesorteerd naar verschillende sub cellulaire compartimenten maar ook gewijzigd door verschillende soorten glycosylatie. Het zoogdieren Golgi-complex heeft talrijke lateraal verbonden Golgi stapels, die meestal bestaat uit 4-11 strak aaneengesloten en platte membraan zakjes genaamd cisternae. De serieel gestapelde Golgi-cisternae zijn verder gecategoriseerd, van het ene eind naar het andere, als
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Opmerking: Hieronder is een stapsgewijze protocol van GLIM voor het bepalen van de LQ van EGFP-gelabeld tyrosylprotein zwavelbevattende 1 (TPST1), een Golgi resident enzym, in HeLa cellen.
1. voorbereiding van de fluorescentie-geëtiketteerden Golgi Mini-stacks
-
Bereiden van glas coverslips
- Hoeveelheid 0,3 mL steriele Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) aan een putje van een 24-well plaat in de kap van een weefselkweek.
- Veeg een stuk Φ 12 mm No.1.5 glas dekglaasje aan met behulp van zacht papieren zakdoekje Bette met 70% ethanol te verwijderen van puin op het oppervlak van het glas dekglaasj....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het moderne onderzoek rang lichte Microscoop uitgerust met een plan Apochromatische lens, zoals degene die zijn gebruikt in ons lab, toont minimale chromatische aberratie(Figuur 2). Echter, een zorgvuldig onderzoek van het beeld Multi-Color fluorescerende kraal kan onthullen de verschuiving van de afbeeldingen van de verschillende kleuren van de dezelfde Parel (Figuur 2B). We definiëren dat het r.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Eerder, de lokalisatie van een Golgi-eiwit onder de lichte microscopie was voornamelijk gekwantificeerd door de mate van correlatie of samenloop van het imago van het eiwit met de afbeelding van een Golgi-marker van bekende lokalisatie15,16, 17. De resulterende correlatie of overlappende coëfficiënt komt overeen met hoe dicht het testen eiwit is naar het Golgi-marker ruimtelijk. Er zijn ten minste drie waarschuwingen voor deze .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
We bedank D. Stephens (Universiteit van Bristol, Bristol, Verenigd Koninkrijk) voor de TPST1-EGFP DNA plasmide, evenals Lakshmi Narasimhan Govindarajan voor het helpen met de optimalisatie van de software. Dit werk werd gesteund door subsidies van de nationale Medical Research Council (NMRC/CBRG/007/2012), ministerie van onderwijs (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 en RG132/15 en AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) voor de L.L.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| fluorescence beads. Commerciële naam: TetraSpeck beads | Invitrogen | T7279 | Als meerkleurige beads om de chromatische verschuiving van de microscoop te kalibreren |
| Glazen dekglas Φ 12 mm (Nr. 1.5) | Menzel | CB00120RAC | |
| Glazen dekglas Φ 25 mm (Nr. 1.5) | Menzel | ||
| DMEM | Capricon | DMEM-HPA-P50 | |
| Trypsine-EDTA | |||
| FBS | GE Hyclone | SV30160.03 | |
| Nocodazol | Merck | 487928 | |
| transfectie reagens. Commerciële naam: Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| transfectie medium. Commerciële naam: OptiMEM | Invitrogen | 31985070 | |
| TPST1-EGFP | Addgene | 66617 | Een geschenk van D. Stephens (University of Bristol, Bristol, Verenigd Koninkrijk) |
| GalT-mCherry | Gemaakt in ons lab | ||
| paraformaldehyde | Merck | 1.04005.1000 | |
| saponine | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| poly(vinyl alcohol) (Mw ~31.000). Commerciële naam: Mowiol-488 | CALBIOCHEM | 475904 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Muis anti-GM130 | BD Biosciences | 610823 | Primaire antilichaam voor humaan GM130 |
| Ver-rood fluorescent geconjugeerd geiten anti-muis IgG. Commerciële naam: Alexa Fluor 647 geconjugeerd geiten anti-muis IgG | Invitrogen | A-21235 | Ver-rood fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam |
Referenties
- Glick, B. S., Luini, A. Models for Golgi traffic: a critical assessment. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005215(2011).
- Klumperman, J. Architecture of the mammalian Golgi. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
- Lu, L., Hong, W.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
