Methodenartikel

Kwantitatieve lokalisatie van een Golgi-eiwit door Imaging Center van fluorescentie massa

DOI:

10.3791/55996

⸱

10 augustus 2017

 ,  ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, 2Bioinformatics Institute, 3School of Computing, National University of Singapore

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De precieze lokalisatie van Golgi bewoners is van essentieel belang voor het begrijpen van de cellulaire functies van het Golgi. Conventionele optische microscopie is echter niet in staat om op te lossen van de sub-Golgi-structuur. Hier beschrijven we het protocol voor een conventionele microscopie gebaseerd super resolutie methode kwantitatief bepalen de sub-Golgi-lokalisatie van een eiwit.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het Golgi-complex bestaat uit serieel gestapelde membraan-cisternae die verder kunnen worden onderverdeeld in sub-Golgi-regio's, met inbegrip van het GOS-Golgi, mediaal-Golgi, trans-Golgi en trans-Golgi-netwerk. Cellulaire functies van het Golgi worden bepaald door de karakteristieke verdeling van de resident eiwitten. De ruimtelijke resolutie van de lichte microscopie van conventionele is te laag om sub-Golgi structuur of cisternae te lossen. De elektronenmicroscopie immuno-goud is dus een methode van keuze te lokaliseren een eiwit op de sub-Golgi-niveau. Echter, de techniek en het instrument zijn dan het vermogen van de meeste cel biologie labs. We beschrijven hier onze onlangs ontwikkelde super resolutie methode genaamd Golgi eiwit lokalisatie door imaging centra van massa (GLIM) systematisch en kwantitatief lokaliseren een Golgi-eiwit. GLIM is gebaseerd op standaard fluorescentie labeling protocollen en conventionele breed-gebied of confocal microscopen. Het gaat om de kalibratie van chromatische-shift aberratie van de microscopische systeem, de Beeldacquisitie en de analyse na overname. De sub-Golgi-lokalisatie van een test-eiwit is kwantitatief uitgedrukt als het quotiënt van de lokalisatie. Er zijn vier belangrijkste voordelen van GLIM; het is snel, op basis van conventionele methoden en instrumenten, het resultaat localisatie is kwantitatieve en het biedt ~ 30 nm praktische resolutie langs de Golgi-as. Hier beschrijven we de gedetailleerd protocol van GLIM te lokaliseren een test Golgi eiwit.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het Golgi-complex speelt een essentiële rol in secretoire/endocytotische handel van eiwitten en lipiden (hierna cargos) in zoogdiercellen1,2,3. In het Golgi, zijn cargos niet alleen gesorteerd naar verschillende sub cellulaire compartimenten maar ook gewijzigd door verschillende soorten glycosylatie. Het zoogdieren Golgi-complex heeft talrijke lateraal verbonden Golgi stapels, die meestal bestaat uit 4-11 strak aaneengesloten en platte membraan zakjes genaamd cisternae. De serieel gestapelde Golgi-cisternae zijn verder gecategoriseerd, van het ene eind naar het andere, als cis, mediaal en trans-cisternae. Op de trans-kant van een Golgi-stack, de trans-meeste membraan OSS zich ontwikkelt tot een netwerk van buizen en reticulum membraan genoemd van de trans-Golgi network (TGN)4. Cargos afgeleid van het endoplasmatisch reticulum (ER) Voer in de secretoire traject, een Golgi-stack op de cis-zijde en vervolgens achter elkaar passeren mediaal en trans-cisternae. Cargos uiteindelijk verlaten het Golgi in de trans-Golgi of TGN wordt het plasmamembraan, de Endosomen of de secretoire korrels.

De moleculaire en cellulaire mechanismen van hoe cargos transit een Golgi-stack en hoe het Golgi onderhoudt haar cisternal organisatie blijven mysterieuze en momenteel nog steeds onder een verhit debat1. Een van de problemen op dit gebied is dat Golgi cisternae enkel worden onder de elektronenmicroscopie (EM) sinds de resolutie van een optische Microscoop opgelost kunnen (~ 200 nm) is onvoldoende om op te lossen van individuele Golgi cisternae (< 100 nm in beide cisternal dikte en afstand). Daarom worden de lokalisatie van de sub-Golgi van resident eiwitten en doorvoer cargos conventioneel bepaald door de immuno-goud EM. Echter, de immuno-goud-EM is zeer technisch veeleisend en het is dan het vermogen van de meeste cel biologie labs. Hoewel de resolutie van de EM sub nanometer kunnen, de resolutie die worden geboden door de immuno-goud EM wordt sterk belemmerd door de grootte van het antilichaam complexe (primaire en het secundaire antilichaam) en het gouden deeltje, en het kan slechter dan 20 nm. Bovendien, EM beelden worden verkregen 2D dun-profielen in plaats van een 3D totaalbeeld van het Golgi, die in onjuiste conclusies afhankelijk van de relatieve positie en oriëntatie van de 2D sectie5 resulteren kan. Bijvoorbeeld het bestuderen van een EM single-sectie is niet betrouwbaar onderscheiden van een blaasje van de orthogonale weergave van een zaadvormende aangezien beide identieke ronde membraan profielen kunnen weergeven. De recente komst van super resolutie microscopie technieken, zoals 3D-gestructureerde verlichting microscopie (3D-SIM), gestimuleerd emissie uitputting (STED), photoactivated lokalisatie microscopie (PALM) en stochastische optische wederopbouw microscopie) STORM), maakt het mogelijk om op te lossen van sub-Golgi structuren onder lichte microscopen6. Echter, er zijn ten minste vier nadelen die het gebruik ervan in de biologische studie van de cel van het Golgi aanzienlijk kunnen beperken. 1) huidige super resolutie technieken vereisen dure en speciale hardwareconfiguratie die buiten de meeste cel biologie labs. 2) speciale fluorescentie labeling protocollen zijn nodig voor sommige super resolutie technieken. 3) Hoewel, onder de beste conditie, beweren deze technieken 20-110 nm in ruimtelijke resolutie, is de praktische resolutie verkregen in echte monsters kunnen veel erger. 4) In vergelijking tot conventionele microscopie, deze super resolutie technieken nog steeds moeilijkheden ondervinden bij het uitvoeren van multicolor, 3D of live cel imaging, afzonderlijk of in combinatie. Waarschijnlijk belangrijker, zowel immuno-goud EM en de super resolutie microscopie technieken opleveren kwalitatieve in plaats van kwantitatieve lokalisatie gegevens.

Wilt gedeeltelijk het oplossen van problemen die hierboven vermeld, hebben we onlangs een conventionele de lichte microscopie van gebaseerde methode, die Golgi eiwit lokalisatie heet door imaging centra van massa (GLIM), systematisch en kwantitatief lokaliseren een Golgi ontwikkeld eiwit met een resolutie die gelijkwaardig is aan die van de immuno-goud EM7. Bij deze methode is het Golgi in gekweekte zoogdiercellen als Golgi mini-stacks verspreid door de behandeling van nocodazole, een microtubulus depolymerizing drug. Uitgebreide studies hebben aangetoond dat nocodazole-geïnduceerde Golgi mini-stacks (hierna Golgi mini-stacks) native Golgi stapels in zowel de organisatie als de cellulaire functies8,9,10lijken, 11. Het quotiënt (LQ) van de lokalisatie van een test-eiwit kan worden verkregen door middel van GLIM en het geeft de kwantitatieve sub-Golgi-lokalisatie. De numerieke waarden van LQs kunnen worden vergeleken en een LQ-database van meer dan 25 Golgi markers beschikbaar geweest.

In GLIM zijn Golgi mini-stacks triple-gelabeld door endogene of exogenously uitgesproken GM130, GalT-mCherry en het test-eiwit (x). GM130 en GalT-mCherry, cis- en trans-Golgi markeringen respectievelijk12,13, bieden referentiepunten. De drievoudige fluorescentie, rood (R), groene (G) en far-red (B), kunstmatig worden weergegeven als rood, groen en blauw, respectievelijk. Centrum van fluorescentie massa (hierna midden) is gekozen om sub pixelresolutie. Het Golgi-as wordt gedefinieerd als de vector vanuit het centrum van GM130 met die van GalT-mCherry. De mini Golgi-stack is gemodelleerd als een cilindrische structuur met oneindige draaisymmetrie rond de Golgi-as. Daarom kan een Golgi mini stack verder worden gemodelleerd als een eendimensionale structuur langs de Golgi-as. De LQ van het test-eiwit x wordt gedefinieerd als dx/d1, waarin dx de afstand van het centrum van x tot die van GM130, is terwijl d1 de afstand van het centrum van GalT-mCherry met die van GM130 is. Als het centrum van x af-as is, wordt de axiale projectie-afstand gebruikt voor de berekening. De variabelen, met inbegrip van Golgi as, axiale hoek, dx, d1, hoek α en β hoek, voor GLIM worden schematisch weergegeven in Figuur 1. LQ is onafhankelijk van het Golgi axiale hoek al Golgi mini-stacks willekeurig in een cel oriënteren.

Golgi mini-stacks verschijnen inhomogene in beelden. We ontwikkelden de drie criteria Schakel analyseren Golgi mini-stacks voor GLIM. 1) het signal-to-noise verhouding criterium, waarin de verhouding van de totale intensiteit van een Golgi mini stack naar de standaarddeviatie (SD) van de achtergrond ≥ 30 in elk kanaal is. Dit criterium is om de positie nauwkeurigheid van het massamiddelpunt, die afhangt van de signal-to-noise verhouding Golgi mini-stacks. 2) de axiale hoek of afstand criterium, waarvoor d1≥ 70 nm. d1 vermindert met de toename van de axiale Golgi-hoek. Wanneer de axiale hoek nadert 90° of verticaal, de mini stack wordt niet omgezet als d1 nadert 0. d1≥ 70 nm effectief in de buurt van verticale Golgi mini-stacks kunt uitsluiten. 3) het criterium van de co-lineariteit, waarin | tan α | of | tan β | ≤ 0,3 is. Dit criterium zorgt ervoor dat de drie centra van een mini stack voldoende co-lineaire voor onze eendimensionale model van het Golgi mini stack. Alle lichte microscopen last van chromatische aberratie die de relatieve posities van rode, groene en far-red fluorescentie centra ernstig kan verstoren. Chromatische aberratie van Microscoop systemen is experimenteel gekalibreerd door imaging 110 nm kralen, die triple-gelabeld door rode, groene en far-red fluorescentie zijn. Voor elke kraal afbeelding, het centrum van rood wordt gedefinieerd als de ware positie van de parel en chromatische-verschuivingen van groen en far-red centra door eerste-orde polynoom functies zijn gemonteerd. Centra van Golgi mini-stacks zijn onderworpen aan de polynomiale functies te corrigeren de chromatische-verschuivingen in groen en far-red kanalen.

Door middel van GLIM kunnen wij een resolutie van ~ 30 nm langs de as van het Golgi onder standaardomstandigheden. Nog belangrijker is, biedt het een planmatige methode kwantitatief kaart een Golgi-eiwit. GLIM kan worden uitgevoerd door conventionele microscopen, zoals breed-gebied of confocal microscopen, met behulp van gemeenschappelijke fluorescentie labeling protocollen. Beeldvorming en gegevensverwerking kunnen duren een uur zo kort. Door middel van GLIM, hebben we rechtstreeks aangetoond de geleidelijke overgang van de secretoire lading uit het cis- aan trans-kant van het Golgi-7.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: Hieronder is een stapsgewijze protocol van GLIM voor het bepalen van de LQ van EGFP-gelabeld tyrosylprotein zwavelbevattende 1 (TPST1), een Golgi resident enzym, in HeLa cellen.

1. voorbereiding van de fluorescentie-geëtiketteerden Golgi Mini-stacks

  1. Bereiden van glas coverslips
    1. Hoeveelheid 0,3 mL steriele Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) aan een putje van een 24-well plaat in de kap van een weefselkweek.
    2. Veeg een stuk Φ 12 mm No.1.5 glas dekglaasje aan met behulp van zacht papieren zakdoekje Bette met 70% ethanol te verwijderen van puin op het oppervlak van het glas dekglaasje aan. Gebruik een paar scherpe pincet kort kunt genieten van het dekglaasje aan in 70% ethanol, breng dit in de 24-well-plaat en het zinken naar de bodem van het goed met steriele DMEM.
      Opmerking: Glas coverslips zijn conventioneel gesteriliseerd door vlammen. Echter kraken coverslips onder dergelijke behandeling gemakkelijk tijdens vervolgens verwerken. 70% ethanol inweken is effectief in het steriliseren van glas coverslips zonder beschadiging van hen.
    3. Met de deksel bedekt, laat u de 24-well plaat in de 37 ° C CO2 incubator tot gebruik.
  2. Zaad-cellen
    1. Cultuur HeLa cellen (hierna cellen) in een maatkolf van de T-25 in DMEM aangevuld met 10% foetale boviene Serum (FBS) (hierna compleet medium) in een incubator 37 ° C CO2 geleverd met 5% CO2. Antibiotica zijn hier niet nodig.
    2. Wanneer cellen bereiken ~ 80% confluentie, gecombineerd het kweekmedium. Voeg 1 mL van 0,25% trypsine-EDTA in de erlenmeyer voorzichtig spoelen de cellen uit de wand van de kolf door pipetteren en Incubeer de cellen in een 37 ° C CO2 incubator voor 2 min. Add 1 mL compleet medium in de kolf.
    3. Vrijstaand cellen overbrengen in een steriele centrifugeren buis en de spin bij 500 x g gedurende 2 min naar de pellet van de cellen. Gecombineerd het supernatant en Suspendeer de cel pellet in 1 mL compleet medium.
    4. Het medium in de put van 24-well plaat met de gesteriliseerde glas dekglaasje aan en zaad gecombineerd ~ 1 x 105 cellen in de put. Het volume van de put met volledige medium tot 0,5 mL herladen. Incubeer in een 37 ° C CO2 incubator geleverd met 5% CO2. Cultuur van de cellen te ~ 80% confluentie.
  3. Transfect cellen
    Opmerking: Goed gespreide cellen zijn voordelig voor imaging-verspreide Golgi mini-stacks.
    1. Transfect ~ 80% confluente cellen met 80 ng GalT-mCherry7 en 320 ng TPST1-EGFP (Zie Tabel van materialen) DNA-plasmiden met behulp van een transfectiereagens volgens het protocol geleverd door de fabrikant. Incubeer in een 37 ° C CO2 incubator. Het wijzigen van het medium na een incubatieperiode van 4-6 h. De cellen zijn klaar ~ 12 h later.
  4. Nocodazole behandeling voor het genereren van Golgi mini-stacks
    1. Bereid de stamoplossing van een nocodazole (33 mM) door ontbinding van 10 mg nocodazole poeder in 1 mL dimethylsulfoxide. Aliquot de stockoplossing en opslag bij-20 ° C voor lange termijn opslag.
    2. Verdunnen 1 µL van nocodazole stockoplossing (33 mM) in 1 mL 37 ° C volledige medium (eindconcentratie 33 µM). Centrifugeer op topsnelheid te verwijderen van de zwevende deeltjes.
    3. Gecombineerd het medium in de put en Voeg 0,5 mL 33 µM nocodazole met volledige medium. Incubeer de cellen in een 37 ° C CO2 incubator voor 3 h. doorgaan naar immunofluorescentie labeling (sectie 1.5).
  5. Immunofluorescentie labeling
    Opmerking: Houd de cellen in het donker te vermijden photobleaching van GalT-mCherry en TPST1-EGFP.
    1. Reagentia voor het labelen van de immunofluorescentie bereiden
      1. Ter voorbereiding van 4% paraformaldehyde oplossing, los van 4% (m/v) paraformaldehyde poeder in hete 1 X fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en filtreer de oplossing door 0,45 µm filter. De oplossing kan worden opgeslagen bij-20 ° C.
        Let op: Paraformaldehyde is giftige en kankerverwekkende en het kan leiden tot irritatie van de huid. Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM).
      2. Meng ter voorbereiding fluorescentie verdunning buffer (FDB), 5% (v/v) FBS, en bovien serumalbumine (BSA) van 2% (g/v) in 1 x PBS. Filtreer de oplossing door 0,45 µm filter en opslaan van de oplossing bij-20 ° C.
      3. Ontbinden 5.35 g NH4Cl poeder in 1 L water voor te bereiden van 100 mM NH4Cl en de oplossing op kamertemperatuur worden opgeslagen.
      4. Los 10% (m/v) saponine poeder in water 10% saponine, aliquoot voorbereiden en opslaan van de oplossing bij-20 ° C.
    2. Fixatie
      1. Spoel het goed eens met 0,5 mL 1 x PBS oplossing en Voeg 0,5 mL 4% paraformaldehyde oplossing. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Spoel de put tweemaal met 0,5 mL 1 x PBS en tweemaal met 0,5 mL 100 mM NH4Cl. Rinse de put tweemaal met 0,5 mL 1 x PBS. Cellen kunnen worden bewaard in 1 x PBS bij 4 ° C's nachts in het donker.
    3. Fluorescentie labeling
      1. Verdunnen 1 µL muis anti-GM130 primair antilichaam in 500 µL FDB met 0,1% saponine. Omkeren van de deksel van de 24-well-plaat en breng 10 µL primair antilichaam mengsel op het deksel.
      2. Gebruik een paar scherpe pincet te halen en brengen het dekglaasje glas aan op de daling van het antilichaam mengsel ervoor te zorgen dat de cel kant in contact met het mengsel is. Incubeer de cellen met het primaire antilichaam mengsel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
        Opmerking: De klep met het dekglaasje aan kan worden geplaatst in een bevochtigde plastic zak in het donker.
      3. Een paar scherpe pincet gebruiken om te halen en het dekglaasje aan overbrengen in de put met de kant van de cel omhoog en spoel het in 0,5 mL 1 x PBS voor driemaal in ≥ 30 min. schudden is overbodig.
      4. Verdunnen 1 µL far-red fluorophore geconjugeerd geit-antimuis IgG (secundair antilichaam) in 500 µL FDB met 0,1% saponine.
      5. Was en reinig het omgekeerde oppervlak van het deksel van de 24-well-plaat. Breng 10 µL far-red secundair antilichaam mengsel op het deksel. Herhaal stap 1.5.3.2 - 1.5.3.3.
    4. Montage
      1. Bereid het montage medium door het mengen van 1 g glycerol, 2,2 g poly(vinylalcohol) (MW ~ 31.000 Da), 1,2 mL 1 M Tris (pH 8) en 8.8 mL H2O. verspreiden het mengsel in een waterbad van 60 ° C met af en toe vortexing. Winkel de oplossing bij-20 ° C.
      2. Ontdooi het montage-medium en breng 10 µL op een glasplaatje. Overlay het dekglaasje aan (cel zijde naar beneden) op de daling van montage medium. Incubeer het glasplaatje bij 37 ° C gedurende 30 minuten of kamer temperatuur gedurende 1 uur te verharden van het montage-medium. Zegel van het dekglaasje aan met kleurloze nagellak, en slaan het glasplaatje bij-20 ° C.

2. voorbereiding van fluorescerende kralen voor correctie van chromatische-shift

  1. Dekglaasje aan schoonmaken
    1. Zorgvuldig plaatst een stuk van 25 mm No.1.5 glas dekglaasje aan op een kunststof rek.
    2. Het rek met het dekglaasje aan overdracht naar een bekerglas van 400 mL gevuld met 300 mL 1 M NaOH en bewerk ultrasone trillingen ten in een bad ultrasoonapparaat (35 watt) voor 15 min. kort spoelen het rek in een bekerglas van 400 mL gevuld met 300 mL gedeïoniseerd water. Het rek overbrengen in een bekerglas van 400 mL gevuld met 300 mL 99% ethanol en bewerk ultrasone trillingen ten in het bad ultrasoonapparaat voor 15 min. kort spoelen het rek in een bekerglas van 400 mL gevuld met 300 mL gedeïoniseerd water.
    3. Herhaal stap 2.1.2 twee meer tijden.
    4. Spoel het rek met het dekglaasje aan in 300 mL gedeïoniseerd water in een bekerglas van 400 mL voor 10 min. Herhaal de stap nog tweemaal. Het rek overbrengen in een oven van 60 ° C en droog het dekglaasje aan voor 1 h. winkel de gedroogde dekglaasje aan in een petrischaal stofvrij.
  2. Immobilisatie van fluorescerende parels op het glas dekglaasje aan
    1. Verdun 110 nm Multi-Color fluorescerende kralen 80-fold in 1 x PBS met 0,1 µg/µL BSA. Kort vortex de buis te dispergeren kraal aggregaten. Verspreiden van 60 µL verdund kralen op het dekglaasje met glas (zie punt 2.1) 25 mm No.1.5 aan schoongemaakte Φ met behulp van een pipet tip. Droog het dekglaasje aan in een exsiccator verbonden met een vacuümpomp in het donker en mount het dekglaasje aan op een glasplaatje in 50 µL montage medium (zie stap 1.5.4.2).

3. de Beeldacquisitie

Opmerking: GLIM vereist beelden van hoge signaal-ruisverhouding (SNR) voor hoge precisie massamiddelpunt berekening. Het beeld kan worden verkregen door conventionele microscopen zoals de laser scannen confocal, draaiende schijf confocal of wide-veld Microscoop. Een wide-veld microscoop voorzien van plan-apochromatische objectieven en een laag geluidsniveau beeldsensor, zoals een charge - coupled device (CCD) en wetenschappelijke complementary metal-oxide semiconductor (sCMOS) kan worden gebruikt. Parameters voor de beeldsensor zijn aangepast om ervoor te zorgen een lage lees-lawaai en hoog dynamisch bereik. De Microscoop moet zijn uitgerust met de optimale configuratie van fluorescentie filters voor groen, mCherry en far-red fluorophore, en het moet te verwaarlozen fluorescentie cross-talk. In het ideale geval bereikt het imaging systeem een sampling-frequentie van Nyquist in de x, y en z-as, waarvoor meestal de x, y en z grootte van een voxel als minder dan 100, 100 en 200 nm, respectievelijk. De x- en y grootte van de voxel zijn altijd gelijk en worden aangeduid als pixel_size. De pixel_size kan worden berekend door de camera sensor grootte door de vergroting van het systeem.

  1. Afbeelding Multi-Color kralen
    1. Afbeelding Multi-Color kralen in groen, rood en far-red kanalen aan het begin en aan het eind van elke imaging-sessie.
      Opmerking: Hier, beelden werden verworven door een conventionele breed-gebied epi-fluorescentie Microscoop (omgekeerde) uitgerust met 100 X nb 1.4 plan-apochromatische doelstelling, gemotoriseerde stadium, 200 Watt metal halide lichtbron en 16-bits sCMOS camera. De golflengten voor excitatie filter (band pass), dichroïde spiegel (lange pass) en emissie filter (band pass) van de groene kanaal filter kubus zijn 465-495, 505 en 515-555 nm; dat voor de rode kanaal filter kubus zijn 528-553, 565 en 578-633 nm; en dat voor het far-red kanaal filter kubus zijn 590-650, 660 en 663-738 nm. Tijdens de verwerving, de grootte van een voxel langs de x, is y en z-as 64, 64 en 200 nm, respectievelijk.
    2. Vind een gezichtsveld met goede kraal dichtheid.
    3. Verwerven van 3D afbeeldingsstapels in groen, rood en far-red kanalen (kanaalG, kanaalR, kanaalB, respectievelijk). Neem 3 delen boven en onder de beste brandvlak (7 afdelingen per stapel). De drie stapels als drie TIFF-bestanden opslaan.
      Opmerking: De belichtingstijd voor elk kanaal is empirisch bepaald te maximaliseren van het dynamisch bereik, voorkomen van pixel verzadiging en photobleaching minimaliseren. Andere parameters, zoals de filters en de x, y en z grootte van de voxel, worden gekozen zoals hierboven besproken.
  2. Golgi mini-afbeeldingsstapels
    1. Gebruik TPST1-EGFP GalT-mCherry transfected en fluorescently label (sectie 1.5) dia's te vinden van cellen die uitdrukkelijke TPST1-EGFP en een lage of middelgrote niveau van GalT-mCherry. Verwerven 3D afbeeldingsstapels zoals beschreven in stap 3.1.3.

4. de beeldanalyse

  1. Verwerven van centra van fluorescerende kralen
    1. Open in ImageJ, een reeks kraal beelden, bestaande uit drie TIFF-bestanden (bestand > Afbeelding > openen).
    2. Gemiddelde 3 opeenvolgende secties rond de beste gerichte sectie in kanaalR door Beeld > stapels > Z Project. Het sectienummer van "Start slice" en "Stop slice" input en selecteer onder de opties van "projectie type", "Gemiddelde intensiteit".
    3. Tekenen gebieden van belang (ROIs) die bevatten geen kralen in de afbeelding met behulp van "Veelhoek selecties". In "Analyze > Set metingen", alleen de "Gemiddelde grijswaarde" en de "Standaarddeviatie" controleren. Vervolgens uitvoeren "Analyze > maatregel" om de gemiddelde en SD van de ROI te verkrijgen.
    4. Berekenen van de intensiteit van de achtergrond als "gemiddelde + 6 × SD". Aftrekken van de afbeelding met de bijbehorende waarden van de intensiteit van de achtergrond door "proces > wiskunde > Subtract", invoergegevens naar de achtergrond intensiteitswaarde overeenkomt met dit kanaal.
    5. Herhaal stap 4.1.2 aan 4.1.4 voor channelG en kanaalB afbeeldingsstapels met behulp van de dezelfde start en stop segment en de zelfde achtergrond ROI. Merk op dat de ROI in stap 4.1.3 gebruikt kan worden gekopieerd naar kanaalG en kanaalB afbeeldingen.
    6. Samenvoegen van de drie achtergrond-afgetrokken afbeeldingen (afbeelding > Kleur > Kanalen verenigen) door het selecteren van kanaalR als rood,G als groene kanaal en kanaalB blauw. Een enkele samengestelde afbeelding die bestaat uit drie kanalen zal worden verkregen.
    7. Start de ROI manager (Analyze > Tools > ROI Manager). Teken een vierkant ROI rond één kralen om ervoor te zorgen dat er slechts één parel binnen elke ROI. Voeg de ROI aan ROI manager door "t" op het toetsenbord te drukken. Herhaal dit proces en voeg zoveel ROIs mogelijk.
    8. In "Analyze > Set metingen", alleen "massamiddelpunt" controleren.
    9. Selecteer kanaalR, in de ROI-beheer, klik op "Meten" om te verkrijgen van de centra; twee kolommen overeenkomt aan de x- en y-coördinaat van de centra van ROIs getoond in het 'Resultaat'-venster. Kopieer en plak de twee kolommen in een werkblad.
    10. Herhaal stap 4.1.9 voor channelG - enB-kanaal.
    11. Regelen van de coördinaten van centra in een enkel werkblad in de volgende volgorde: xR,R, y xGenG, y xB, yB. Het werkblad in "*.csv" opslaan als "beads.csv". Laat geen ruimte in de bestandsnaam.
  2. Selecteer en meten Golgi mini-stacks
    1. Installeren twee macro's (bijgevoegd in Aanvullende materialen) in ImageJ, "Macro-Golgi ROI inspectie" en "Macro-Output 3 kanalen data" door Plugins > installeren ". Duidelijke ROI beheer en resultaatvenster.
    2. Een set van Golgi mini stack beelden, bestaande uit drie TIFF-bestanden openen (bestand > Afbeelding > Open).
    3. Herhaal stap 4.1.2 - 4.1.5 en de drie achtergrond-afgetrokken afbeeldingen voor later gebruik opslaan. Record de achtergrond SDs voor kanaalR, kanaalG en kanaalB als SDR, SDG en SDB, respectievelijk, voor later gebruik.
    4. Dupliceren van de drie achtergrond-afgetrokken afbeeldingen gegenereerd op basis van stap 4.2.3 (Ctrl + Shift + D).
    5. In "proces > afbeelding Calculator", eerst toevoegen de achtergrond-afgetrokkenG kanaal naar kanaalR afbeeldingen. De resulterende afbeelding toevoegen aan de achtergrond-afgetrokken kanaalB -afbeelding. Aan het resulterende beeld, in "afbeelding > aanpassen > drempel", selecteer "set" om input van "1" als "Laagste drempel". Na het drukken op "Apply", is een zwart-witprinter binaire image resulteerde.
    6. In "Analyze > analyseren deeltjes", de grootte van de ingangsbereik voor "grootte (pixel ^ 2)". Ingang "50-infinity". Controleren "Uitsluiting op randen" en "Toevoegen aan Manager". ROIs met Golgi mini-stacks worden nu toegevoegd aan de manager van de ROI.
      Opmerking: De groottewaaier moet empirisch worden bepaald uit te sluiten van geluiden die over het algemeen klein zijn.
    7. Samenvoegen van de drie achtergrond-afgetrokken afbeeldingen (afbeelding > Kleur > Kanalen verenigen) vanaf stap 4.2.3 door het selecteren van kanaalR als rood,G als groene kanaal en kanaalB blauw. Een enkele samengestelde afbeelding die bestaat uit drie kanalen wordt gegenereerd.
    8. Voer de macro "Macro-Golgi ROI inspectie" door het selecteren van "Plugins > Macro-Golgi ROI inspectie". In het dialoogvenster interactieve visueel inspecteren elk ROI te houden of af te wijzen. Selecteer ROIs die een enkel object in alle drie kanalen bevatten.
      Opmerking: Na het draaien van deze tool, afgewezen ROIs worden geëlimineerd van de manager van de ROI.
    9. Inchecken alleen "Gebied", "Gemiddelde grijswaarde" en "Massamiddelpunt" "Analyze > Set metingen". Verwerven van gegevens door de lancering van de macro-functie "Macro-3 kanalen uitvoergegevens" (Plugins > Macro-Output 3 kanalen gegevens).
      Opmerking: Gebieden, gemiddelde intensiteit en centers (x en y) van ROIs in kanaalR,G -kanaal en het kanaalB worden weergegeven in het venster "Resultaat".
    10. Kopie x en y coördinaten van centra in een spreadsheet en schik ze in de volgende volgorde: xR,R, y xGenG, y xB, yB. Sla het werkblad als een "CSV"-bestand (ministacks.csv). Laat geen ruimte in de bestandsnaam. Ga verder met chromatische-shift correctie van de centra (paragraaf 4.3) en LQ berekening (rubriek 4.4).
  3. Chromatische-shift correctie van centra
    1. Installeer Matlab Compiler Runtime (MCR).
    2. De volgende bestanden worden geïnstalleerd in een speciale map: my_train.exe en my_test.exe. Kopiëren en plakken van de "beads.csv" en"ministacksCSV"-bestanden in dezelfde map.
    3. Barkas "Troepenleiding Prompt" van Windows en ga naar de map door de volgende opdracht te typen " cd path_of_working_folder".
    4. Een chromatische-shift kalibratie-bestand genereren met behulp van de centra van de kralen. Typ de volgende opdracht "my_train.exe kralen.csv kalibratie.mat 1". Een bestand met de naam"kalibratie.mat" is gemaakt in de werkmap. Het negeren van andere bestanden die zijn gegenereerd.
    5. De chromatische-verschuiving van centra van Golgi mini-stacks corrigeren door de volgende opdracht "my_test.exe ministacksCSV corrected_ministacksCSV kalibratie.mat 1" te typen.
      Opmerking: Een bestand met de naam"corrected_ministacksCSV" is gemaakt in de werkmap. Het bevat de gecorrigeerde coördinaten chromatische-verschuiving van centra, die zijn gerangschikt in de volgorde van xG,G, y xB en yB. Het negeren van andere bestanden die worden gemaakt. Let op dat het rode kanaal wordt gedefinieerd als vrij van chromatische aberratie en daarom xR en yR zijn hetzelfde als onbewerkte gegevens.
  4. Berekening van LQs
    1. Starten van de software van de analyse van de gegevens en kopiëren en plakken, in de onderstaande volgorde, betekenen grijswaarden, gebieden, achtergrond SDs stap 4.2.3 verkregen (plaats ze op rij 1) en chromatische-shift gecorrigeerd x en y coördinaten van Golgi mini-stacks in kanaalR in een werkblad als kolommen A tot E. Ook bijbehorende gegevens overbrengen voor channelG en kanaalB naar kolommen F J en K naar O, respectievelijk.
    2. Acht nieuwe kolommen P toevoegen aan W, met de naam "geïntegreerde intensiteit van kanaal R", "geïntegreerde intensiteit van kanaal G", "geïntegreerde intensiteit van kanaal B", d1, dx, ABS(tan a), ABS (tan b) en LQ.
      1. Klik met de rechtermuisknop boven de desbetreffende kolom en selecteer "Kolomwaarden instellen" voor het berekenen van de waarden van elke kolom. Voor kolom input P, "Col(A)Col(B)"; voor kolom input Q, "Col(F)Col(G)"; voor kolom input R, "Col(K)Col(L)"; ingang voor kolom S, "pixel_size*Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))" waar "pixel_size" de grootte van de pixel in nm is; ingang voor kolom T, "pixel_size*((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2)/(2Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O)))"; ingang voor kolom U, "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2) / (2 Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) ";" ingang voor kolom V, "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2) / (2 Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) ";" voor kolom W, ingang "Col (T) / Col (S)".
    3. Het Golgi mini-stacks filteren op de drie criteria beschreven in de Introductie.
      1. In de software van de analyse van de gegevens, gaat u naar "werkblad > werkblad Query" en selecteer de kolom variabelen voor "If"-toets. De volgende aliassen I1, I2, I3, toewijzen d1, A en B voor kolommen "geïntegreerde intensiteit van kanaal R", "geïntegreerde intensiteit van kanaal G", "geïntegreerde intensiteit van kanaal B", d1, ABS(tan a) en ABS tan b, respectievelijk. In de "als voorwaarde" vak input "I1 > =30*cell(1,3) en I2 > =30*cell(1,8) en I3 > =30*cell(1,13) en d1 > = 70 en (A < = 0,3 of B < = 0.3)".
      2. Selecteer "Extraheren naar nieuw werkblad", klik op "Apply". Kolommen A-W van analyseren Golgi mini-stacks worden uitgepakt naar een nieuw werkblad.
    4. In het nieuwe werkblad, klik met de rechtermuisknop boven aan kolom W, selecteer "statistieken over kolom > dialoogvenster openen". Selectievakje "N totaal", "Gemiddelde", "SE van gemiddelde", "Histogrammen". De statistische analyse van LQs wordt vervolgens weergegeven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het moderne onderzoek rang lichte Microscoop uitgerust met een plan Apochromatische lens, zoals degene die zijn gebruikt in ons lab, toont minimale chromatische aberratie(Figuur 2). Echter, een zorgvuldig onderzoek van het beeld Multi-Color fluorescerende kraal kan onthullen de verschuiving van de afbeeldingen van de verschillende kleuren van de dezelfde Parel (Figuur 2B). We definiëren dat het r...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eerder, de lokalisatie van een Golgi-eiwit onder de lichte microscopie was voornamelijk gekwantificeerd door de mate van correlatie of samenloop van het imago van het eiwit met de afbeelding van een Golgi-marker van bekende lokalisatie15,16, 17. De resulterende correlatie of overlappende coëfficiënt komt overeen met hoe dicht het testen eiwit is naar het Golgi-marker ruimtelijk. Er zijn ten minste drie waarschuwingen voor deze ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedank D. Stephens (Universiteit van Bristol, Bristol, Verenigd Koninkrijk) voor de TPST1-EGFP DNA plasmide, evenals Lakshmi Narasimhan Govindarajan voor het helpen met de optimalisatie van de software. Dit werk werd gesteund door subsidies van de nationale Medical Research Council (NMRC/CBRG/007/2012), ministerie van onderwijs (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 en RG132/15 en AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) voor de L.L.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
fluorescence beads. Commerciële naam: TetraSpeck beadsInvitrogenT7279Als meerkleurige beads om de chromatische verschuiving van de microscoop te kalibreren
Glazen dekglas Φ 12 mm (Nr. 1.5)MenzelCB00120RAC
Glazen dekglas Φ 25 mm (Nr. 1.5)Menzel
DMEMCapriconDMEM-HPA-P50
Trypsine-EDTA
FBSGE HycloneSV30160.03
NocodazolMerck487928
transfectie reagens. Commerciële naam: Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019
transfectie medium. Commerciële naam: OptiMEMInvitrogen31985070
TPST1-EGFPAddgene66617Een geschenk van D. Stephens (University of Bristol, Bristol, Verenigd Koninkrijk)
GalT-mCherryGemaakt in ons lab
paraformaldehydeMerck1.04005.1000
saponineSigma-Aldrich47036
poly(vinyl alcohol) (Mw ~31.000). Commerciële naam: Mowiol-488CALBIOCHEM475904
BSASigma-AldrichA9647
Muis anti-GM130BD Biosciences610823Primaire antilichaam voor humaan GM130
Ver-rood fluorescent geconjugeerd geiten anti-muis IgG. Commerciële naam: Alexa Fluor 647 geconjugeerd geiten anti-muis IgGInvitrogenA-21235Ver-rood fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Glick, B. S., Luini, A. Models for Golgi traffic: a critical assessment. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005215(2011).
  2. Klumperman, J. Architecture of the mammalian Golgi. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
  3. Lu, L., Hong, W. From endosomes to the trans-Golgi network. Semin Cell Dev Biol. , (2014).
  4. De Matteis, M. A., Luini, A. Exiting the Golgi complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 273-284 (2008).
  5. Lu, L., Ladinsky, M. S., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Mol Biol Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).
  6. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).
  7. Tie, H. C., et al. A novel imaging method for quantitative Golgi localization reveals differential intra-Golgi trafficking of secretory cargoes. Mol Biol Cell. 27 (5), 848-861 (2016).
  8. Trucco, A., et al. Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments. Nat Cell Biol. 6 (11), 1071-1081 (2004).
  9. Cole, N. B., Sciaky, N., Marotta, A., Song, J., Lippincott-Schwartz, J. Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites. Mol Biol Cell. 7 (4), 631-650 (1996).
  10. Rogalski, A. A., Bergmann, J. E., Singer, S. J. Effect of microtubule assembly status on the intracellular processing and surface expression of an integral protein of the plasma membrane. J Cell Biol. 99 (3), 1101-1109 (1984).
  11. Van De Moortele, S., Picart, R., Tixier-Vidal, A., Tougard, C. Nocodazole and taxol affect subcellular compartments but not secretory activity of GH3B6 prolactin cells. Eur J Cell Biol. 60 (2), 217-227 (1993).
  12. Nakamura, N., et al. Characterization of a cis-Golgi matrix protein, GM130. J Cell Biol. 131, 6 Pt 2 1715-1726 (1995).
  13. Roth, J., Berger, E. G. Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae. J Cell Biol. 93 (1), 223-229 (1982).
  14. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. J Cell Biol. 105 (6), Pt 1 2655-2664 (1987).
  15. Honda, A., Al-Awar, O. S., Hay, J. C., Donaldson, J. G. Targeting of Arf-1 to the early Golgi by membrin, an ER-Golgi SNARE. J Cell Biol. 168 (7), 1039-1051 (2005).
  16. Lavieu, G., Zheng, H., Rothman, J. E. Stapled Golgi cisternae remain in place as cargo passes through the stack. Elife. 2, 00558(2013).
  17. Zhao, X., Lasell, T. K., Melancon, P. Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic. Mol Biol Cell. 13 (1), 119-133 (2002).
  18. Dejgaard, S. Y., Murshid, A., Dee, K. M., Presley, J. F. Confocal microscopy-based linescan methodologies for intra-Golgi localization of proteins. J Histochem Cytochem. 55 (7), 709-719 (2007).
  19. Fourriere, L., Divoux, S., Roceri, M., Perez, F., Boncompain, G. Microtubule-independent secretion requires functional maturation of Golgi elements. J Cell Sci. 129 (17), 3238-3250 (2016).
  20. Volchuk, A., et al. Countercurrent distribution of two distinct SNARE complexes mediating transport within the Golgi stack. Mol Biol Cell. 15 (4), 1506-1518 (2004).
  21. Popoff, V., Adolf, F., Brugger, B., Wieland, F. COPI budding within the Golgi stack. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005231(2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lokalisatie van Golgi eiwittenGLIM methodefluorescentiebeeldvormingchromatische verschuivingscorrectieanalyse van het massamiddelpuntGolgi mini stackslokalisatiequoti ntwide field microscopieconfocale microscopieprotocol voor beeldanalyse

Gerelateerde artikelen